CAPTULO 2.3.11.

PULOROSIS Y TIFOSIS AVIAR

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La pulorosis de los pollos est causada por Salmonella enterica subspecie enterica serovariedad Gallinarum biotipo Pullorum (Salmonella Pullorum)1. En este momento la serovariedad se denomina Gallinarum en algunas partes del mundo y Pullorum en otras; en este captulo la serovariedad se denominar Gallinarum o Pullorum segn el biotipo que se discuta. En su forma aguda, la pulorosis es una enfermedad septicmica prcticamente exclusiva de los polluelos. Sin embargo, el microorganismo tambin se puede asociar con la enfermedad en pavipollos y puede padecerse subclnicamente o puede originar la disminucin de la produccin de huevos en la incubacin junto con una variedad de signos atpicos en las aves adultas. La transmisin ovrica es la va principal de propagacin de este microorganismo. Las aves de caza y las de corrales de particulares pueden actuar como reservorios de la infeccin mientras que las aves silvestres pueden funcionar como vectores del microorganismo y, como tales, son importantes en la epidemiologa de la enfermedad. La tifosis aviar en pollos y pavos est causada por S. Gallinarum, biovar Gallinarum, y se observa con mayor frecuencia en el final del perodo de crecimiento y en los grupos de aves adultas. A menudo la enfermedad se caracteriza por una rpida propagacin con morbilidad alta y mortalidad aguda o subaguda. Las garrapatas rojas pueden estar involucradas en la transmisin de la enfermedad y su persistencia en granjas de aves de corral. En el captulo 2.9.9 de este Manual de animales terrestres se trata la salmonelosis causada por Salmonella bongori o por otras subespecies de Salmonella enterica. Descripcin de la enfermedad: Los signos clnicos en polluelos y pavos jvenes comprenden anorexia, diarrea, deshidratacin, debilidad y muerte. En las aves adultas la pulorosis es menos severa, pero puede tener lugar una produccin reducida de huevos, una eclosin escasa y algn incremento en la mortalidad. La tifosis de las aves de corral cursa con una septicmia ms aguda que afecta principalmente a las aves adultas y puede ser particularmente severa en bandadas de ponedoras comerciales. Identificacin del agente: Las muestras no se deberan tomar a partir de aves o huevos que se hayan tratado recientemente con antimicrobianos. Para las pruebas de diagnstico, deben utilizarse frotis o muestras recogidas de forma asptica a partir de los tejidos infectados o de los contenidos intestinales y cloacales. Otros materiales que se pueden utilizar como muestras son: huevos, embriones, excrementos y restos de la incubacin, especialmente las pelusas, el polvo y las cscaras rotas y los revestimientos protectores del pollo. Las muestras de tejidos tales como las tonsilas cecales y el bazo procedentes de las aves infectadas son preferibles a las muestras fecales y medioambientales. Se deberan inocular las muestras de tejido en un caldo de enriquecimiento selectivo y no selectivo y en un agar selectivo, como el agar verde brillante, tan pronto como sea posible despus de recoger las muestras. En el caso de que se produzca un retraso, las muestras se deberan conservar a 4C. Se pueden identificar las colonias tpicas mediante pruebas serolgicas y bioqumicas. Pruebas serolgicas: Estas pruebas son adecuadas para establecer la presencia y estimar la prevalencia de la infeccin en un grupo de aves. La prueba utilizada en el campo es la prueba rpida de aglutinacin en placa de sangre ntegra. Esta prueba no es fiable en pavos y patos dado

Vase la nota en el captulo 2.9.9. Salmonelosis, para conocer los principios seguidos concernientes a la nomenclatura de Salmonella.

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que muchas aves no infectadas pueden dar reacciones positivas. En el laboratorio se emplea una prueba de aglutinacin de suero, como ensayo rpido en placa o como ensayo en tubo. Se pueden aplicar como pruebas de macro- o microaglutinacin, aunque es ms probable que esta ltima pueda dar resultados positivos falsos con los sueros de pavo. En cualquier animal que d reaccin positiva se debera confirmar la infeccin mediante un cultivo en un examen post mrtem. Se han descrito tcnicas de enzimoinmunoensayo pero no se dispone de ellos comercialmente. La utilizacin de vacunas para controlar las infecciones de S. Enteritidis en pollos puede causar problemas en la interpretacin de los resultados serolgicos. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En algunos pases se dispone de vacunas vivas e inactivadas para la tifosis aviar. La vacuna ms comnmente utilizada es una vacuna viva derivada de la cepa estable y rugosa de S. Gallinarum denominada 9R.

A. INTRODUCCIN
La tifosis y pulorosis aviar, causadas por Salmonella enterica, subespecie enterica, serovariedad Gallinarum y biotipos Gallinarum y Pullorum, respectivamente, se encuentran distribuidas ampliamente por todo el mundo, pero se han erradicado de las aves comerciales en muchos pases desarrollados de Europa occidental, EE.UU., Canad, Australia y Japn. En los Estados Unidos y en el Reino Unido la serovariedad se denomina Pullorum (8); en este captulo se utilizarn los trminos serovariedades Gallinarum y Pullorum. Sin embargo, S. Gallinarum ha vuelto a ocurrir recientemente en algunos pases europeos (18). Salmonella Pullorum persiste en las aves silvestres y de caza. Salmonella Gallinarum y S. Pullorum estn adaptadas para parasitar especies aviares y se considera que representan un riesgo zoonsico mnimo (19), aunque el genoma est evolucionando continuamente, lo que en teora podra ampliar el campo de accin del hospedador en el futuro (12). En el captulo 2.9.9 de este Manual de animales terrestres se trata la salmonelosis causada por Salmonella bongori o por otras subespecies de Salmonella enterica. Los signos clnicos son los tpicos de una condicin septicmica en las aves de corral y supone el incremento de la mortalidad y la reduccin de la calidad de los polluelos eclosionados a partir de los huevos infectados. Las aves mayores muestran signos de anemia, depresin, dificultad respiratoria y diarrea que causa adherencia de las heces en la cloaca. La mortalidad ms alta tiene lugar en aves de 23 semanas de edad. La enfermedad en las aves mayores puede ser leve o inapreciable. En los planteles la eclosin y produccin reducidas de huevos pueden ser los nicos signos, mientras que la infeccin transovrica que provoca la infeccin de los huevos y de los pollos o pavos eclosionados es una de las ms importantes vas de transmisin de la enfermedad. Los signos post mrtem de la pulorosis en los polluelos recin eclosionados son peritonitis acompaada de la congestin generalizada de los tejidos y la inflamacin del saco vitelino no absorbido. Las infecciones ms duraderas conducen generalmente a tiflitis con desarrollo de proyecciones cecales necrticas y pequeos focos necrticos en el hgado, los pulmones y otras vsceras. Las pequeas lesiones en el hgado y en el bazo de aves infectadas por Pullorum pueden presentar una apariencia de puntos blancos que no se observan en las infectadas por Gallinarum; sin embargo, esta lesin no es patognomnica. Estas Salmonella tienen una escasa colonizacin y la supervivencia en el tracto intestinal a menudo es indicativa de los estadios posteriores de la enfermedad clnica. Las aves adultas pueden desarrollar ovarios deformados y reducidos con folculos adheridos por tallos fibrosos pedunculados. Las cepas variantes de S. Pullorum generalmente no causan enfermedad clnica o pueden ocasionar sntomas leves no especficos, pero pueden ocasionar seroconversin.

