Validación de Métodos Analíticos

INFORME DE PRÁCTICA PROFESIONAL
HOMOLOGACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS FISICOQUÍMICO EMPLEADOS

EN POSTOBÓN S.A. PARA MATERIAS PRIMAS Y PRODUCTO TERMINADO,
Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE GRADOS BRIX
FRANKY ESTEBAN BEDOYA LORA

c.c. 1.017.143.241
ASESORES:
AIDA LUZ VILLA
JAIME ANDRÉS CASTRO
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
MEDELLÍN
AGOSTO 2009
A mi familia
ii
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 11
2. RESUMEN 13
3. OBJETIVOS 14
3.1. GENERAL 14
3.2. ESPECÍFICOS 14
4. MARCO TEÓRICO 15
4.1. VALIDACIÓN 15
4.1.1. Definición, importancia y necesidad de validación 15
4.1.1.1. Definición general del proceso de validación y el porqué de su
importancia 15
4.1.1.2. Necesidad de una validación 16
4.1.1.3. Cuando realizar una validación 17
4.1.2. Clasificación de métodos 18
4.1.2.1. Según la normalización y estado de desarrollo 18
4.1.2.2. Según categoría de método 19
4.1.3. Algoritmo de validación (aspectos logísticos) 19
4.1.3.1. Principales preguntas a realizar 19
4.1.3.2. Decisión del grado de validación requerido 20
4.1.3.3. Requerimiento analítico 21
4.1.3.4. Requerimientos analíticos y características de rendimiento
relacionadas 22
4.1.4. Parámetros de rendimiento y de caracterización del método 25
4.1.4.1. Robustez 25
4.1.4.2. Confirmación de identidad: selectividad/especifidad 32
4.1.4.3. Limite de detección (LID y LDM) 34
iii
4.1.4.4. Límite de cuantificación (LDC) y límite de cuantificación práctico
(LCP) 37
4.1.4.5. Linealidad 38
4.1.4.6. Rango 46
4.1.4.7. Sensibilidad 46
4.1.4.8. Precisión 48
4.1.4.9. Exactitud 54
4.1.4.10. Incertidumbre 59
4.2. EQUIPOS Y PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO 62
4.2.1. Densímetro: DMA 58 Anton Para 62
4.2.1.1. Especificaciones y condiciones de operación del equipo 62
4.2.1.2. Teoría de operación 63
4.2.1.3. Calibración 65
4.2.1.4. Conversión a grados Brix 66
4.2.1.5. Posibles causas de error del instrumento 67
4.2.2. Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley 67
4.2.2.1. Especificaciones y condiciones de trabajo del equipo 68
4.2.2.2. Teoría de operación 68
4.2.2.3. Calibración 72
4.2.2.4. Conversión de unidades 72
4.2.2.5. Posibles causas de error del instrumento 73
4.3. EL AZÚCAR 73
4.3.1. Definición 73
4.3.2. Propiedades fisicoquímicas y composición 74
4.3.3. Usos comerciales y producción 74
4.4. BRIX 76
4.4.1. Generalidades 76
4.4.2. Medición de grados Brix 77
4.4.3. Uso de grados Brix en la industria 78
iv
4.5. INVERSIÓN DEL AZÚCAR 78
4.5.1. Generalidades 78
4.5.2. Química de la inversión del azúcar 80
4.5.3. Cinética de la inversión 81
4.5.4. El por qué de la lectura en Brix invertido 82
5. DESARROLLO DEL PROYECTO 84
5.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 84
5.2. HOMOLOGACIÓN 84
5.3. VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE
GRADOS BRIX 86
5.3.1. Equipos y recursos usados en la validación 86
5.3.1.1. Instrumentos de análisis 86
5.3.1.2. Equipos para preparación de muestra 87
5.3.1.3. Reactivos 88
5.3.1.4. Recursos complementarios 88
5.3.2. Resumen del método para la determinación de grados Brix 89
5.3.3. Clasificación del método 90
5.3.4. Parámetros a validar y criterios de aceptación 90
5.3.5. Muestras, estándares y patrones de referencia 92
5.3.5.1. Muestras 92
5.3.5.2. Estándares 93
5.3.5.3. Patrones de referencia 93
5.3.6. Condiciones ambientales y tiempo de experimentación 94
5.3.7. Metodología 94
5.3.7.1. Robustez 94
5.3.7.2. Confirmación de identidad: selectividad/especifidad 97
5.3.7.4. Rango 99
v
5.3.8. Resultados y análisis 103
5.3.8.1. Robustez 103
5.3.8.2. Especifidad 120
5.3.8.4. Rango 131
5.4. CONCLUSIONES 140
5.5. RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS 142
6. BIBLIOGRAFÍA 143
vi
ÍNDICES DE TABLAS
Tabla 1. Parámetros de rendimiento relacionados según el requerimiento analítico 23

Tabla 2. Parámetros a evaluar según el nivel de normalización del método 24
Tabla 3. Parámetros a evaluar según la categoría del método 24
Tabla 4. Procedimiento general para evaluar la robustez 28
Tabla 5. Procedimiento general para confirmación de identidad: selectividad/especifidad 34
Tabla 6. Procedimiento general para evaluar LID y MDL 36
Tabla 7. Procedimiento general para evaluar LDC y LCP 38
Tabla 8. Ecuaciones para el análisis de varianza en una regresión lineal 44
Tabla 9. Procedimiento general para evaluar la linealidad y el rango de trabajo 46
Tabla 10. Procedimiento general para evaluar la sensibilidad 48
Tabla 11. Factores que inciden en la precisión 49
Tabla 12. Diseño matricial genérico propuesto 54
Tabla 13. Procedimiento general para evaluar la precisión 54
Tabla 14. Procedimiento general para evaluar la exactitud 58
Tabla 15. Resumen de especificaciones del densímetro 62
Tabla 16. Condiciones de operación del densímetro 63
Tabla 17. Composición del aire seco 66
Tabla 18. Resumen de especificaciones del refractómetro 68
Tabla 19. Relación entre algunos medios y el índice de refracción 68
Tabla 20. Coeficientes para regresión polinómica de grados Brix invertido a partir del índice
de refracción 73
Tabla 21. Tabla Jackson-Gillis 82
Tabla 22. Resumen de especificaciones del ultrasonido 87
Tabla 23. Descripción de muestras usadas en el desarrollo del proyecto 92
Tabla 24. Condiciones ambientales promedio en el laboratorio central 94
Tabla 25. Variables con influencia apreciable sobre el método analítico 95
Tabla 26. Niveles de influencia para los distintos factores 96
Tabla 27. Niveles de concentración evaluados en la robustez 96
Tabla 28. Componentes seleccionados para el análisis de especifidad 97
Tabla 29. Diseño de experimentos tipo Plackett-Burman para especifidad 98
Tabla 30. Soluciones preparadas según el instrumento 99
Tabla 31. Diseño de experimentos para precisión intermedia 100
Tabla 32. Descripción del patrón usado en el cálculo de exactitud para el densímetro. 101
Tabla 33. Estándares usados en el cálculo de la exactitud para el densímetro. 101
Tabla 34. Descripción de estándares usados para la calibración del refractómetro a distintos
rangos. 102
Tabla 35. Descripción de patrones usados en el cálculo de exactitud para el refractómetro. 102
Tabla 36. Resultados prueba de estabilidad para refractómetro 104
Tabla 37. Resultados prueba de estabilidad para densímetro 105
Tabla 38. Promedios de porcentaje de agua perdida respecto al día de lectura 106
Tabla 39. Resultados para el tiempo homogeneización en ultrasonido 108
Tabla 40. Resultados para prueba de cantidad de HCl para refractómetro 109
Tabla 41. Resultados para prueba de cantidad de HCl para densímetro 109
Tabla 42. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para refractómetro 112
Tabla 43. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para densímetro 113
Tabla 44. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para refractómetro 113
Tabla 45. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para densímetro 114
Tabla 46. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para refractómetro 115
Tabla 47. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para densímetro 115
vii
Tabla 48. Resultados del ensayo de agitación para refractómetro y densímetro 116
Tabla 49. Resultados del ensayo de tiempo de retardo en lectura 117
Tabla 50. Resultados del ensayo para temperatura de lectura 119
Tabla 51. Concentraciones reales de las soluciones placebo preparadas para la especifidad 120
Tabla 52. Respuesta en °B para las soluciones placebo en el análisis de especifidad 120
Tabla 53. Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las soluciones
placebo 121
Tabla 54. Especifidades calculadas para las soluciones placebo 121
Tabla 55. Resultados para linealidad por densimetría en Brix invertido 122
Tabla 56. Resultados para linealidad por densimetría en Brix directo 122
Tabla 57. Resultados para linealidad por refractometría en Brix invertido 123
Tabla 58. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango bajo 123
Tabla 59. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango alto 124
Tabla 60. Parámetro de regresión en el análisis de linealidad 124
Tabla 61. Parámetros de regresión polinómica en el análisis de linealidad por refractometría
en rango alto. 125
Tabla 62. ANOVA y pruebas de verificación de supuestos para linealidad 129
Tabla 63. Pruebas de significancia para pendiente e intercepto 130
Tabla 64. Recuperación (%) para datos de linealidad 131
Tabla 65. Sesgo (°B) para datos de linealidad 131
Tabla 66. Recuperación y sesgo (°B) para datos de linealidad por refractometría en rango
alto 132
Tabla 67. Sensibilidades para respuestas aproximadamente lineales 132
Tabla 68. Sensibilidades a varias concentraciones para rango alto en refractometría 133
Tabla 69. Repetitividades para densimetría y refractometría 134
Tabla 70. Intervalos de confianza para densimetría y refractometría en el análisis de
repetibilidad 135
Tabla 71. Verificación de varianzas similares entre analistas para precisión intermedia 135
Tabla 72. Resultados del análisis de precisión intermedia 135
Tabla 73. Intervalos de confianza para la precisión intermedia 136
Tabla 74. Resultados de exactitud para calibración con agua destilada en densimetría 136
Tabla 75. Resultados de exactitud para calibración con patrón de referencia en densimetría 137
Tabla 76. Resultados de exactitud para refractómetro en un rango de calibración alto y bajo 137
Tabla 77. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando densímetro 138
Tabla 78. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando
refractómetro en un rango de calibración bajo 138
Tabla 79. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando
refractómetro en un rango de calibración alto 139
Tabla 80. Reporte de validación para método de determinación de grados Brix por
densimetría y refractometría 141
viii
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Figura 1. Ciclo de validación 16