En el caso de la tifosis aviar, adems de signos generalizados de septicemia, se observa que el hgado est habitualmente agrandado, oscuro y fragmentado, con un peculiar brillo bronceado-cobrizo que slo puede desarrollarse despus de la exposicin al aire. Frecuentemente, la mdula sea presenta tambin un color marrn oscuro. Aunque los signos clnicos y los exmenes post mrtem de la pulorosis y la tifosis aviar pueden ser muy sugerentes de ambas condiciones, no son lo bastante diferentes de otras causas de septicemia como para considerarlos patognomnicos. Por tanto, es necesario confirmar la enfermedad aislando los microorganismos. Se pueden establecer pruebas serolgicas para determinar la presencia de las bacterias causantes de la enfermedad en un grupo de aves.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
En su forma aguda, la pulorosis es una enfermedad prcticamente exclusiva de los polluelos y el agente se puede recuperar a partir de casi todos los rganos, los tejidos y las heces. En las aves mayores que tambin

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llegan a ser portadoras, S. Pullorum se asla sobre todo a partir de los vulos y del oviducto; y slo ocasionalmente de otros rganos y tejidos, incluyendo el tracto digestivo. En la fase aguda de la tifosis aviar el microorganismo se encuentra tambin ampliamente distribuido, pero en las aves portadoras, est presente en mayor medida en el hgado, en el bazo, y en el tracto reproductor, y ocasionalmente en el ciego.

Cultivo

Salmonella Pullorum y S. Gallinarum pertenecen al serogrupo D del esquema de KauffmannWhite, junto con S. Enteritidis, del que se piensa que est estrechamente relacionado. Los organismos son bacilos Gram negativos no esporognicos de 1,02,5 m de longitud y 0,31,5 m de anchura. Se consideran inmviles bajo condiciones normales pero se ha demostrado que las protenas flagelares se inducen y presentan movilidad en algunas cepas de S. Pullorum cuando crecen en un medio especial (9). Para una recuperacin ptima de los organismos, las aves de las cuales se han obtenido las muestras, no se deberan tratar con drogas antimicrobianas durante aproximadamente las 23 semanas previas. Se pueden obtener muestras a partir de las aves vivas, preferiblemente despus de la identificacin de las aves muy seropositivas. Tambin se pueden utilizar canales frescas o recin refrigeradas, materiales del huevo, heces recientes, o cualquier material contaminado procedente de los albergues, incubadoras o cajas de transporte. Las muestras se pueden tomar con hisopo a partir de la cloaca de las aves vivas. Son preferibles las muestras procedentes de tejidos visiblemente anormales a las muestras fecales o medioambientales. Se pueden tomar muestras de forma asptica a partir del bazo, el hgado, la vescula biliar, los riones, los pulmones, el corazn, los vulos, los testculos, el tracto digestivo o las lesiones de las articulaciones. La superficie se quema con una esptula caliente y se obtiene una muestra insertando un hisopo de algodn estril o un asa de cultivo estril a travs de la superficie esterilizada por calor. La demostracin de la infeccin en aves sero-reactivas de apariencia normal puede requerir en algunos casos el cultivo de volmenes grandes de tejidos homogeneizados adems de la toma directa de muestras con hisopo. Se pueden preparar conjuntos de tejidos a partir de los tejidos recogidos procedentes de varias aves. Cuando se analicen residuos del suelo o material fecal, se debera recordar que S. Pullorum y S. Gallinarum son ms difciles de aislar a partir de muestras fecales y medioambientales que otras salmoneras y siempre es preferible cultivar a partir de aves enfermas o recin muertas. Las muestras medioambientales pueden incluir frotis de calzas o botas, heces del suelo, residuos hmedos y secos y muestras tomadas con hisopo procedentes de los bebederos abiertos. Las garrapatas rojas asociadas con las aves de corral que estn infectadas con S. Gallinarum, generalmente contienen el microorganismo despus de la ingestin y pueden cultivarse. Estas muestras se deberan cultivar mediante inoculacin directa de un caldo de enriquecimiento selectivo, tal como selenito-cistena, seguido de la siembra en placa en medios selectivos, como el agar verde brillante (17). Tanto S. Pullorum como S. Gallinarum se desarrollan bien en medios no selectivos, pero se han descrito medios selectivos y de enriquecimiento que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de organismos extraos. Salmonella Pullorum puede crecer lentamente y producir colonias muy pequeas en los medios selectivos, as que se recomienda la incubacin en placas durante 48 horas. La eficacia de recuperacin de Salmonella vara de acuerdo a las circunstancias y, adems, la experiencia en el uso de un determinado medio es un factor importante pero no cuantificable. Algunos medios complejos pueden tener un efecto inhibidor sobre estos microorganismos; por este motivo se aconseja utilizar tanto los medios selectivos como los no selectivos para el aislamiento a partir de tejidos. Se pueden emplear medios slidos y caldos de cultivo. Como las propiedades txicas de los medios selectivos pueden variar, es preferible controlar estas comparando el crecimiento de cultivos control en ambos tipos de medio. En los medios inhibidores deberan crecer al menos el 75% de las colonias de las correspondientes a las que crecen en un medio no inhibidor (3, 4, 7, 13). Todos los medios indicados ms adelante son ejemplos de los medios de uso comn, pero existen muchos otros cuyo empleo puede ser igualmente satisfactorio. Los medios no inhibidores incluyen agar nutritivo y agar sangre, en los que se observa que las colonias son suaves, traslcidas, ligeramente elevadas y aproximadamente de unos 12 mm de dimetro. Salmonella Gallinarum crece ms rpidamente que S. Pullorum y produce extensas colonias con un olor peculiar semejante al del lquido seminal en la mayora de medios. Los caldos incluyen agua de peptona tamponada y caldos nutritivos e infusin de carne o caldos universales de pre-enriquecimiento.