Figura 2. Diagrama de desarrollo, validación y ajuste de un método analítico 22
Figura 3. Algoritmo para la evaluación de robustez en un método analítico 26
Figura 4. Distribución normal y no normal 43
Figura 5. Jerarquía de los niveles de precisión 48
Figura 6. Diferencia entre exactitud y precisión 49
Figura 7. Procesos para cálculo de exactitud 55
Figura 8. Componentes del sesgo en una medida 56
Figura 9. Esquema del sistema para medir densidad 63
Figura 10. Esquema del proceso de medición en un densímetro tipo tubo en U 64
Figura 11. Esquema del lector para el refractómetro 67
Figura 12. Geometría de la refracción 69
Figura 13. Esquema de refracción a distintos ángulos 70
Figura 14. Esquema de medición en un refractómetro con autobarrido 71
Figura 15. Efecto de la concentración de azúcar en el índice de refracción 71
Figura 16. Estructura química de la sacarosa 74
Figura 17. Representación esquemática de la reacción de inversión 79
Figura 18. Diagrama King-Jison 82
Figura 19. Condiciones ambientales en el Laboratorio Central a través del tiempo 94
Figura 20. Grados Brix respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría 105
Figura 21. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en
refractometría 106
Figura 22. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en
densimetría 106
Figura 23. Promedio de todos los ensayos de estabilidad en porcentaje de agua perdida
respecto al tiempo 107
Figura 24. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra
para el refractómetro 110
Figura 25. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra
para el densímetro 111
Figura 26. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura 118
Figura 27. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en
jarabe 118
Figura 28. Regresión lineal para densidad respecto a °B invertido 125
Figura 29. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada
para Brix invertido 126
Figura 30. Regresión lineal para densidad respecto a Brix directo 126
Figura 31. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada
para Brix directo 126
Figura 32. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix invertido 127
Figura 33. Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para
Brix invertido 127
Figura 34. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango bajo 127
Brix directo en rango bajo 128
Figura 36. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango alto 128
Brix directo en rango alto 128
ix
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO A. TABLA PARA ESTADÍSTICO DE COCHRAN

ANEXO B. CERTIFICADOS Y TABLAS PARA MATERIALES DE REFERENCIA
ANEXO C. MATRIZ DE COMPARACIÓN DE MÉTODOS (en formato Microsoft Excel)
ANEXO D. CONDICIONES AMBIENTALES DEL LABORATORIO CENTRAL (en formato Microsoft
Excel)
ANEXO E. RESULTADOS Y CÁLCULOS (en formato Microsoft Excel)
x
Informe Práctica Profesional
POSTOBÓN S.A.
1. INTRODUCCION
La compañía POSTOBÓN S.A. lleva un largo recorrido en el desarrollo,

producción y distribución de bebidas no alcohólicas. Sus 105 años en la industria
de bebidas y su portafolio que incluye gaseosas, refrescos de fruta, té, jugos,
hidratantes, energizantes y aguas de mesa avalan la importancia de esta empresa
en el sector de alimentos a nivel nacional.
Una de las áreas de Postobón S.A. es la División Nacional de Gestión de Calidad

que tiene entre sus funciones el aseguramiento de la calidad en los procesos
productivos así como de las materias primas usadas y de los productos
terminados. El Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A. es fundamental dentro de
todo el proceso de gestión de calidad, este tiene como principal función: el análisis
fisicoquímico, microbiológico y sensorial de muestras de producto terminado en
todas las categorías, de acuerdo a los lineamientos dados por el Manual del
Sistema de Gestión de Calidad. Estos análisis se realizan mensualmente con el
objeto de verificar el cumplimiento de las características de calidad establecidas
en los 24 centros productores distribuidos a lo largo de la geografía colombiana.
Además, el Laboratorio Central debe proporcionar los métodos analíticos
fisicoquímicos, microbiológicos y sensoriales desarrollados y homologados, que se
usarán para el control de calidad en toda la compañía.
Los métodos utilizados además de estar debidamente estandarizados y validados

dentro de la compañía, deben ser consecuentes con los lineamientos establecidos
en las normas nacionales e internacionales. Este será el principal propósito del
trabajo: establecer un proceso de validación y efectuarlo en el método para la
determinación de grados Brix, con miras en la acreditación de la compañía según
los lineamientos de la NTC-ISO 17025.
Inicialmente se realiza una homologación general para los métodos de análisis

fisicoquímicos usados en POSTOBÓN S.A. respecto a procedimientos estándar;
luego de establecer las diferencias, se proponen las modificaciones pertinentes
para asegurar la conformidad con la normativa nacional e internacional.
Se establecen entonces los parámetros de rendimiento del método para

determinación de grados brix en bebidas gaseosas y jarabes. El cálculo adecuado
de estos requiere un diseño de experimentos acorde a las necesidades de la
compañía y al alcance de la validación. Se determina, además, un estimado de la
11
POSTOBÓN S.A.
incertidumbre en dos instrumentos, densímetro y refractómetro, que establecerá el

grado de confianza en los resultados aportados por dichos equipos.
Para una correcta validación se debe tener pleno conocimiento de los fenómenos
llevados a cabo por el método en cuestión, por esto se describen los principios de
funcionamiento de ambos equipos, refractometría y densimetría, la definición de
Brix directo e invertido en el ámbito industrial y las propiedades fisicoquímicas del
azúcar.
12
POSTOBÓN S.A.
2. RESUMEN
En el presente trabajo se realiza una homologación de métodos fisicoquímicos en

la compañía POSTOBÓN S.A. respecto a normas nacionales e internacionales,
con el fin de cerrar brechas y documentar diferencias para posibles
modificaciones.
Además, se desarrolla todo el proceso de validación del método para

determinación de grados Brix en bebidas gaseosas y jarabes, usado en el
Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A., que busca evaluar el rendimiento en la
ejecución del método y sentar las bases para el protocolo de validación de otros
métodos en el futuro. Los parámetros de rendimiento evaluados incluyen: la
robustez del método, confirmación de identidad, linealidad, rango, sensibilidad,
precisión, exactitud e incertidumbre.
ABSTRACT
A homologation of physicochemical methods was carried out respect to national

and international standards methods, in order to close gaps and to identify
differences that must be considered in future modifications.
Furthermore, the whole process of validation was developed for the “Determination
of Brix grades in soft drinks and syrups method”, in Postobón S.A. Central
Laboratory, where the yield of the method will be evaluated and other methods will
be validated. The performance parameters evaluated include: robustness,
confirmation of identity, linearity, range, sensitivity, precision, accuracy and
uncertainty.
13
POSTOBÓN S.A.
3. OBJETIVOS
3.1. GENERAL
Homologar los métodos empleados para los análisis fisicoquímicos en

POSTOBÓN S.A. de producto terminado y materias primas tendiendo como
referencia normas nacionales e internacionales, y validar el método para la
determinación de los grados Brix.
3.2. ESPECÍFICOS
- Revisar y homologar los métodos de ensayo fisicoquímico descritos en las

normas POSTOBÓN S.A. teniendo como referencia normas internacionales y
nacionales, y como principal referente las aportadas por PEPSICO,
estableciendo diferencias y realizando los ajustes necesarios para la posterior
homologación dentro de la compañía entre los laboratorios de calidad de los
distintos centros productores y el laboratorio central.
- Validar el método para la determinación de grados Brix en bebidas por

densimetría y refractometría. Esto incluye el cálculo de la robustez del método,
variables de rendimiento como exactitud, precisión, linealidad, sensibilidad
entre otras, y cálculo de la incertidumbre.
- Establecer un protocolo de validación que incluya los aspectos mencionados

en el objetivo anterior, para su uso en la posterior validación de los demás
métodos.
14
POSTOBÓN S.A.
4. MARCO TEÓRICO
4.1. VALIDACIÓN
4.1.1. Definición, importancia y necesidad de validación
4.1.1.1. Definición general e importancia del proceso de validación
Existen varias formas de llevar a cabo una validación, de acuerdo a sus objetivos y
alcances, los cuales dependen del analista, del laboratorio y del uso que se haga
del método; además el analista debe conocer los resultados esperados y definir el
nivel de confianza. El laboratorio que desarrolla o aplica el método es el
responsable del proceso de validación.
La validación puede definirse como: i) El establecimiento de una base de datos

experimental que certifica el rendimiento de un método analítico teniendo en
cuenta su objetivo de diseño [1]. ii) La confirmación por medio de una evaluación,
con la cual se suministra la evidencia necesaria para ratificar que los objetivos de
diseño del método bajo especificaciones particulares se cumplen en su totalidad
[2].
Dos palabras claves en estas dos definiciones reúnen los dos objetivos
primordiales de una validación, establecer un método y confirmar su desempeño
por medio de tratamientos estadísticos y apreciaciones cualitativas por parte del
laboratorio en general. De ahí radica la importancia de una adecuada validación,
ya que establece bajo qué circunstancias debe realizarse un análisis asegurando
que los datos obtenidos cumplen en la totalidad la calidad deseada, brindando
seguridad y respaldo. Además, proporciona criterios para el rechazo o reanálisis
de lecturas anómalas.
La validación de un método, generalmente, está íntimamente relacionada con el

desarrollo del método. En efecto, a menudo es difícil saber de forma exacta
cuándo termina el desarrollo del método y cuando comienza la validación.
Por otro lado, acompañando el proceso de validación, está la transferencia de

métodos. Este proceso se encarga de la introducción de un método validado a otro
laboratorio de tal forma que pueda ser usado con la misma capacidad para el cual
fue diseñado inicialmente. Generalmente, el proceso de transferencia de métodos
está a cargo del laboratorio que usará el método validado. Sin embargo es de vital
importancia la participación de ambas partes, tanto el que seleccionó/diseño/validó
15
POSTOBÓN S.A.
el método como los laboratorios que harán un uso rutinario de estos. Una
transferencia de métodos depende de una cooperación y comunicación cercana
entre éstos laboratorios.
En la figura 1 se esquematiza el ciclo de una validación, en teoría éste se repite

indefinidamente debido a los continuos avancen instrumentales y/o al desarrollo
de nuevas técnicas.
Desarrollo
del método
Control de Validación
calidad del
Laboratorio Revalidación
Figura 1. Ciclo de validación.
4.1.1.2. Necesidad de una validación
Eurachem, una asociación europea de laboratorios focalizada en el mejoramiento

y estandarización de los métodos de análisis químico, propone los siguientes
principios para promover una buena práctica en las mediciones de análisis
químico [3]:
1. Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un objetivo definido.

2. Las mediciones analíticas deben realizarse usando métodos y equipos
evaluados, y así asegurar que estos son adecuados para su propósito.
3. Los analistas encargados de los análisis deben estar calificados y ser
competentes con las tareas asignadas, además deben demostrar que ellos
pueden realizar el análisis de forma adecuada.
4. Debe de existir un aseguramiento independiente y periódico del desempeño
de las técnicas del laboratorio.
5. Las mediciones analíticas realizadas en un lugar en particular deben ser
consistentes con aquellas realizadas en cualquier otro laboratorio.
16
POSTOBÓN S.A.
6. Las organizaciones encargadas de realizar estos análisis deben tener bien

definido un procedimiento de control y aseguramiento de la calidad.
En el segundo principio se pueden encontrar de forma implícita la validación y por

tanto hace parte de las buenas prácticas fundamentales para realizar buenas
medidas en análisis fisicoquímicos.
4.1.1.3. Cuándo realizar una validación
La validación se encuentra dentro de un proceso de mejoramiento de la calidad de

los laboratorios, y hace parte de un ciclo que es renovado con cada modificación
que se realiza a los métodos. El proceso de validación debe realizarse cuando:
- Se desarrolla un nuevo método para un problema en particular (primera

validación).
- Se establece un método usado en otro laboratorio o con diferentes analistas.
- Cambio o actualización de equipos de análisis.
- Obsolescencia y correspondiente actualización del método.
- Se renueva el principio activo o se realizan correcciones al procedimiento
debido a condiciones de logística o de diseño.
- Cuando el control de calidad indica que el método establecido reporta valores
que varían con el tiempo.
- Cuando existen alteraciones de fondo en la matriz de análisis.
- Se desea demostrar la equivalencia de dos métodos, comparación entre un
método alternativo y uno normalizado.
Estos factores no son excluyentes y por lo tanto pueden efectuarse varios a la vez.
Se recomienda, entonces, cuando sea necesaria una re-validación, realizar la
mayor cantidad de cambios previstos a futuro, y de esta forma no será necesario
ejecutar validaciones de manera seguida; es decir, si por algún motivo se realiza
una corrección en el procedimiento y es necesaria la validación, se debe realizar
una búsqueda bibliográfica de la técnicas actuales para el método en cuestión y
evaluar si en ese momento existen mejores técnicas para dicho análisis y si es
apropiada su aplicación.
El proceso de validación está limitado por el alcance que se requiere, es

importante definir bien los objetivos iniciales y el alcance que tendrá para de esta
forma optimizar los ensayos. Es de anotar, que en una re-validación no es
necesario realizar todo el proceso de validación, en ocasiones solo es necesario
realizar el correspondiente análisis de robustez y precisión.
17
POSTOBÓN S.A.
4.1.2. Clasificación de métodos analíticos
4.1.2.1. Según la normalización y estado de desarrollo del método
Métodos estándar o normalizados
Los métodos estándar son aquellos publicados por organizaciones

internacionales, regionales o nacionales; por organizaciones técnicas respetables;
referencias legales; métodos publicados por la FDA (Food and Drug
Administration), y que se ejecutan tal como se describen en la norma.
Estos métodos incluyen aquellos publicados por:
- United States Pharmacopeia (USP)

- National Formulary (NF)
- Homeopathic Pharmacopeia of the United States
- Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists
(AOAC)
- American Public Health Association (APHA)
- Pesticide Analytical Manual (PAM)
- Food Additives Analytical Manual
- Food Chemicals Codex
- FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM)
- FDA Macroanalytical Procedures Manual (MPM)
- ORA Laboratory Information Bulletins (LIBs)
Se prefiere usar los métodos estándar, sin embargo es necesaria la verificación de

la capacidad analítica dentro de los laboratorios en los cuales es usado. Un
método estándar puede estar complementado con detalles adicionales sobre
como los laboratorios deben proceder para asegurar una aplicación consistente.
Aquellos métodos especificados por fabricantes de equipos de análisis también

son considerados como métodos estándar, por ejemplo los suministrados por
HACH en el Handbook de análisis de agua por métodos espectrofotométricos [4].
Métodos desarrollados por el laboratorio
En ocasiones cada laboratorio elabora sus propios métodos, esto puede deberse a
que el análisis es muy específico y se evalúa, por ejemplo, cierta matriz especial
que solo interesa al laboratorio; o que debido a restricciones de tipo comercial no
se puede disponer de métodos análogos usados en otras empresas o compañías.
El laboratorio, por consiguiente, debe evaluar la capacidad de los analistas,
equipos y otros recursos relacionados con el método en cuestión. Los métodos
deben estar debidamente validados, documentados y autorizados para su uso.
18
POSTOBÓN S.A.
Para la evaluación de la capacidad del método se sugiere realizar comparaciones

con otros métodos normalizados, preferiblemente que usen otro principio activo.
En lo posible se debe usar materiales de referencia, estándares o muestras
fortificadas.
Métodos no normalizados
Los métodos no normalizados son aquellos que no han sido publicados por
fuentes autorizadas y/o validadas. Es muy probable que los métodos sin
normalización no dispongan de datos de validación o estudios colaborativos
fiables o suficientes, por esto se recomienda realizar una validación cuanto sea
posible. Si el método sufre cambios se requerirá una re-validación del método.
4.1.2.2. Según categoría de método [5]
Lo métodos también pueden clasificarse según el ámbito en el cual es usado,

estos pueden agruparse en tres categorías generales:
- Categoría I: para la cuantificación de materia prima o principio activo en

producto terminado.
- Categoría II: para determinar impurezas en materia prima o compuestos de
degradación en producto terminado; o para análisis de residuos en material
biológico o alimentos.
- Categoría III: para determinar las características de funcionamiento como
disolución o liberación de droga en el organismo
4.1.3. Algoritmo de validación (aspectos logísticos)
A continuación se ilustran los pasos a seguir y preguntas que se deben auto-

realizar el laboratorio antes de ejecutar un proceso de validación [6]:
4.1.3.1. Principales preguntas a realizar
¿Quién debe llevar a cabo la validación del método?
El laboratorio que usa un método es responsable de asegurar que este sea

adecuadamente validado, y si es necesario realizar futuros trabajos para
suplementar los datos existentes. Por ejemplo, cuando un método ha sido validado
por una organización de aprobación de estándares, como la AOAC International,
el laboratorio necesitará solo establecer los datos del rendimiento para el propio
uso de un método especificado.
19
POSTOBÓN S.A.
¿Es posible una validación por estudio colaborativo o interlaboratorios?
Si un método será desarrollado para tener un gran campo de acción, aunque sea
un procedimiento estándar publicado, se recomienda el estudio colaborativo
involucrando a otros grupos de laboratorio. Sin embargo, éste no es una opción
muy adecuada para laboratorios industriales; en este caso se tiene que,
desafortunadamente, los laboratorios posiblemente interesados en el método de
análisis pueden pertenecer a la competencia.
La validación de un método de forma aislada reduce la cantidad de datos que

pueden alcanzarse para un método determinado. Es recomendable realizar
interlaboratorios después de la validación y la debida documentación del método
para comparar los datos obtenidos. POSTOBÓN S.A. tiene un protocolo de control
de calidad por medio de interlaboratorios de calibración realizados cada 4 meses
con los laboratorios de las plantas productoras, por lo que sería posible un análisis
de comparación después de realizarse la validación del método, en este caso en
la determinación de grados Brix.
Aunque el uso de los métodos sea privado, estos deben poseer certificación de
una autoridad reguladora competente, en el caso de POSTOBÓN S.A. sería
ICONTEC, específicamente la Norma Técnica Colombiana 2714 y 17025; con
éstas se busca estandarizar los métodos usados para análisis fisicoquímico y
microbiológico en la industria de bebidas gaseosas, con su respectiva validación y
respaldo metrológico.
Es de anotar que The Association of Official Analytical Chemists (AOAC

International) ha estado siempre a favor de pruebas interlaboratorio y propone este
procedimiento como el mejor método para realizar la validación de métodos,
incluso algunos de los métodos citados exponen datos de validación y parámetros
estadísticos útiles como la desviación estándar y la exactitud de un método en
particular. Estas validaciones son realizadas usando el método de validación por
estudio colaboratorivo.
En el caso de POSTOBÓN S.A. la validación del método concierne sólo al

Laboratorio Central para su posterior uso privado en los laboratorios de las plantas
productoras.
4.1.3.2. Decisión del grado de validación requerido
El laboratorio de por sí debe decidir cuáles de los parámetros para la evaluación

del rendimiento de un método se necesitan caracterizar, y así lograr una validación
acertada que llene las expectativas requeridas.
20
POSTOBÓN S.A.
Los factores que definen el alcance de una validación son:
- Frecuencia de uso en el laboratorio: rutina diaria, esporádica, etc.

- Sector de uso del método (categoría del método)
- La existencia de validaciones previas realizadas por organizaciones para la
estandarización del método, como la AOAC International.
- Restricciones de tiempo y costo.
Los lineamientos para la validación usados en un método deben ser acordes con
el sector sobre el cual actúa, por ejemplo, la validación de un método de análisis
en alimentos debe ser consistente con la estrategia de validación usada por la
AOAC International. Esto será de gran ayuda ya que así se estarán describiendo
los mismos factores bajo la misma terminología relevante al sector, en este caso,
de alimentos. Además si se desea proyectar a futuro una validación por estudio
colaborativo, resultará más fácil la transferencia del método.
4.1.3.3. Requerimiento analítico
Se deben tener en cuenta los requerimientos analíticos que debe afrontar el

laboratorio para evaluar o medir cierta propiedad en una muestra. Este debe estar
de acuerdo tanto con la necesidad del cliente o de la empresa como con los
recursos disponibles. Por esto inicialmente, los laboratorios deben realizar una
investigación de los métodos normalizados existentes, y, si es necesario,
desarrollar un nuevo método. Este procedimiento iterativo debe continuar hasta
que el método cumpla con los requerimientos y no sean necesarias futuras
modificaciones.
El proceso iterativo descrito se puede observar más claramente en el diagrama
que se presenta en la figura 2 [3].
21
POSTOBÓN S.A.
Figura 2. Diagrama de desarrollo, validación y ajuste de un método analítico
4.1.3.4. Requerimientos analíticos y características de rendimiento

relacionadas
Como se mencionó en la sección anterior, en la validación de un método no es

necesaria la evaluación de todas las características de rendimiento, esto depende
de la documentación y bibliografía existente, y de las necesidades como tal del
laboratorio.
A continuación, tablas 1 - 3, se exponen los criterios a tener en cuenta para elegir

que características son necesarias a evaluar, estos criterios se pueden clasificar
en tres grupos: requerimiento analítico, nivel de normalización y categoría del
método.
22
POSTOBÓN S.A.
Tabla 1. Parámetros de rendimiento relacionados según el requerimiento analítico
Requerimiento analítico Característica de

rendimiento relacionada
¿Qué clase de respuesta se requiere, cualitativa o cuantitativa? Confirmación de identidad
Selectividad/especifidad
Límite de detección
Límite de cuantificación
¿El analito está disperso o localizado? *
¿El analito está presente en más de una forma, se está interesado Confirmación de identidad
en analito extraíble, libre o total? Recuperación
¿Cuáles son los analitos de interés y a qué nivel se presentan (%, Confirmación de identidad
µg, ng, mg u otros)? Límite de detección
Límite de cuantificación
Rangos de trabajo y
linealidad
¿Qué tan preciso y reproducible debe ser la respuesta? ¿Qué Recuperación
grado de incertidumbre es permitido y como se expresará? Exactitud/fidelidad
Repetibilidad
Reproducibilidad
¿Cuál es la naturaleza química, biológica y física de la matriz? *
¿Cuáles son las posibles interferencias? Selectividad/especifidad
¿Se requiere un muestreo y sub-muestreo y será este realizado en *
el laboratorio?
¿La muestra está sujeta a restricciones de tamaño o *
disponibilidad?
¿Existen restricciones de recursos humanos, tiempo, dinero, *
equipo, reactivos y/o medios del laboratorio?
¿Los resultados necesitan ser comparados con otros laboratorios? Fortaleza/robustez
Reproducibilidad
¿Los resultados necesitan ser comparados con especificaciones Exactitud
externas? Reproducibilidad
* En estos casos no todos los elementos de un requerimiento analítico están directamente
relacionados con un parámetro de validación, algunos de estos determinarán de manera más
general si la técnica en particular es práctica o no para su uso.
23
POSTOBÓN S.A.
Tabla 2. Parámetros a evaluar según el nivel de normalización del método [5]
Tipo de método A comprobar Determinar Control