Medios selectivos:
Agar MacConkey: Este medio inhibe el desarrollo de los microorganismos no entricos, diferencia a los fermentadores de la lactosa (colonias de color rosa) de los no fermentadores de la lactosa (colonias sin color). Se omite el NaCl para limitar la extensin de las colonias de Proteus. Las colonias de Salmonella son lisas e incoloras. Salmonella Pullorum produce colonias ms pequeas que otras salmonelas. El agar MacConkey es el idneo para sembrar placas directamente a partir de los tejidos.

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Agar xilosa-lisina-desoxicolato: Este medio inhibe el desarrollo de los microorganismos no entricos. Salmonella Pullorum crece escasamente formando colonias pequeas de color rojo transparente. Las colonias de S. Gallinarum son pequeas, abombadas y pueden tener una mancha negra central debida a la produccin de H2S, pero esta reaccin puede aparecer ms tarde o ser variable. Agar verde brillante (BGA): Este medio inhibe el desarrollo de los coliformes y de la mayora de cepas de Proteus; es til para distinguir las colonias de los microorganismos entricos. Las salmonelas forman colonias pequeas, convexas, traslcidas, de color rojo plido y de 13 mm de dimetro, similares a Citrobacter. Proteus forma colonias insignificantes, Pseudomonas aeruginosa aparece formando colonias rojas pequeas y los fermentadores de lactosa son verdes. Salmonella Pullorum produce colonias plidas ms pequeas que otras salmonelas. El medio BGA es el medio de eleccin despus del enriquecimiento. Agar verde brillante-sulfapiridina: Este medio inhibe el desarrollo de los coliformes y de las cepas de Proteus. Se aade sulfapiridina para estabilizar selectivamente en presencia de los integrantes del huevo. Salmonella Pullorum produce colonias pequeas. Salmonella Pullorum y Gallinarum crecen escasamente y no producen colonias tpicas en medios slidos cromognicos ms recientes, tales como el agar Rambach.

Medios lquidos de enriquecimiento y selectivos:

Caldo selenito F: Inhibe el desarrollo de los coliformes pero no el de Proteus y mejora si se le aade verde brillante. Pierde su actividad despus de 24 horas. El caldo selenito-cistena es ms estable. Aunque los caldos con selenito se consideran los preferidos para aislar S. Pullorum y S. Gallinarum a partir de heces, en el caso de que en los laboratorios particulares existan problemas de toxicidad o dificultades con el periodo de validez, se pueden utilizar otros caldos de enriquecimiento que se indican a continuacin. Sin embargo, la mayora de estos otros caldos se utilizarn despus de una etapa de enriquecimiento no selectivo y S. Gallinarum y S. Pullorum crecen fcilmente y en exceso en cultivos fecales no selectivos debido a los microorganismos competidores, dando como resultado pruebas negativas falsas. Por tanto, se recomienda el enriquecimiento selectivo directo para las heces y para las muestras intestinales o medioambientales. El enriquecimiento no selectivo puede dar mejores resultados en tejidos obtenidos post mrtem de forma asptica, circunstancia en la que no debera haber microorganismos competidores (16). Tetrationato/caldo verde brillante: Inhibe el desarrollo de los coliformes y de Proteus, pero tambin puede inhibir algunas cepas de S. Pullorum/Gallinarum. Caldo peptona soja RappaportVassiliadis (RVS): Para el enriquecimiento selectivo despus de un preenriquecimiento, se usa 1 parte de inculo por cada 100 partes de medio. Es ms probable que tanto Salmonella Pullorum como Gallinarum sean superadas por el desarrollo de otros microorganismos durante el pre-enriquecimiento de heces o contenidos intestinales que lo sean por otras salmonelas que no estn adaptadas al hospedador, as que tambin se puede intentar el enriquecimiento con RVS.

Recuperacin de salmonelas

Los mtodos de recuperacin de S. Pullorum y S. Gallinarum varan de acuerdo con el origen de las muestras. Si bien su aislamiento puede ser infructuoso a partir de muestras cloacales y heces, normalmente se tiene ms xito en el examen post mrtem de los tejidos. Los mtodos se indican a continuacin: Muestras cloacales y heces recientes a partir de aves vivas: Es adecuado emplear hisopos para sumergir las muestras en caldo nutritivo y, en el caso de los polluelos, se utilizan hisopos pequeos. Los hisopos se utilizan para sembrar por estra sobre medios selectivos y se colocan en caldo de enriquecimiento. Las placas y los caldos se incuban a 37C. A esta temperatura, algunos microorganismos del gnero Proteus y Pseudomonas tienden a ser inhibidos con respecto a Salmonella. Se pueden emplear temperaturas ms altas con algunos caldos, p. ej. 41,5C para el medio RappaportVassiliadis (RV), pero es necesario tener cuidado porque algunos medios de enriquecimiento pueden ser demasiado inhibidores a temperaturas altas y el caldo RV es ms inhibidor que el caldo selenito-cistena para S. Pullorum y S. Gallinarum. Se realizan subcultivos empleando medios selectivos despus de 24 y 48 horas. Contenidos de la vesicular biliar: Se toman muestras con hisopo de los contenidos de la vesicular biliar y se siembran por estra en medios slidos selectivos y no selectivos y en caldos inhibidores y no inhibidores; a continuacin se incuban a 37C y se subcultivan en agar selectivo despus de 24 y 48 horas. rganos y tejidos: Se toman de manera asptica muestras con hisopo o segmentos de tejidos a partir de tejidos individuales y de lesiones y se cultivan en medios selectivos y no selectivos y en caldos similares selectivos y no