Método - Exactitud - Rango - Realizar protocolo de
normalizado - Repetibilidad - Linealidad control de calidad
- Incertidumbre - Recuperación - Controles
- Límite de - Robustez intralaboratorio
detección (si la - Selectividad - Participar de
norma lo indica) - Estabilidad (resistencia) interlaboratorios
- Reproducibilidad
Modificación de un - Exactitud. - Rango - Realizar protocolo de
método - Repetibilidad. - Linealidad control de calidad
normalizado - Reproducibilidad - Recuperación - Controles
- Robustez intralaboratorio
- Selectividad - Participar de
- Estabilidad(resistencia) interlaboratorios
- Reproducibilidad
Método - Exactitud. - Selectividad/especifidad - Realizar protocolo de
desarrollado por el - Repetibilidad. - Linealidad control de calidad
laboratorio o No - Reproducibilidad - Exactitud - Controles
normalizado - Rango intralaboratorio
- Repetibilidad - Participar de
- Reproducibilidad interlaboratorios
- Estabilidad(resistencia)
- Límite de detección
- Límite de cuantificación
- Recuperación
- Robustez
- Sensibilidad
- Incertidumbre
Tabla 3. Parámetros a evaluar según la categoría del método [5]
Parámetro Categoría I Categoría II Categoría III

Fortaleza Si Si *
Selectividad Si Si Si
Sensibilidad * * *
Linealidad Si Si *
Rango Si Si *
Exactitud Si Si *
Recuperación Si Si *
Precisión Si Si Si
Límite de detección No Si *
Límite de cuantificación No Si *
Estudio comparativo (interlaboratorio) * * *
Robustez Si Si Si
Incertidumbre Si Si Si
* Se deja a criterio del laboratorio, realizar siempre y cuando sea posible su determinación según
las restricciones del método.
24
POSTOBÓN S.A.
4.1.4. Parámetros de rendimiento y de caracterización del método
En esta sección se describirán los parámetros que definen el rendimiento de un

método, o en otras palabras, que ayudan a la caracterización de éste. En el
presente proyecto se tendrán en cuenta los siguientes:
- Robustez
- Selectividad/especifidad
- Linealidad
- Exactitud
- Intervalo de trabajo (rango)
- Límite de detección
- Límite de cuantificación
- Estabilidad (resistencia)
- Sensibilidad
- Incertidumbre
- Exactitud (recuperación o sesgo)
- Precisión:
- Repetibilidad
- Reproducibilidad
- Precisión intermedia
- Incertidumbre
4.1.4.1. Robustez
Una medida de que tan efectivo es un método analítico es saber la fiabilidad de los
resultados obtenidos cuando no es ejecutado de forma ideal. En cualquier método
siempre habrá etapas que no son efectuadas de manera cuidadosa, estas
variaciones podrían traer efectos negativos en su rendimiento y es posible que el
método no cumpla su objetivo. Estas etapas deben ser identificadas, y si es
posible, también se debe evaluar la influencia sobre el rendimiento del método
valorándose a través de pruebas de robustez, también llamado algunas veces
rigidez. Esto conlleva a realizar variaciones de forma deliberada en el método e
investigar los efectos subsecuentes en su rendimiento. Con estos resultados es
posible identificar que variables afectan de manera significativa y por lo tanto,
asegurar que cuando se haga uso de él, estas sean controladas de forma
eficiente.
La AOAC International define la robustez como la habilidad de un procedimiento

analítico para tolerar pequeñas variaciones de las condiciones del procedimiento,
especialmente en variables como: volumen, temperatura, concentración, pH,
tiempo de extracción y configuración del instrumento analítico [7].
Generalmente la robustez es usada para estudiar el efecto de ciertas variables

sobre la precisión y/o exactitud.
25
POSTOBÓN S.A.
Procedimiento para cálculo de robustez [5]
- Identificar los factores de variación

- Establecer los niveles de influencia
- Selección del diseño experimental
- Definición del protocolo de experimentos
- Ejecución de los experimentos y determinaciones
- Cálculo de efectos
- Análisis de varianza o prueba t para cuantificar la significancia del factor sobre
la respuesta del método.
En la figura 3 se propone el algoritmo a seguir para evaluar la robustez de un

método.
Figura 3. Algoritmo para la evaluación de robustez en un método analítico
26
POSTOBÓN S.A.
Diseño de experimentos
El diseño de experimentos establece la metodología estadística sistemática para

investigar la relación entrada-respuesta en alguno de los siguientes objetivos:
- Identificar variables o factores de diseño importantes

- Optimizar producción o métodos de análisis
- Realizar prueba de robustez.
El último objetivo es el de mayor importancia para este estudio en específico. En la

investigación se tienen gran cantidad de tipos de diseño de experimentos, existen
de tipo rudimentario como los análisis factoriales completos o aquellos que hacen
uso de recursos computacionales para análisis de gran cantidad de datos.
- Diseño factorial completo: se recomienda este tipo de análisis factoriales para

una cantidad baja de factores relevantes, entre 2, 3 ó 4 factores que requieren
4, 8 y 16 ensayos respectivamente. Este tipo de diseño tiene en cuenta las
interacciones entre los factores y su cuantificación, pero tiene la gran
desventaja que a mayor cantidad de factores el número de ensayos se eleva
de manera exponencial.
- Diseño factorial fraccional: un diseño factorial fraccional es un experimento

donde sólo se escoge una fracción adecuada de todo el conjunto de
combinaciones requeridas para un diseño factorial completo.
Existen otros tipos de diseño que son optimizaciones de los anteriores, los más
conocidos y recomendados para validación de métodos analíticos son los
propuestos por Plackett-Burman [8] y Youden-Staider [9].
- Diseño univariable: los análisis univariable, donde cada factor es evaluado

individualmente y luego por análisis de varianza u otras pruebas estadísticas
se determina su significancia, también son recomendados por la AOAC y
IUPAC [10]; además son altamente efectivos cuando las interacciones entre
factores son casi nulas. En este caso se realizan n+1 ensayos, donde el
experimento adicional es el método efectuado al 100 %.
Ejecución de experimentos
Se deben usar alícuotas o estándares de una misma solución y con una

concentración conocida. Se recomienda realizar los experimentos de manera
aleatoria o por bloques aleatorios, que consiste en analizar porciones del total de
muestra periódicamente, con esto además se verifica el efecto del tiempo; sin
embargo, cuando son muchas las variables la logística experimental puede
resultar imposible, aún más cuando el equipo con el cual se valida tiene un tiempo
de uso limitado. El tiempo es un factor determinante cuando ciertos accesorios del
27
POSTOBÓN S.A.
instrumento sufren cambios significativos, por ejemplo las columnas en un

cromatógrafo.
Cálculos de robustez [11], tabla 4.
Tabla 4. Procedimiento general para evaluar la robustez

Análisis Repeticiones Calculo Comentarios
Identificar las variables que Mínimo 9 Determinar el efecto Se recomienda el
pueden afectar medidas por cada (E) sobre la media para uso de diseño
significativamente y realizar experimento. Un cada factor. univariable.
diseño de experimentos. mínimo de tres
factores. Realizar Análisis de
Usar materiales de referencia o varianza y/o t contra un
muestras de composición ensayo realizado al
conocida (estándares). 100 % o contra el valor
verdadero.
- Respuestas o mediciones corregidas
Cuando los experimentos son llevados a cabo en un periodo de tiempo largo,

donde el equipo o las muestras pueden sufrir un cambio apreciable debido a la
falta de estabilidad o desgaste de ciertas piezas en el instrumento, se recomienda
realizar una corrección a las respuestas o determinaciones. Si las mediciones se
ejecutan a tiempo equidistantes, estas pueden ser corregidas según la siguiente
ecuación:
𝑝+1−𝑖 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 +𝑖∗𝑦 𝑛𝑜𝑚 ,𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠
𝑦𝑖,𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 = 𝑦𝑖,𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 + 𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 − (1)
𝑝+1
Donde,
𝑖 = 1,2,3 … 𝑝: es el número del diseño en el tiempo
𝑦𝑖,𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 : respuesta corregida
𝑦𝑖,𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 : respuesta en el experimento 𝑖
𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 : el resultado nominal o medición a condiciones nominales al inicio de los
experimentos (dadas por el método).
𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 : resultado nominal antes del experimento 𝑖
𝑦𝑛𝑜𝑚 ,𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠 : resultado nominal después del experimento 𝑖
- Cálculo de efectos
Los efectos son calculados a partir de las mediciones o respuestas corregidas.

Para diseños factoriales se tiene la siguiente ecuación:
𝑌(+) 𝑌(−)
𝐸𝑋 = − (2)
𝑁(+) 𝑁(−)
28
POSTOBÓN S.A.
Donde,
𝐸𝑋 : el efecto del factor X (variable modificada)
𝑌(+): respuesta de la medición donde se efectuó el cambio en el factor X
𝑌(−): respuesta de las mediciones en las cuales no se efectuó el cambio en el
factor X o el valor de dicho factor es bajo
𝑁(+): es el número de ensayos en los cuales se obtuvo 𝑌(+)
𝑁(+): es el número de ensayos en los cuales se obtuvo 𝑌(−)
Los efectos también pueden ser normalizados o relativos a respuestas que

corresponden a lecturas obtenidas a condiciones nominales, estas por lo general
se promedian para obtener 𝑌. El efecto se expresar en forma relativa según la
siguiente ecuación:
𝐸𝑋
𝐸𝑋 % = ∗ 100 (3)
𝑌
- Interpretación estadística
La interpretación estadística se centra en identificar la significancia de los efectos,

normalmente se usa el estadístico t. Antes de usar este procedimiento se
recomienda verificar la normalidad de los datos.
𝐸𝑋
𝑡= ↔ 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 (4)
𝑆𝐸 𝑒
El estadístico 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 se calcula con un nivel de significancia 𝛼 = 0.05 y

ocasionalmente 0.01 ó 0.1. Los grados de libertad son:
𝑅 =𝑛−2 (5)
Donde 𝑛 es el número total de mediciones en los dos ensayos. Cuando se realiza

el mismo número de réplicas por cada experimento 𝑛 = 2𝑁 + = 2𝑁(−).
- Cálculo del error estándar
Se define 𝑆𝐸 𝑒 como el error estándar de un efecto. En experimentos de robustez

esta variable puede ser estimada de varias formas: a partir de la precisión
intermedia de cada experimento, por errores simulados o interacción de dos
efectos, y por distribución de efectos (algoritmo de Dong). La forma más sencilla y
práctica es usando la precisión intermedia, para este caso podemos usar la
siguiente ecuación:
𝑆𝑎2 𝑆2
𝑆𝐸 = + 𝑛𝑏 (6)
𝑛𝑎 𝑏
29
POSTOBÓN S.A.
Donde 𝑆𝑎2 y 𝑆𝑏2 son las varianzas estimadas de los dos conjuntos de experimentos
o efectos entre los cuales se está realizando la comparación y son obtenidas a
partir de los datos 𝑌(+) y 𝑌(−). 𝑛𝑎 y 𝑛𝑏 son el número de mediciones realizadas,
en este caso 𝑁(+) y 𝑁(−). De forma alternativa se puede usar la varianza propia
del método que se obtiene en el cálculo de la precisión intermedia.
La ecuación se transforma entonces en:
2 2 2
𝑆(+) 𝑆(−) 𝑆𝑃𝐼 𝑆2
𝑆𝐸 = + 𝑁(−) = + 𝑁(−)
𝑃𝐼
(7)
𝑁(+) 𝑁(+)
2
Donde 𝑆𝑃𝐼 es la varianza asociada a la precisión intermedia. Existen casos en los
cuales la precisión intermedia es mucho menor a la precisión asociada al equipo
de medición, en estos casos se recomienda tomar la precisión mayor.
Un efecto es considerado significante si su estadístico t a un nivel de significancia

𝛼 dado es mayor que 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜
- Pruebas de hipótesis usadas en el cálculo de robustez
Prueba F o ANOVA para comparación de varias medias: cuando se tienen

varios niveles o concentraciones de factores que inciden en el valor a medir o se
desea evaluar en qué rango es aplicable el método, inicialmente resulta más
sencillo realizar un análisis de varianza (ANOVA) o prueba F suponiendo
varianzas iguales, las hipótesis para esta prueba las podemos definir como:
Ho: Todas las medias son iguales, 𝜇1 = 𝜇2 = 𝜇3 … = 𝜇𝑛

Hi: Al menos una media es distinta, 𝜇1 ≠ 𝜇2 ≠ 𝜇3 … ≠ 𝜇𝑛
La hipótesis nula se acepta si 𝐹 < 𝐹∝/2
𝑆𝑝2
𝐹 = 𝑆2 (8)
𝑒
𝑛𝑖 𝑛𝑘 2
𝑘=1 (𝑥 𝑖𝑘 −𝑥 𝑖 )
𝑆𝑒2 = 𝑖=1
𝑛𝑖 (9)
(𝑛 ) −𝑛 𝑖
𝑖=1 𝑘 𝑖
𝑛𝑖
𝛾𝑒 = 𝑖=1(𝑛𝑘 )𝑖 − 𝑛𝑖 (10)
Donde,
𝑛𝑖 : número de conjuntos, número de medias.

(𝑛𝑘 )𝑖 : número de medidas en el conjunto 𝑖
30
POSTOBÓN S.A.
𝑆𝑝2 = 𝑛0 𝑆𝑚𝑝
2
(11)
𝑛𝑖
1 𝑛𝑖 (𝑛 𝑘 )𝑖 2
𝑛0 = 𝑛 𝑖=1(𝑛𝑘 )𝑖 − 𝑖=1
𝑛𝑖 (12)
𝑖 −1 (𝑛 )
𝑖=1 𝑘 𝑖
𝑛𝑖
2 (𝑥 −𝑥 𝑝 )2
𝑖=1 𝑖
𝑆𝑚𝑝 = (13)
𝑛 𝑖 −1
𝑛𝑖
(𝑛 ) 𝑥
𝑖=1 𝑘 𝑖 𝑖
𝑥𝑝 = 𝑛𝑖 (14)
(𝑛 )
𝑖=1 𝑘 𝑖
𝛾𝑝 = 𝑛𝑖 − 1 (15)
𝐹∝/2 se lee de la distribución F de Fisher-Snedecor con 𝛾𝑝 y 𝛾𝑒 grados de libertad y

a un nivel de significancia generalmente 𝛼 = 0,05.
Prueba Chi-cuadrado para comparación de varianzas: cuando la prueba F nos

indica que al menos hay una media distinta, se procede a realizar una
comparación entre la mayor varianza calculada para una prueba en particular y la
varianza teórica, esta última puede ser la reportada para el instrumento o un valor
que se considere significativo dentro del laboratorio.
Las hipótesis se pueden expresar como:
Ho: La varianza de los datos es menor o igual que la reportada por el instrumento,
𝜍 2 ≤ 𝜍0 2
Hi: La varianza de los datos es mayor a la reportada por el instrumento, 𝜍 2 > 𝜍0 2
La hipótesis nula se acepta si

𝜒 2 ≤ 𝜒𝛼2 (16)
𝑛−1 𝑠 2
𝜒2 = (17)
𝜍0 2
𝛾𝑒 = 𝑛 − 1 (18)
𝜒𝛼2 se lee de la distribución chi-cuadrado con grados de libertad 𝛾𝑒 y un nivel de

significacia dado 𝛼 = 0,05.
Después de efectuadas estas pruebas se calculan los efectos correspondientes a

cada factor en los niveles de concentración dados.
31
POSTOBÓN S.A.
4.1.4.2. Confirmación de identidad: selectividad/especifidad
Es necesario establecer que la señal producida u otra propiedad evaluada

atribuida al analito, es debida solo a este y no por la presencia de otro compuesto
química o físicamente similar. Esto se llama confirmación de identidad.
La medida del analito dependerá de la efectividad con que este es aislado y de la
selectividad/especifidad de la medida.
En ocasiones las interferencias no se pueden separar del analito, por lo tanto

cuando se analiza no se tiene conocimiento del aporte de la interferencia en la
medida. Para evitar esto, se recomienda realizar un análisis de confirmación de
identidad usando distintas técnicas, preferiblemente con principios activos
diferentes. Estas interferencias no separables también pueden ser percibidas por
una curva de calibración no lineal.
Respecto a la diferencia entre selectividad y especifidad, aunque ambas son

usadas en varias fuentes como si fueran el mismo parámetro, la especifidad es
considerada como un término absoluto, es decir como una selectividad al 100 %,
por lo que no se puede cuantificar o graduar. Por otro lado, algunos autores hacen
referencia a la selectividad cuando se usa un método para determinación
multicomponente, y especifidad para técnicas donde solo se analiza un compuesto
pero en el cual existen otros tipos de sustancias o interferencias que también
pueden aportar intensidad a la señal o magnitud medida. Para usos prácticos en
este trabajo se usará la última diferenciación.
En la selectividad/especifidad de un método se investiga la habilidad de medir el

analito de interés, en porciones donde se ha añadido deliberadamente
compuestos que provocan interferencias. También se puede determinar realizando
lecturas en otros métodos y realizando una comparación entre éstos.
En general la selectividad/especifidad se da de modo verbal y raramente de forma
numérica como en el caso de análisis cromatográfico, donde existe la posibilidad
de calcular coeficientes de selectividad.
Klaus Danzer [12] propone una novedosa forma cuantitativa de medir la

selectividad/especifidad para métodos multicomponentes y monocomponentes, a
partir de varios ensayos usando distintas concentraciones del compuesto de
interés y de las interferencias.
Cálculo de selectividad/especifidad
En un método ideal, la respuesta del ensayo debe ser sólo función de la especie a
la cual se le está realizando la cuantificación, esto se puede expresar en forma de
una función de la siguiente manera:
𝑦𝐴 = 𝑓(𝑥𝐴 ) (19)
32
POSTOBÓN S.A.
Donde 𝑦𝐴 es la señal o respuesta del compuesto A usada para su cuantificación, y

𝑥𝐴 es la concentración o cantidad de analito presente en la muestra.
En casos reales esta señal o respuesta se debe en realidad a la influencia de

varias señales, pertenecientes a la especia a cuantificar A y otros componentes, B,
C,… J,…, N. La función queda definida como:
𝑦𝐴 = 𝑓(𝑥𝐴 , 𝑥𝐵 , … , 𝑥𝑁 ) (20)
Asumiendo que las influencias son lineales, resulta la ecuación:
𝑦𝐴 = 𝑦𝑜 + 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐴𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐴𝑁 𝑥𝑁 (21)
Para métodos de determinación multicomponente, puede expresarse de la

siguiente manera:
𝑦𝐴 = 𝑦𝐴0 + 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐴𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐴𝑁 𝑥𝑁

𝑦𝐵 = 𝑦𝐵0 + 𝑆𝐵𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐵𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐵𝑁 𝑥𝑁
𝑦𝐼 = 𝑦𝐼0 + 𝑆𝐼𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝐼𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝐼𝑁 𝑥𝑁
𝑦𝑁 = 𝑦𝑁0 + 𝑆𝑁𝐴 𝑥𝐴 + 𝑆𝑁𝐵 𝑥𝐵 + ⋯ + 𝑆𝑁𝑁 𝑥𝑁
(22)
Los coeficientes 𝑆𝐼𝐽 se definen como la sensibilidad parcial de la respuesta para el

componente I respecto al componente J.
Debido a que en la mayoría de métodos a desarrollar y validar las determinaciones

son monocomponentes, solo se describirá en detalle este modo de cálculo. La
especifidad se valora entonces de la siguiente manera:
𝑁
𝑠𝑝𝑒𝑐(𝐴/𝐵 … 𝑁) = 𝑆𝐴𝐴 𝑥𝐴 𝐽 =𝐴 𝑆𝐴𝐽 𝑥𝐽 (23)
En ocasiones las sensibilidades parciales pueden ser negativas, es decir, tienen

un efecto negativo en la señal/respuesta, por lo tanto en el cálculo se usan los
valores absolutos de éstas sensibilidades parciales, permitiendo que la especifidad
quede indicada en un rango {0… +1}. Como se puede observar en la anterior
ecuación la especifidad depende de la concentración de las interferencias, en caso
que estas no se conozcan o no se tenga un estimado, se usa un valor de 10 % 𝑥𝐴 .
33
POSTOBÓN S.A.
Por propósitos prácticos, se asume que valores de 𝑠𝑝𝑒𝑐 > 0.9 indican especifidad
suficiente. De la misma forma valores menores a 0.9 demuestran poca especifidad
del método.
Las sensibilidades parciales se pueden hallar por regresión lineal múltiple (Gauss
Jordan o mínimos cuadrados), analizando la respuesta de varias soluciones con
diferentes cantidades del analito e interferencias, el diseño de experimentos para
esta prueba se puede realizar bajo los lineamientos de descritos en la sección
4.1.4.1.
Tabla 5. Procedimiento general para confirmación de identidad: selectividad/especifidad [3]
¿Qué hacer? Repeticiones Cálculo/Determinación Criterio de

aceptación
Analizar las muestras 1 %Recuperación Suficiente evidencia
y materiales de Exactitud que soporta la
referencia por el Usar los resultados para fiabilidad del
método seleccionado confirmar la habilidad de la método
y otros métodos técnica en la identificación del
independientes. analito.
Analizar muestras que 1 Especifidad o selectividad Los componentes
contienen el analito y %Recuperación no deben interferir
posibles interferencias Selectividades parciales en la cuantificación
fortificadas. Examinar el efecto de las del analito.
interferencias, que tanto inciden 𝑠𝑝𝑒𝑐 > 0.9
en la intensidad de la respuesta
del método.
4.1.4.3. Limite de detección (LID y LDM)
Antes de describir el procedimiento para el cálculo de los distintos límites de