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selectivos. Se incuban a 37C y se subcultivan en agar selectivo despus de 24 y 48 horas. El material intestinal en los caldos selectivos se puede incubar a 40C; S. gallinarum crece bien pero a esta temperatura puede haber alguna inhibicin de S. Pullorum. Aves portadoras: Pueden requerirse cantidades mayores de material para identificar las aves portadoras. El ovario y el oviducto son los tejidos idneos para el desarrollo de S. Pullorum, y se debera analizar el hgado y la vescula biliar, as como el ovario y el oviducto, en el caso de S. Gallinarum. Normalmente en la prctica es mejor juntar las muestras procedentes de una variedad de tejidos, incluido el bazo. Los tejidos se homogeneizan en un volumen pequeo de caldo y se siembran directamente en placa. Tambin se aaden aproximadamente 10 ml del homogeneizado a 100 ml de caldo de enriquecimiento no selectivo (p. ej. agua de peptona tamponada) y de caldo de enriquecimiento selectivo (p. ej. caldo selenito-cistena o caldo verde brillante) y se incuban a 37C. Estos caldos se subcultivan en agar selectivo y no selectivo despus de 24 horas. Conducto alimentario, incluyendo las tonsilas cecales y los contenidos intestinales: Despus de triturar u homogeneizar en un volumen pequeo de caldo, se incuban 10 ml del homogeneizado en 100 ml de caldo de enriquecimiento selectivo a 37C. En general se consigue un aislamiento mejor empleando eI caldo selenitocistena. Cscaras de huevo: Se colocan las cscaras rotas en un volumen diez veces superior de caldo de enriquecimiento (p. ej. caldo selenito-cistena). El caldo se incuba a 37C y se subcultiva en agar selectivo despus de 24 y 48 horas. Contenidos del huevo: Se toman los contenidos de los huevos frescos en condiciones aspticas y se homogeneizan y mezclan con 200 ml de agua de peptona tamponada o caldo nutritivo, se incuban a 37C, y se subcultivan en agar selectivo y no selectivo despus de 24 y 48 horas. Los huevos se incuban y sean infrtiles o contengan embriones pequeos, se pueden tratar de manera similar. Embriones: Las vsceras homogeneizadas y las muestras tomadas con hisopo procedentes de los sacos vitelinos de los embriones bien desarrollados se pueden extender en estra en medios selectivos y no selectivos y adems se introduce una muestra en 10 ml de un caldo no selectivo as como de un medio de enriquecimiento (p. ej. caldo selenito-cistena o caldo verde brillante). La incubacin se lleva a cabo a 37C, y los subcultivos se realizan en medios solidificados selectivos y no selectivos despus de 24 y 48 horas. Muestras medioambientales: Estas muestras incluyen la pelusa de los polluelos eclosionados, las muestras de restos y de huevos destruidos y desechos de polluelos y las muestras de las capas protectoras de los polluelos, y de los residuos o las heces del suelo; se mezclan 25 g con 225 ml de caldo de enriquecimiento (p. ej. caldo selenito-cistena, caldo verde brillante), se incuban a 37C, y se subcultivan en agar selectivo despus de 24 y 48 horas. Tambin pueden utilizarse pruebas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), pero no han sido completamente validadas internacionalmente (15).

1.

Identificacin del agente

Las colonias tpicas de S. Gallinarum en medio no selectivo son redondas, traslcidas, abombadas lisas y con 1 2 mm de dimetro despus de 2448 horas de incubacin. Las colonias de Salmonella Pullorum son ligeramente ms pequeas y traslcidas. En los medios selectivos su apariencia vara con el medio, pero las colonias sospechosas se pueden investigar mediante pruebas serolgicas demostrando la presencia de los antgenos somticos O 9, observando la movilidad y mediante pruebas bioqumicas. Despus de una incubacin de 2024 horas, se deben examinar cuidadosamente las placas para observar la presencia de las colonias tpicas de S. Pullorum y S. Gallinarum. Si despus de 24 horas de incubacin el crecimiento es escaso, se deberan reincubar las placas durante otras 24 horas y examinarlas de nuevo. Para la confirmacin bioqumica y serolgica, se deberan elegir de cada placa cinco colonias tpicas para su posterior examen. Si hay menos de cinco colonias tpicas o sospechosas, se deberan tomar todas las que haya para su posterior examen. Las colonias seleccionadas se deberan extender en estra sobre la superficie de agar selectivo, de una manera que permita el desarrollo separado de las colonias. Para la confirmacin bioqumica, se deberan utilizar slo cultivos puros procedentes de medios no selectivos. Los medios siguientes se deberan extender por estra utilizando un asa de inoculacin: agar triple azcar-hierro (TSI); agar lisina-hierro (o medio de descarboxilacin de l-lisina); agar urea de Christensen; medio triptona/triptfano para la reaccin del indol; medio con glucosa y una campana de Durham para detectar la produccin de cido y gas; medio con dulcitol, medio con maltosa, medio de descarboxilacin de ornitina y medio semislido para comprobar la movilidad. El resultado de las reacciones se indica en el cuadro 1.