detección es importante definir cuales límites existen y en qué caso aplican. A
continuación se definen en orden ascendente según su magnitud [13]:
Límite de detección instrumental (LDI): concentración que produce una señal 5

veces mayor a la relación señal/ruido del instrumento. Se puede definir como
1.645 veces la desviación estándar de la concentración que reporta un blanco.
También es llamado nivel crítico.
Límite inferior de detección (LID): se calcula como 2 ∗ 1.645𝑠, donde “𝑠” es la

desviación estándar del blanco de análisis. Este se llama comúnmente “nivel de
detección” y fija al 5 % los tipos de error I y II.
Límite de detección del método (LDM): es la concentración obtenida de una

muestra procesada con el método completo y la cual produce una señal con el 99
% de probabilidad de ser diferente al blanco. Esto se verifica realizando 7 réplicas,
34
POSTOBÓN S.A.
las cuales deben tener una media por arriba de 3.14𝑠, donde “𝑠” es la desviación
estándar de las 7 réplicas
Límite de cuantificación (LDC): es la concentración que produce una señal lo

suficientemente grande que pueda ser detectada arriba del blanco. Típicamente
es la concentración que produce una señal 10𝑠 arriba del blanco.
Cuando se realizan mediciones en las cuales el analito está en bajas

proporciones, por ejemplo, en el análisis de trazas, es importante saber cuál es la
mínima cantidad de analito que puede medirse con la suficiente confianza por el
método. Por lo anterior, es de anotar, que este parámetro se debe calcular para
métodos que cuantifiquen trazas en una matriz dada, cuando el analito se
encuentra entre los componentes mayoritarios no es necesaria la cuantificación de
este valor.
Aunque el término límite de detección no es muy aceptado, se usa en muchos

trabajos y bibliografía relevante, sin embargo, la ISO usa generalmente el término
"minimum detectable value of the net state variable" que hace referencia al valor
mínimo detectable, al igual que la IUPAC.
En la práctica los límites de detección más importantes son el LID y el LDM. El LDI
generalmente lo reportan los fabricantes de equipos y en ocasiones es tan bajo
que no sirve como criterio estadístico para afirmar la validez de una lectura. El
límite de cuantificación (LDC) formalmente no es un "límite de detección" por lo
tanto se calculará como un parámetro distinto.
El cálculo para hallar el LID y LDM es casi idéntico, se diferencia en que para la
determinación del LDM la muestra que contienen el componente de interés es
procesadas a través de todo el método analítico mientras que para el cálculo del
LDI solo se realizan lecturas a un blanco, el cual puede ser un estándar de baja
concentración. La determinación del LID y LMD se hace de manera iterativa, y
debe repetirse en caso de no cumplir con la condición final. Normalmente el LDM
es mayor al LID.
Procedimiento para el cálculo de LID y LDM [13]
Cálculo del LID:
- Preparar una solución estándar a concentración casi cero pero conocida no

superior a 5 veces el estimado para el LID, éste estándar hace las veces de
“blanco”.
- Analizar 7 replicas de esta solución y calcular la desviación estándar “𝑠”.
- A partir de una tabla normal acumulativa multiplicar “𝑠” según:
35
POSTOBÓN S.A.
o Reducir probabilidad del error tipo I (detección falsa) al 5 %:
𝐿𝐼𝐷 = 1.645𝑠 (24)
o Reducir probabilidad del error tipo II (no detección falsa) al 5 %:
𝐿𝐼𝐷 = 3.290𝑠 (25)
- Si la concentración conocida no está en el rango de uno a cinco veces el LID

calculado para error tipo II se procede a realizar nuevamente las
determinaciones partiendo de una concentración adecuada.
Cálculo del LDM:
- Preparar una solución o estándar de concentración conocida próxima al LDM

estimado.
- Analizar 7 replicas de esta solución y calcular la desviación estándar “𝑠”.
- A partir de una tabla de distribución obtener el estadístico t desigual (una cola)
para un nivel del 99 % y con 6 grados de libertad para este caso, y calcular:
LDM = 3.14s (36)
- Si la concentración conocida no es próximo al LDM calculado se procede a

realizar nuevamente las determinaciones partiendo de una concentración
adecuada.
Tabla 6. Procedimiento general para evaluar LID y LDM

LID: análisis directo de un blanco 7 mediciones Calcular la
al cual se le añade una cantidad desviación
conocida de analito tal que la estándar y el LID.
concentración sea menor a 5
veces el valor estimado del LID.
LDM: análisis de un placebo o 7 mediciones Calcular la Se realizar la
matriz similar a las muestras desviación determinación con mas
usuales con concentración estándar y el réplicas, pero con la
conocida igual a 5 veces el valor LDM. respectiva modificación
estimado del LDM. La muestra del valor t.
debe ser sometida al tratamiento
completo especificado por el
método.
36
POSTOBÓN S.A.
4.1.4.4. Límite de cuantificación (LDC) y límite de cuantificación práctico

(LCP)
El límite de cuantificación es estrictamente la concentración más baja del analito

que puede ser determinada con un nivel de repetibilidad, precisión y exactitud
aceptable, y produce una señal lo suficientemente grande como para distinguirse
de un blanco. Si bien el LDC resulta de utilidad dentro de un laboratorio, es mayor
la utilidad del límite de cuantificación práctica (LCP) definido como el nivel inferior
registrable en los límites especificados a lo largo de operaciones rutinarias del
laboratorio.
Cálculo del LDC
Existen dos formas básicas para la determinación del LDC [3]:
A partir del blanco, solo cuando éste tiene una cantidad apreciable de analito, se
procede de la siguiente manera:
- Analizar 10 réplicas del blanco sin adición de analito.

- Calcular la desviación estándar.
- Expresar el límite de cuantificación como: 10s
Es de anotar que conseguir un blanco representativo de las muestras usuales es

difícil, por lo tanto existe el otro método para cuantificación del LDC.
A partir del LDM:
- Fortificar alícuotas del un blanco a varias concentraciones del analito cercanas

al LDM, en un mínimo tres concentraciones.
- Realizar 10 mediciones a cada concentración.
- Calcular la desviación estándar del analito a cada concentración.
- Graficar la desviación estándar contra la concentración y asignar un valor de
LDM por inspección.
- Expresar el LDC como la menor cantidad del analito que se puede determinar
con un nivel aceptable de incertidumbre, en este caso desviación estándar.
Pese a la rigurosidad del cálculo del LDC éste es un valor indicativo y no debería
ser usado para tomar decisiones, por esto se define el límite de cuantificación
práctico.
Cálculo del límite de cuantificación práctico (LCP):
El LCP puede obtenerse por experiencia directa con análisis realizados en el

laboratorio, sin embargo se puede calcular un estimado donde el LCP es igual a
37
POSTOBÓN S.A.
cinco veces el LDM, este representa un límite de detección práctico y alcanzable

de forma rutinaria con una certeza elevada de que los valores comunicados son
fiables.
Tabla 7. Procedimiento general para evaluar LDC y LCP
Análisis Repeticiones Calculo

LDC: blancos sin adición de 10 veces Desviación estándar y LDC
analito
LDC: blancos con una 10 veces en mínimo Desviación estándar

concentración conocida de 3 concentraciones. Graficar desviación estándar vs
analito cercano al LDM concentración
LDC por inspección
LPC (A partir de LDM): no 5 veces el LDM
necesita ningún análisis.
4.1.4.5. Linealidad
Para los métodos cuantitativos es necesario determinar el rango de concentración

del analito donde el método debe ser aplicado. La linealidad y rango son dos
parámetros muy relacionados, sin embargo el rango se distingue de la linealidad
en que éste toma en cuenta además la precisión y la exactitud de los valores
obtenidos y por lo tanto se trabaja como un parámetro distinto. Sin embargo
ambos se obtienen a partir del mismo grupo de ensayos.
La evaluación de la linealidad es muy útil para determinar qué tipo de calibración

es requerido en el uso rutinario del método, este nos puede definir tanto si la curva
de calibración requiere solo un punto o tantos como sean necesarios para obtener
una regresión adecuada, se recomienda aproximadamente 6 puntos de calibración
[3], aunque esto depende en mayor medida del método y del instrumento a usar.
La relación entre la respuesta del método y la concentración no debe ser
necesariamente lineal, en caso de ser curva esta debería ser repetible en el
transcurso del tiempo.
Para análisis de drogas y sustancias en productos que tienen un valor nominal fijo
y único, se recomienda la evaluación de linealidad en un rango de ± 20 ó ± 30 %
del valor lineal tomando al menos 5 concentraciones [6,5]. Sin embargo para
análisis de sustancias que están presentes en concentraciones desconocidas o
que sólo están bajo la reglamentación de un máximo o mínimo requerido, por
ejemplo en análisis de pureza, se debe determinar la linealidad en un rango
determinado. Para este caso el valor más bajo será es el límite de detección o el
50 % del límite de cuantificación práctico [1], y el valor más alto, en cambio,
dependerá de varios factores [1,3]:
38
POSTOBÓN S.A.
- Máxima cantidad de analito en la muestra que puede llegarse a evaluar.

- Máxima señal/respuesta que pueden entregar los equipos o instrumentos
usados en el método.
- 150 % del valor nominal en caso que exista.
En este último caso se recomienda evaluar la linealidad al menos en 10

concentraciones distintas.
Debido a que en este proceso se desea tener la menor cantidad de factores
sistemáticos que puedan influenciar y se debe tener controlado al máximo los
errores aleatorios, se recomienda [5]:
- Realizar las mediciones de menor a mayor concentración. Esto elimina

posibles efectos de memoria en el equipo.
- Las muestras deben prepararse a partir de estándares de concentración o
pureza conocida. Los datos del estudio de linealidad servirían entonces
también en la etapa del cálculo de recuperación y exactitud.
- La cantidad de repeticiones que se realizarán es función de la precisión del
equipo o instrumento usado, y del número de mediciones que se realizarán de
forma rutinaria a una misma muestra. En general se recomienda que estas
repeticiones no sean menores a tres.
Existen dos formas de realizar un diagnóstico de linealidad, ambas útiles bajo

ciertas condiciones:
- Los puntos de la curva se realizan a partir de soluciones preparadas con

pesadas independientes, sin realizar sucesivas diluciones. Esto porque cuando
se realiza una dilución, si el analito alcanza su límite de solubilidad, parte de
este no estará disuelto y por lo tanto formará una respuesta no lineal. Sin
embargo este procedimiento no es muy recomendable cuando se preparan
soluciones de baja concentración ya que el error al pesar será relativamente
mayor a bajas concentraciones. Esta metodología debe realizarse cuando las
concentraciones son suficientemente altas.
- La otra forma de realizar la aproximación lineal es preparando soluciones a
partir de alícuotas de una solución stock o estándar, así, es posible obtener
concentraciones bajas en caso de ser necesarias en el análisis.
Evaluación estadística de la linealidad [14]
A parte de la inspección visual preliminar que se debe realizar a la regresión

lineal, es importante verificar estadísticamente la linealidad y la aleatoriedad de los
valores residuales. Para realizar la evaluación estadística recurrimos a las
siguientes fórmulas y criterios:
39
POSTOBÓN S.A.
- Cálculo de la regresión lineal
Ecuación de la recta:
𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎 (27)
Valor estimado para una concentración 𝑥𝑖 :
𝑦𝑖 = 𝑏𝑥𝑖 + 𝑎 (28)
Valor residual:
𝑒𝑖 = 𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 (29)
Término independiente:
𝑦 −𝑏 𝑥
𝑎 = 𝑦 − 𝑏𝑥 = (30)
𝑛
𝑦 𝑥
𝑦= ,𝑥= (31)
𝑛 𝑛
Pendiente:
𝑥−𝑥 (𝑦−𝑦 )
𝑏= (32)
𝑥 −𝑥 2
Coeficiente de correlación:
𝑥−𝑥 (𝑦 −𝑦 )
𝑟= (33)
𝑥−𝑥 2 𝑦 −𝑦 2
Cálculo de la varianza residual:
2 𝑦−𝑦 2 𝑦2 −𝑎 𝑦−𝑏 𝑦𝑥 (𝑦𝑖 −𝑦𝑖 )2 𝑒𝑖 2