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Se dispone comercialmente de kits de identificacin; por ejemplo el sistema Analytical Profile Index (API) para Enterobacteriaceae. Sin embargo, se debe tener cuidado cuando se utiliza el sistema API porque S. Pullorum se puede identificar de modo incorrecto como Hafnia spp. Se han desarrollado en laboratorios de investigacin ensayos moleculares que emplean tcnicas de ribotipificacin y la PCR (10), pero generalmente no se dispone de ellas para las pruebas de confirmacin de S. Gallinarum Y S. Pullorum. Para confirmar los serogrupos mediante pruebas serolgicas, se utilizan colonias procedentes de medios no selectivos (agar nutritivo o agar sangre). La primera fase consiste en la eliminacin de las cepas autoaglutinables. Para ello, el material procedente de una colonia aislada de un cultivo puro se transfiere a un porta y se mezcla con una gota de solucin salina estril. Se sacude suavemente el porta o se extiende la gota con un asa durante 3060 segundos y se observa si se produce aglutinacin contrastndolo con un fondo oscuro, preferiblemente con la ayuda de una lupa o un microscopio de diseccin. Si la bacteria se agrega formando grupos ms o menos evidentes, la cepa se considerar autoaglutinable y no se le debe someter a las pruebas siguientes. Si la muestra bacteriana se reconoce como no autoaglutinable, se ensaya con un antisuero polivalente O (AG). Con este fin, el material procedente de una colonia aislada se dispersa en la gota de antisuero polivalente O sobre un porta para obtener una suspensin homognea y turbia. Despus de un movimiento ligero durante 3060 segundos, la reaccin se observa frente a un fondo oscuro para detectar la posible aglutinacin. Alternativamente, la prueba de aglutinacin en porta se puede llevar a cabo con volmenes ms pequeos de suspensin bajo un microscopio de diseccin. En este caso una porcin de la colonia que se va a analizar se aade a un asa llena de solucin salina sobre un porta para conseguir una suspensin ligera de tal modo que se pueda detectar la posible autoaglutinacin (cepas rugosas). Si no se produce aglutinacin, se aaden una o dos asas de antisueros, se extienden las gotas con un asa y se observa si hay aglutinacin. Salmonella Pullorum y S. Gallinarum deberan aglutinar con los antisueros polivalentes O pero no con los antisueros polivalentes flagelares (poli H tipo 1 y tipo 2). Si la reaccin es positiva, la colonia individual se prueba despus de la misma manera empleando suero especfico de grupo dirigido contra los serotipos de S. Pullorum y S. Gallinarum (antisuero O 9). Despus de establecer el serogrupo los aislamientos se pueden enviar a un laboratorio de referencia para su serotipificacin. Cuadro 1. Investigacin bioqumica de Salmonella Pullorum y S. Gallinarum
Salmonella Pullorum TSI glucosa (produccin de cidos) TSI glucosa (produccin de gas) TSI lactosa TSI sacarosa TSI sulfuro de hidrgeno Gas a partir de glucosa (medio con campana de Durham) Hidrlisis de urea Descarboxilacin de lisina Descarboxilacin de ornitina Fermentacin de maltosa Dulcitol Movilidad + V V + + + o ms tarde + Salmonella Gallinarum + V + + +

= reaccin positiva del 90% o ms en 1 o 2 das; = reaccin negativa (90% o ms); v = reacciones variables.

Tambin es posible confirmar y diferenciar S. Gallinarum mediante PCR especfico (18).

Procedimiento de la prueba del cultivo de muestras viscerales, fecales, intestinales y medioambientales de S. Pullorum y S. Gallinarum
i) ii) iii) Siempre que se pueda, se comienzan los procedimientos de laboratorio el mismo da de recogida de muestras. El material se homogeneiza tanto como sea posible mediante la mezcla manual, maceracin suave o con un homogeneizador en un volumen pequeo de solucin salina estril si se trata de material seco. Se extiende la mezcla con un hisopo rectal pequeo o un asa y se hacen unas estras gruesas sobre un cuarto de la superficie de una placa de agar verde brillante. (Tambin se pueden extender sobre medio agar sangre las muestras tomadas con hisopo a partir de tejidos no contaminados). Empleando esta cantidad de material depositado en la placa, se extiende sobre el resto de la misma para obtener colonias individuales.

iv)

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v)

Se aaden 525 g de la muestra homogeneizada a caldo selenito-cistena recin preparado (vase nota ms arriba a cerca de los medios lquidos de enriquecimiento y selectivos) para conseguir una relacin de 1:10 de muestra respecto a caldo. Se extiende o se agita la muestra para dispersarla en el caldo. Se incuban las placas de agar verde brillante y el caldo selenito-cistena a 37C durante 24 horas. Se examina la placa despus de 24 horas de cultivo. Se llevan a cabo las pruebas de aglutinacin de hasta cinco colonias sospechosas con antisueros polivalentes O (A-G) y antisueros polivalentes H (tipo 1 y tipo 2). Si la aglutinacin no es clara se subcultivan las colonias sospechosas en agar nutritivo o en agar sangre y los ensayos se repiten despus de una incubacin de 24 horas de estos medios.

vi) vii)

viii) Si la prueba con antisueros poli O da positivo, entonces se ensaya con el antisuero O9. Si este ltimo da positivo y el poli H da negativo, esto indica la posible presencia de S. Pullorum o S. Gallinarum. ix) Si no hay colonias positivas en la placa de agar verde brillante, se toma con un asa y se extienden unos 10 l del cultivo incubado en caldo selenito-cistena sobre agar verde brillante, como se indica ms arriba en el paso (iv). Se incuban las placas de agar verde brillante a 37C durante 24 horas y se reincuban los caldos selenito-cistena y las placas de agar verde brillante previos (negativos) durante otras 24 horas ms. Se repite el examen de las placas como se indica ms arriba en el paso (vii). Si las placas son todava negativas, se vuelve a sembrar en placa a partir del caldo selenito-cistena y se incuba en placas de agar verde brillante, que fue inoculado en el paso (ix), durante otras 24 horas ms y se examinan como se indica ms arriba en el paso (vii).

xi) xi) xii)

xiii) Para confirmar la presencia de S. Pullorum y S. Gallinarum, se emplean pruebas bioqumicas como las indicadas en el cuadro 1. Los aislamientos se pueden enviar a un laboratorio de referencia de Salmonella para confirmar el serotipo y poder realizar la fagotipificacin de S. Pullorum.

Epidemiologa molecular
Las tcnicas moleculares estndar de huellas dactilares empleadas para Salmonella, tal como el anlisis de los perfiles de los plsmidos, la electroforesis en gel de campo pulsado o la ribotipificacin, se pueden utilizar para investigar los brotes de S. Pullorum o S. Gallinarum. Con frecuencia es necesario utilizar combinaciones de tales mtodos para obtener una discriminacin mxima.

2.

Pruebas serolgicas

Las pruebas serolgicas se aplican mejor como pruebas de grupo, porque los resultados obtenidos a partir de aves individuales variarn en funcin de la etapa de infeccin. Por tanto, es necesario tomar suficientes muestras individuales para determinar la infeccin de un grupo de aves. El nmero de muestras depender de la prevalencia esperada y del nivel de confianza deseado (vase el captulo 1.1.1). Si la prueba se utiliza para detectar aves infectadas individuales con el fin de sacrificarlas selectivamente, se debera repetir al menos dos veces y preferiblemente hasta que el grupo de aves completo haya dado al menos dos resultados negativos. Las pruebas fciles de aplicar comprenden la aglutinacin rpida de sangre ntegra, la aglutinacin rpida de suero (RST), la aglutinacin en tubo y la micro-aglutinacin (21). Otras especies invasivas de Salmonella, tales como S. Enteritidis y S. Typhimurium pueden dar resultados falsos positivos en las pruebas serolgicas destinadas a detectar S. Pullorum. Tanto S. Pullorum como S. Gallinarum poseen los antgenos O9 y O12 y tambin pueden poseer el antgeno O1. Sin embargo, en el caso de S. Pullorum, hay una variacin en la relacin de 121, 122 y 123; la cepa estndar contiene ms 123 que 122, mientras que sucede lo contrario con la forma variante. Tambin existen formas intermedias. (Parece que no existe tal variacin de formas en el caso de S. Gallinarum). Debido a esta variacin, es necesario utilizar un antgeno polivalente en las pruebas de inmunodiagnstico. El mismo antgeno se utiliza para detectar S. Pullorum y S. Gallinarum, pero la deteccin de este ltimo puede ser relativamente pobre (17).

a)

Prueba rpida de aglutinacin de sangre entera

La prueba rpida de aglutinacin de sangre entera se puede utilizar en condiciones de campo para detectar tanto S. Pullorum como S. Gallinarum, y las aves que reaccionan a la prueba se pueden identificar de forma inmediata. Sin embargo, esta prueba no es fiable en el caso de los pavos, ya que se obtiene una proporcin significativa de resultados positivos falsos. Los pollos se pueden probar a cualquier edad, aunque algunas

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autoridades especifican un mnimo de edad de 4 meses (21, 22) y adems los resultados positivos de los polluelos menores de 4 semanas de edad pueden deberse a los anticuerpos de origen materno. Preparacin del antgeno teido para las pruebas rpidas de aglutinacin de sangre entera y de suero

Se incuba una cepa de tipo estndar de S. Pullorum (con estructura antignica 9, 121, 123) y una de tipo variante (con estructura antignica 9, 121, 122) a 37C y se recogen por separado hasta la mezcla final para detectar el antgeno completo. Se siembran las cepas por separado en tubos de agar inclinado. Se incuban a 37C durante 24 horas, se emulsiona la masa microbiana con solucin salina normal estril y se extiende por estra un inculo sobre una placa de agar para conseguir fcilmente colonias aisladas. Para ello se incuban las placas durante 48 horas, se marcan ciertas colonias y cada una de ellas se observa para detectar aglutinacin sobre un porta con 1/500 acriflavina en solucin salina. Las colonias en fase lisa no producen aglutinacin. Se separan las colonias tpicas que no produzcan aglutinacin, se inoculan en tubos de agar inclinado y se incuban durante 24 horas. Se emulsiona la masa microbiana con una solucin salina y se distribuyen de manera uniforme 2 ml sobre la superficie del medio (200 ml) en un frasco de Roux o similar. Los frascos se incuban durante 60 horas. Para recoger el cultivo bacteriano, se inunda la superficie de cada frasco con suficiente solucin salina con formol tamponada y estril, pH 6,5 (cloruro sdico 8,5 g/litro, formalina neutra 10 ml/litro, 0,5 M fosfato sdico 4 ml/litro: se lleva hasta 1 litro con agua destilada, el pH se ajusta hasta 6,5 empleando 1 M cido ortofosfrico o 1 M hidrxido sdico), hasta conseguir unas suspensiones celulares densas (aproximadamente 10 ml por frasco). Se aaden 1215 perlas de vidrio estriles de 35 mm de dimetro y se agitan suavemente los frascos hasta que toda la masa microbiana constituya una suspensin homognea; se deja en posicin vertical al menos durante 15 minutos. Se comprueba la morfologa y la pureza de las suspensiones mediante la preparacin y el examen de muestras realizando la tincin de Gram. Se juntan las suspensiones procedentes de los frascos que contengan las mismas cepas. A cada 100 ml de suspensin se le aaden 200 ml de alcohol absoluto. Se agita la mezcla y se deja esttica durante 36 horas o hasta que la precipitacin sea completa. Se comprueba la capacidad de aglutinacin del estndar y de la variante precipitando primero por centrifugacin de una muestra para separar el alcohol, que se elimina, se diluye con solucin salina normal y se prueba con un suero positivo y otro negativo conocidos. Si la prueba resulta satisfactoria se elimina el alcohol del sobrenadante claro (una centrifugacin a 2.000 g durante 10 minutos puede ser til en la precipitacin), y se aade suficiente solucin salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga glicerol al 10% (v/v) para estandarizar la densidad hasta 75 tubo Wellcome de grado de opacidad No. 1 (o 50 tubo No. 1,0 segn la escala de McFarland). Se aaden volmenes iguales de las cepas estndar y variante y se aade al 1% (v/v) una solucin alcohlica de cristal violeta al 3% (w/v) hasta conseguir la mezcla final, y se deja sin mover durante 48 horas a temperatura ambiente. Se conserva en un contenedor cerrado firmemente a 04C hasta 6 meses. Para que la evaluacin sea segura, se lleva a cabo una prueba de cultivo en agar sangre para detectar la falta de viabilidad del antgeno no lavado antes de la estandarizacin. Cada botella de antgeno se debe probar despus de la precipitacin alcohlica y antes de la estandarizacin frente a antisueros de ttulo estndar dirigidos contra S. Pullorum y S. Gallinarum, y frente a un suero negativo. Si es posible, tambin se realiza la prueba con sueros positivo y negativo conocidos y sangre procedente de pollos positivos y negativos. Se dispone comercialmente de productos antignicos teidos para la prueba de aglutinacin en placa de sangre ntegra y, aunque parece que existen algunas pequeas diferencias en su sensibilidad, es improbable que grupos de aves infectadas con las variantes diferentes de S. Pullorum sean pasadas por alto. i) Procedimiento de la prueba Se usa una placa blanca, limpia y marcada con cuadrados de aproximadamente 3 3 cm. Si se emplea una placa con 3 4 cuadrados, se pueden probar al mismo tiempo hasta doce muestras de sangre. Se pone 1 gota (aproximadamente 0,02 ml) de antgeno teido con cristal violeta en el centro de cada cuadrado. Se obtiene una muestra de sangre entera reciente. Es conveniente hacerlo a travs de una vena del ala mediante una aguja con una punta triangular. Se coloca una gota de igual tamao de sangre entera fresca junto a la gota del antgeno. Se mezclan las gotas de antgeno y sangre con una varilla fina de cristal, que se frota para limpiarla entre muestras. Se realiza un movimiento suave para mantener agitadas las gotas durante dos minutos. En la misma placa se pueden realizar varias pruebas simultneamente pero las gotas no se deberan secar durante