𝑉𝑅𝐸𝑆 = 𝑆𝑦,𝑥 =
𝑛−2
1 − 𝑟2 = 𝑛−2
= 𝑛−2
= 𝑛−2
(34)
Cálculo de la varianza de la pendiente:
𝑆𝑦2 ,𝑥
𝑆𝑏2 = ( 𝑥 )2
(35)
𝑥2−
𝑛
40
POSTOBÓN S.A.
Cálculo de varianza del término independiente:
𝑥2
𝑆𝑎2 = 𝑆𝑏2 (36)
𝑛
Para el análisis de linealidad se define entonces 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎, donde 𝑥 es la

concentración teórica, 𝑦 la respuesta del equipo, 𝑏 el valor de la pendiente y 𝑎 la
intersección con el eje 𝑦 o término independiente.
La pendiente 𝑏, como se verá más adelante, está asociada a la sensibilidad del

método, mayor pendiente significa mayor sensibilidad, por otro lado el término
independiente 𝑎 está relacionado con el error sistemático del método, su
significancia debe ser evaluada para determinar si el error sistemático es
representativo.
- Coeficiente de correlación (𝑟) y determinación (𝑟 2 )
El coeficiente de correlación, 𝑟 nos indica el grado de relación entre la

concentración y la respuesta, además es un estimado indirecto de la dispersión de
los datos con relación a la estimación lineal. Cuando este parámetro se acerca a
un valor de 1, indica una alta relación lineal entre ambas variables.
Se recomienda un valor del coeficiente de correlación mayor a 0.999, aunque en el
caso de impurezas este podría ser mayor a 0.990.
El coeficiente de determinación, 𝑟 2 aporta una mayor significancia estadística ya
que esta expresa como tal la variación total del modelo lineal.
- Varianza residual y homoscedasticidad
Al evaluar la homoscedasticidad de los valores residuales, se busca determinar si

la variación de estos es aleatoria respecto al modelo lineal; este análisis aporta
mucha información acercar de la validez del modelo. Para evaluarla se procede a
graficar los residuales (eje y) respecto a los valores estimados (eje x). La
distribución de los puntos debería ser aleatoria y no reflejar ninguna tendencia.
- Análisis de varianza (ANOVA) para la regresión lineal
Para efectuar la ANOVA se debe cumplir con los siguientes requisitos:
o Homogeneidad de las varianzas

o Normalidad de los residuales
Homogeneidad de las varianzas: después de verificar la homoscedasticidad, es

necesario corroborar la homogeneidad de las varianzas aplicando un método
estadístico. La prueba más usada es la propuesta por Cochran que indicará si el
factor de concentración tiene alguna influencia en la variabilidad de las respuestas.
41
POSTOBÓN S.A.
El valor del estadístico experimental se calcula de la siguiente forma:

2
𝑠𝑚𝑎𝑥
𝐶𝐸𝑋𝑃 = (37)
𝑠𝑖2
2
Donde 𝐶𝐸𝑋𝑃 es el estadístico de Cochran, 𝑠𝑚𝑎𝑥 la máxima varianza de todos los
2
conjuntos de datos y 𝑠𝑖 las varianzas calculadas para cada conjunto de datos
(réplicas de una misma concentración).
El valor crítico del estadístico de Cochran 𝐶 lo determinan:
𝐶 = 𝐶(𝑘, 𝑣, 𝛼) (38)
Donde 𝑘 es el número de grupos de datos o grupo de réplicas, 𝑣 el grado de

libertad definido como 𝑛𝑚𝑎𝑥 − 1, donde 𝑛𝑚𝑎𝑥 es el mayor de los tamaños de
muestra, y 𝛼 el nivel de significancia, usualmente 0.05.
Con estos parámetros y la tabla de valores del estadístico de Cochran reportadas

en el anexo A, se puede leer el valor crítico del estadístico.
Si, 𝐶𝐸𝑋𝑃 < 𝐶 𝑘, 𝑣, 𝛼 significa que las varianzas de las concentraciones son
homogéneas, es decir, que el factor concentración no influye estadísticamente en
la variabilidad de los resultados.
En caso que este requisito no se cumpla se puede proceder de la siguiente

manera:
- Si la mayor variabilidad está ubicada en uno de los extremos, este punto debe
excluirse y por lo tango reducir el rango lineal.
- Puede plantearse el análisis a otro nivel de concentraciones tal que las
variaciones no sean significativas.
Test de normalidad: la distribución normal es una de las distribuciones teóricas

más estudiadas, su importancia se debe fundamentalmente a que la frecuencia de
distintas variables asociadas a fenómenos naturales y cotidianos se ajustan
aproximadamente a esta distribución, sin embargo, puede resultar poco frecuente
encontrar variables con este tipo de comportamiento. Muchos procedimientos
estadísticos usados frecuentemente asumen la normalidad de los datos
observados: correlaciones, regresiones, pruebas de hipótesis, análisis de
varianza, entre otros. Aunque esta hipótesis puede obviarse cuando se disponen
de un número suficiente de datos, se recomienda hacer el test para comprobar la
normalidad de los datos. Cuando los datos no son normales se podrían ajustar a
una distribución normal usando técnicas como las descritas en [15,16].
42
POSTOBÓN S.A.
Figura 4. Distribución normal y no normal.
En la figura 4 podemos observar a la izquierda una distribución normal perfecta,

en cambio en la derecha una distribución alejada de la normalidad, en la cual las
tres variables centrales no coinciden. Además de esta característica la distribución
normal posee otras propiedades a tomar en cuenta [17]:
- Tiene una única moda, que coincide con su media y su mediana.

- La curva normal es asintótica al eje de abscisas. Por ello, cualquier valor entre
∞ y −∞ es teóricamente posible. El área total bajo la curva es, por tanto, igual
a 1.
- Es simétrica con respecto a su media. Según esto, para este tipo de variables
existe una probabilidad de un 50 % de observar un dato mayor que la media, y
un 50 % de observar un dato menor.
- La distancia entre la línea trazada en la media (µ) y el punto de inflexión de la
curva es igual a una desviación típica (𝜍). Cuanto mayor sea 𝜍, más aplanada
será la curva de la densidad.
- El área bajo la curva comprendida entre los valores situados aproximadamente
a dos desviaciones estándar de la media es igual a 0.95.
- La forma de la campana de Gauss depende de la media y la desviación típica.
La media indica la posición de la campana. Por otra parte, la desviación
estándar determina el grado de apuntamiento de la curva. Cuanto mayor sea el
valor de σ, más se dispersarán los datos en torno a la media y la curva será
más plana
La normalidad de los datos, en este caso los residuales, se puede comparar

usando la representación gráfica o pruebas estadísticas robustas incluidas en
algunos software. Entre los test más extendidos se encuentran el de Kolmogorov-
Smirnov y Shapiro-Wilk.
El test de Kolmogorov-Smirnov es el más extendido en la práctica [17], este

compara la función de distribución de los datos con la distribución normal, y mide
la máxima distancia entre ambas curvas. La prueba de Shapiro-Wilk, fue diseñada
inicialmente para tamaños de muestra moderados y puede detectar desviaciones
de la normalidad por asimetría o curtosis.
43
POSTOBÓN S.A.
En el software Origin Pro 8 se puede realizar el test de normalidad con una

significancia del 0.05 y de forma rápida y precisa por los métodos Kolmogorov-
Smirnov y Shapiro-Wilk. El procedimiento general para este análisis es:
- Introducir datos
- Seleccionar columna(s)
- Statistics/Descriptive Statistics/Normality Test/Open Dialog
- Seleccionar las pruebas Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov con parámetros
estimados.
Habiendo realizado las anteriores pruebas y después de haber fijado la posibilidad

o no de realizar un análisis de varianza a los datos de la regresión se procede al
cálculo de la ANOVA, en la tabla 8 se sintetizan las ecuaciones usadas en este
tratamiento estadístico.
Tabla 8. Ecuaciones para el análisis de varianza en una regresión lineal

Grados de
Suma de cuadrados Varianza Estadístico
libertad
𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 𝑉𝑅𝐸𝐺
Regresión 𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 = 𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦)2 1 𝑉𝑅𝐸𝐺 = 𝐹1 =
1 𝑉𝑅𝐸𝑆
𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆
Residual 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 = (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2 𝑛−2 𝑉𝑅𝐸𝑆 =
𝑛−2
𝑆𝐶𝐹𝐴 𝑉𝐹𝐴
Falta de ajuste 𝑆𝐶𝐹𝐴 = 𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2 𝑘−2 𝑉𝐹𝐴 = 𝐹2 =
𝑘−2 𝑉𝐸𝑋𝑃
Error 𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆
𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 = (𝑦𝑖𝑗 − 𝑦𝑖 )2 𝑛𝑖 − 𝑘 𝑉𝐸𝑋𝑃 =
Experimental 𝑛𝑖 − 𝑘
𝑆𝐶𝑇
Total 𝑆𝐶𝑇 = (𝑦𝑖𝑗 − 𝑦 )2 𝑛𝑖 − 1 𝑉𝑇 =
𝑛𝑖 − 1
Donde
𝑖: número del grupo
𝑗: número de la serie
𝑦: media de y
𝑥: media de x
𝑛: número total de lecturas
𝑛𝑖 : número de réplicas en un grupo
𝑘: número de grupos o concentraciones
Relación entre sumas de cuadrados
(𝑦𝑖𝑗 − 𝑦)2 = (𝑦𝑖𝑗 − 𝑦𝑖 )2 + 𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2 + 𝑛𝑖 (𝑦𝑖 − 𝑦)2 (39)
𝑆𝐶𝑇 = 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 + 𝑆𝐶𝐹𝐴 + 𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 (40)
𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 = 𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 + 𝑆𝐶𝐹𝐴 (41)
44
POSTOBÓN S.A.
𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 : suma de cuadrados debido a la regresión