ii) iii) iv) v) vi)

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este tiempo. En condiciones de temperaturas ms elevadas se pueden necesitar gotas ms grandes para evitar que se sequen. vii) La aglutinacin fcilmente visible del antgeno en unos 2 minutos indica una reaccin positiva.

viii) La ausencia de aglutinacin del antgeno en 2 minutos indica una reaccin negativa. ix) x) Se incluyen sueros control positivo y negativo conocidos para cada prueba, siguiendo el mismo procedimiento que el seguido para la muestra de sangre. Despus de completar un juego de pruebas, la placa se lava y seca, dejndola preparada para su utilizacin posterior.

En ausencia de reacciones positivas, cualquiera de las reacciones dudosas slo se puede interpretar a la luz del historial previa de pruebas sobre Salmonella en el grupo de aves. En el caso de que existan aves que muestren reaccin positiva, cualquier reactor dudoso se debera considerar como positivo. Adems, las aves infectadas recientemente puede que no muestren una reaccin positiva tpica hasta que no se les realice de nuevo la prueba a las 34 semanas.

b)

Prueba de la seroaglutinacin
La RST se lleva a cabo de la misma manera con la excepcin de sustituir la sangre entera por suero. Para pruebas con fines de exportacin, la aproximacin ptima consiste en realizar un muestreo inicial de los sueros mediante una RST con la posterior confirmacin de los resultados positivos mediante una prueba de aglutinacin en tubo. Lo ideal es que las muestras de suero que se vayan a probar siguiendo cualquier mtodo se analicen dentro de las 72 horas de la recogida, ya que en las muestras ms viejas pueden aumentar las reacciones inespecficas. Las muestras recientes pueden congelarse si es inevitable.

c)

Prueba de la aglutinacin en tubo

El suero reciente procedente de pollos, pavos u otras aves se utiliza a una dilucin inicial de 1/25, obtenida mezclando 0,04 ml de suero con 1,0 ml de antgeno2. En cada prueba se incluyen sueros control positivo y negativo. El antgeno se prepara a partir de cultivos no teidos de S. Pullorum o S. Gallinarum diluidos hasta una concentracin de No. 1 segn la escala de McFarland (como se ha descrito ms arriba). La mezcla se incuba a 37 o 50C durante 1824 horas antes de la lectura. Se considera una reaccin positiva cuando se observa un depsito blanco granular y un sobrenadante claro; una reaccin negativa muestra una turbidez uniforme. Las muestras positivas a una dilucin de 1/25 se prueban de nuevo en un rango superior de diluciones y un ttulo de 1/50 se considera normalmente positivo aunque este valor parece que vara en la literatura. En muchos casos se utiliza una sola dilucin al 1/50 pero puede que esta no sirva para detectar las infecciones de algunas bandadas, si solo se toma un pequeo nmero de muestras.

d)

Prueba de la microaglutinacin
Esta prueba es parecida a la prueba de aglutinacin en tubo pero requiere volmenes de reactivos mucho menores. La prueba se lleva a cabo en las placas de microtitulacin. Primero se diluyen los sueros aadiendo a cada 10 l de suero 90 l de solucin salina normal y a continuacin se aaden 100 l del antgeno teido estandarizado previamente hasta conseguir una dilucin final de 1/20. Mediante la titulacin del suero en diluciones al doble en las que se aade un volumen igual del antgeno teido estandarizado se puede obtener un punto final (ttulo). Las placas se sellan y se incuban a 37C durante 1824 o 48 horas. La reaccin positiva consiste en una precipitacin fina y difusa en tanto que una reaccin negativa muestra un precipitado en forma de botn. Los ttulos de 1/40 normalmente se consideran positivos pero esta prueba tiende a producir ms resultados positivos falsos con los sueros de pavo. Otras pruebas serolgicas comprenden la micro-antiglobulina hemaglutinacin y el enzimoinmunoensayo (ELISA). (Coombs), la inmunodifusin, la

Las tcnicas ELISA se han descrito para detectar anticuerpos frente a S. Pullorum y S. Gallinarum (14). Probablemente, el ELISA indirecto que utiliza el antgeno del lipopolisacrido es la prueba ms sensible y especfica de las pruebas serolgicas para detectar Salmonella en grupo de aves, incluyendo S. Gallinarum y S. Pullorum. Es relativamente fcil llevarla a cabo con el suero o la yema, y se puede utilizar para cuantificar el ttulo de anticuerpos (1, 2, 22). Actualmente no se dispone de kits comerciales ELISA para S. Pullorum y S. Gallinarum.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Para la preparacin de volmenes pequeos de antgenos somticos vase captulo 2.10.3. Salmonelosis.

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Aunque contra S. Gallinarum se han preparado tanto vacunas vivas como inactivadas, la vacuna ms utilizada se ha preparado a partir de la cepa rugosa 9R (6). Se ha aplicado slo a pollos. Es importante el nmero de microorganismos viables por dosis; estos microorganismos pueden sobrevivir en las aves vacunadas durante muchos meses y se pueden transmitir a travs del huevo (y quizs de ave a ave). La vacunacin puede reducir las prdidas en los grupos de aves, pero no evitar la infeccin con las cepas de campo. Adems, la vacunacin con la cepa 9R a veces puede provocar una alta mortalidad en las aves infectadas (20), y puede estimular la produccin de anticuerpos transitorios. Es habitual vacunar a las 8 semanas de vida y de nuevo a las 16 semanas. Se debe evitar el uso de antimicrobianos antes y despus de la vacunacin. Actualmente existen vacunas disponibles; sin embargo slo juegan un papel menor en el control de la tifosis aviar dado que ofrecen una proteccin corta contra la enfermedad clnica y una proteccin limitada o variable contra la infeccin. Las vacunas autgenas tambin pueden utilizarse para controlar la enfermedad clnica. El control se puede conseguir mejor aplicando las medidas adecuadas de bioseguridad, higiene, y buen manejo, basadas en el control y eliminacin de los grupos de aves infectados. Las vacunas 9R disponibles comercialmente se utilizan frecuentemente para la reduccin de S. Enteriditis en bandadas de ponedoras (11).

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
La vacuna viva de la tifosis aviar consiste en una suspensin de microorganismos vivos adecuadamente atenuados a partir de una cepa rugosa de S. Gallinarum, p. ej. 9R. Los microorganismos de esta vacuna dan las reacciones bioqumicas caractersticas de S. Gallinarum. Las colonias de un cultivo de 24 horas preparado a partir de la vacuna en placas de agar nutritivo son rugosas al examinarlas mediante la prueba en porta con acriflavina. El cultivo no debe contener los antgenos somticos caractersticos de las formas lisas de S. Gallinarum.

b)

Mtodo de cultivo
Salmonella Gallinarum se cultiva sobre o en un medio adecuado, tal como agar o caldo nutritivo, durante 24 horas a 37C.

c)

Validacin como vacuna

No existe un mtodo satisfactorio para evaluar la proteccin lograda con la vacuna en el campo. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que la vacuna puede proporcionar algn beneficio en algunas situaciones en las que no se puede conseguir el control slo mediante medidas de higiene y manejo. La prueba de potencia descrita ms adelante se puede utilizar para proporcionar evidencias de eficacia.

2.

Mtodo de produccin

La vacuna se puede preparar mediante la inoculacin de un medio adecuado tal como caldo nutritivo, con un cultivo fresco de S. Gallinarum (9R) y la incubacin a 37C durante 24 horas, con o sin aireacin. Los microorganismos se recogen mediante centrifugacin o sedimentacin. Alternativamente los microorganismos se pueden cultivar y recoger a partir de un medio slido, tal como agar nutritivo. En cualquier caso la suspensin se diluye en solucin PBS, pH 7,0 y se puede liofilizar. La dosis utilizada por ave oscila entre 5 106 y 5 107 microorganismos.

3.

Control del proceso

El cultivo que se emplea para inocular los cultivos destinados a la produccin as como las clulas recogidas se examinan al microscopio mediante la tincin de Gram para comprobar su pureza.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los productos biolgicos se pueden encontrar en el captulo 1.1.9.

10

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b)

Inocuidad
Se inyectan por va subcutnea seis pollos sanos y susceptibles (preferiblemente libres de patgenos especficos [SPF]), de 816 semanas de edad, con diez dosis de vacuna y se observan durante al menos 7 das; no deberan desarrollar reaccin local o sistmica.

c)

Potencia
Se toman quince pollos sanos, de 816 semanas de edad, de las variedades Light Sussex o Rhode Island Red, o cruces entre ellos, a partir de un grupo de aves que est libre de infeccin por S. Pullorum, y se inyectan por va subcutnea con una cantidad de vacuna correspondiente a una dosis de campo, p.ej. 5 107 microorganismos viables. Despus de un intervalo de tiempo de 2128 das, los pollos vacunados y un nmero igual de pollos similares no vacunados se mantienen en ayunas durante aproximadamente 18 horas. Seguidamente los pollos se desafan mediante la administracin oral de 1 ml de una suspensin de caldo de cultivo que contenga 5 107 microorganismos de una cepa virulenta de S. Gallinarum mezclada con 300 mg de un polvo consistente en tiza (40%), caoln liviano (43%) y trisilicato magnsico (17%). Todos los pollos se observarn durante 1421 das. La vacuna supera la prueba si al final de este periodo de tiempo el nmero de pollos supervivientes vacunados que muestran no tener lesiones macroscpicas de la tifosis aviar en un examen post mrtem es superior en ocho o ms el nmero de pollos control caracterizados de forma similar.

d)

Duracin de la inmunidad
La vacuna debera proporcionar proteccin a lo largo del periodo de puesta, y esto se puede medir mediante pruebas de potencia (eficacia) en fases durante la puesta. Puede que sea necesario administrar una dosis de refuerzo durante la puesta, pero no se debera utilizar durante este periodo en grupos de aves que provean huevos para el consumo humano.

e)

Estabilidad
El periodo de validez de la vacuna se puede medir mediante pruebas de potencia realizadas de forma peridica despus de la produccin. Estas pruebas se deberan hacer al menos en seis muestras. La potencia debera permanecer de manera satisfactoria durante al menos 1 ao.

f)

Conservantes
No se utilizan conservantes.

g)

Precauciones (riesgos)
Se desconoce la patogenicidad del microorganismo para el hombre y no hay riesgos especiales asociados con la produccin de la vacuna ni del antgeno. Sin embargo, la vacuna puede establecer una infeccin persistente en aves portadoras y puede provocar la enfermedad en pollos ya infectados.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
La prueba de seguridad descrita en la seccin C.4.b. se debera realizar en una muestra representativa de cada lote de producto final.

b)

Potencia
La prueba de potencia descrita en la seccin C.4.c. se debera realizar en una muestra representativa de cada lote de producto final.

REFERENCIAS
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2.

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