𝑉𝑅𝐸𝐺 : varianza de la regresión
𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 : variación residual debida al error experimental dentro de los grupos más la
variación debida a la falta de ajuste.
𝑉𝑅𝐸𝑆 : variación residual
𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 : cálculo del error experimental (suma de cuadrados debido a las réplicas
dentro de las mismas series).
𝑉𝐸𝑋𝑃 : varianza del error experimental
𝑆𝐶𝐹𝐴 : cálculo del error de regresión o de falta de ajuste (se debe a la dispersión de
resultados entre los valores de la recta de regresión y las medias de cada grupo)
𝑆𝐶𝑇 : suma de los cuadrados total
Una vez comprobados los supuestos y calculados los estadísticos 𝐹1 y 𝐹2 se

procede a verificar las siguientes hipótesis:
𝐹1,𝑒𝑥𝑝 > 𝐹1,𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 demuestra la existencia de una pendiente distinta a 0.
𝐹2,𝑒𝑥𝑝 < 𝐹2,𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 demuestra la linealidad entre los resultados obtenidos.
Los valores F se obtienen de las tablas de Fisher-Snedecor de acuerdo a los

grados de libertad correspondientes y a un grado de significancia de 0.05.
Test de verificación de la pendiente: con este test se busca corroborar la

significancia estadística de la pendiente, esto se logra calculando el intervalo de
confianza para la pendiente según la ecuación:
𝑏 ± 𝑡 ∗ 𝑠𝑏 (42)
Donde, 𝑡 es el valor de la distribución de student para 𝑛 − 2 grados de libertad y

un nivel de significancia de 0.05. Este intervalo no debe de incluir el valor cero
para considerar la pendiente significativa.
Test de verificación del intercepto: esta prueba es similar a la anterior, pero en

este caso tenemos la ecuación:
𝑎 ± 𝑡 ∗ 𝑠𝑎 (43)
El estadístico 𝑡 se calcula de igual manera, y se concluye que la ordenada es

estadísticamente significativa si el rango incluye el valor cero. En caso de no
cumplirse el test sería necesario interpolar el resultado del análisis de cualquier
muestra entre al menos dos estándares, uno superior y otro inferior. De esta forma
se obvia el sesgo del método.
45
POSTOBÓN S.A.
Tabla 9. Procedimiento general para evaluar la linealidad y el rango de trabajo
Análisis ¿Cuántas ¿Qué calcular? Comentarios

veces?
Blanco y 3 cada Graficar medida de respuesta De forma ideal en este paso
materiales de punto (y) contra la medida de las muestras deberían ser
referencia, ó concentración (x) preparadas de forma
blancos independiente y no de
fortificados a Examinar visualmente para alícuotas o del mismo patrón,
varias identificar el rango de trabajo. esto dará confirmación visual
concentraciones de si el rango de trabajo es
lineal o no.
Se necesita al
menos 6 puntos
distintos
Materiales de 3 cada Graficar la medida de respuesta En este paso es necesario

referencia o punto (y) contra la medida de confirmar la linealidad del
blancos concentración (x). rango de trabajo tanto visual
fortificados al como estadísticamente.
menos en 10 Examinar visualmente puntos
puntos distintos. atípicos que no deberían estar Es poco seguro eliminar
presentes en la regresión. datos atípicos sin antes
realizar verificaciones en
Calcular coeficiente de cercanías a dicho punto.
regresión apropiado. Calcular y
graficar los valores residuales En ciertas circunstancias
(diferencia entre el valor actual y puede ser necesario usar
el valor predicho por la ecuación una regresión a una curva no
de la recta para cada valor de lineal. No se recomienda el
x). Distribución aleatoria uso de polinomios mayores
alrededor de la línea confirma al orden cuadrático.
linealidad. Tendencias
sistemáticas indica no
linealidad.
4.1.4.6. Rango
Proceder de igual forma que en el análisis de linealidad, a diferencia de este,

calcular además la precisión y la recuperación en cada nivel de concentración.
Para el cálculo de rango de trabajo se recomienda usar el definido por el mínimo
valor y el máximo valor aportados por los análisis usuales que se realicen dentro
del laboratorio. Restringir entonces el rango donde los valores de precisión y
exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de aceptación [3].
4.1.4.7. Sensibilidad
La sensibilidad es el gradiente de la curva de respuesta (respuesta vs

concentración), es decir, el cambio en la respuesta de un instrumento que
corresponde a un cambio en la concentración del analito, en otras palabras, es la
46
POSTOBÓN S.A.
pendiente de la curva de calibración. Cuando un método tenga una pendiente más

alta que otro, se dice que el primero es más sensible. La IUPAC define la
sensibilidad de forma más técnica como "El cambio en la respuesta de un
instrumento dividido por el correspondiente cambio del estímulo (señal de
entrada)."
Cuando se ha establecido linealidad en la curva de respuesta este parámetro es
constante, sin embargo en métodos no lineales existen valores para distintos
rangos de concentración. La sensibilidad en ocasiones es referida al límite de
detección pero esto en general no es aceptado [3].
Cálculo de la sensibilidad
La sensibilidad es, entonces, la pendiente de la curva de calibración respuesta vs

concentración
𝑑𝐺
𝑆 = 𝑑𝐶 (44)
Donde G es la señal de respuesta y C la concentración, para curvas de calibración

altamente lineales el valor de sensibilidad es único en el rango especificado.
Para rangos más amplios se tiene en ocasiones que la respuesta es no lineal y,

por lo tanto, se hace necesario el cálculo de la sensibilidad a una concentración
específica usando la derivada de una ecuación polinómica. En estos casos la
sensibilidad depende de la concentración y se debe especificar este parámetro en
cada nivel evaluado en la regresión.
Pasos para cálculo de sensibilidad:
- Preparar estándares a diferentes concentraciones, mínimo 3 puntos para

respuestas lineales y mínimo 5 para polinómicas, preferiblemente usando
alícuotas de una misma solución.
- Analizar las muestras y graficar la curva de calibración.
- Realizar una regresión lineal o polinómica según el caso.
- Registrar la pendiente para una regresión lineal, o las derivadas evaluadas
para cada punto de la calibración.
47
POSTOBÓN S.A.
Tabla 10. Procedimiento general para evaluar la sensibilidad [3]

Analizar estándares a Tres mediciones Promedio de cada No es recomendable
diferentes por estándar respuesta realizar
concentraciones (mínimo Gráfica Respuesta vs aproximaciones
3 para respuestas concentración polinómicas mayores
lineales, mínimo 5 para Regresión lineal o a grado 2.
respuestas polinómicas) polinómica
Pendiente (lineal) o
derivada evaluada en
cada concentración
(polinómica)
4.1.4.8. Precisión
La precisión de un procedimiento analítico expresa el nivel de concordancia o

grado de dispersión entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples
muestras homogéneas bajo condiciones prescritas [1]. Se evalúa mediante
análisis de réplicas, análisis repetidos de un estándar estable o análisis de
adiciones conocidas sobre las muestras.
La precisión indica la variabilidad de un método de ensayo y expresa en que rango

es aceptable la variación de una misma muestra a condiciones reales, dato que
posteriormente es usado como condición de criterio para la aceptación o rechazo
de análisis.
En la precisión pueden considerarse tres niveles: repetibilidad, precisión

intermedia y reproducibilidad [5]. En la figura 5 podemos observar de manera más
clara la organización jerárquica de estos niveles.
Precisión
Intra Inter
Precisión
Repetibilidad Reproducibilidad
intermedia
Instrumental
Método
Figura 5. Jerarquía de los niveles de precisión.

48
POSTOBÓN S.A.
La precisión de un método analítico por lo general se expresa como la varianza,

desviación estándar o coeficiente de variación de una serie de mediciones.
Repetibilidad: expresa el nivel de concordancia de los datos bajo las mismas

condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo. La repetibilidad también
se conoce como precisión intra-ensayo.
Precisión intermedia: expresa la variación dentro de un mismo laboratorio: a

diferentes días de análisis, distintos analistas, distintos equipos, etc.
Reproducibilidad: indica la precisión entre laboratorios, usualmente se lleva a cabo

con ayuda de estudios colaborativos o interlaboratorios.
La precisión y exactitud a menudo son conceptos que pueden confundirse, para

una mejor apreciación de lo que significa cada una podemos analizar la figura 6:
Figura 6. Diferencia entre exactitud y precisión
En la tabla 11 se exponen los factores que inciden en el estudio de repetibilidad,

precisión intermedia y reproducibilidad [5]:
Tabla 11. Factores que inciden en la precisión
Factor Repetibilidad Precisión intermedia Reproducibilidad

Instrumento Igual Diferente Diferente
Tiempo entre análisis Igual Diferente Diferente
Analista Igual Diferente Diferente
Laboratorio Igual Diferente Diferente
Otros factores (reactivos,
Igual Igual Diferente
condiciones ambientales, etc.)
49
POSTOBÓN S.A.
Otros factores que influyen son los siguientes:
- Humedad y temperatura ambiental

- Instrumentos de características diferentes o diferentes tecnologías
- Variación de detalles experimentales no especificados en el método
- Equipos de diferente antigüedad
- Electrodos o columnas de cromatografía de diferentes lotes y/o
proveedores
- Disolventes y reactivos de diferente calidad
Procedimiento para el cálculo de repetibilidad y reproducibilidad por análisis

"r y R" a partir de un interlaboratorio
Para el cálculo de la repetibilidad y reproducibilidad se recurre a la Norma Técnica

Colombiana 3529 [18], la cual describe los procesos y cálculos para la
determinación de la precisión de métodos de ensayo. La reproducibilidad como tal
estima la variabilidad de los resultados inter-laboratorios. El objetivo principal es
verificar que distintos laboratorios proporcionan los mismos resultados.
El factor "r" calculado a partir de la desviación estándar a condiciones de

repetibilidad, es un criterio de aceptación que permite al analista decidir si la
diferencia entre análisis duplicados de una misma muestra, determinada bajo
condiciones de repetibilidad, es significativa [3].
El factor "R" al igual que su homólogo "r", permita al analista saber si la diferencia
entre análisis duplicados es significante bajo condiciones de reproducibilidad [3].
Modelo estadístico: en la estimación de la precisión de un método de ensayo, es

útil asumir que cada resultado de un ensayo es la suma de tres componentes:
𝑦 =𝑚+𝐵+𝑒
En donde,
𝑚: promedio general
𝐵: variación entre laboratorios
𝑒: error aleatorio presente en cada ensayo o intra-laboratorio
En este caso el valor 𝑚 no es necesariamente igual al valor real y en caso que sea
distinto se denomina su diferencia como el sesgo del método de ensayo y no
aporta significancia en el estudio de precisión.
El término 𝐵 se puede considerar como la suma de los componentes sistemáticos

y de los componentes aleatorios, el término 𝑒 representa el error aleatorio
50
POSTOBÓN S.A.
presente en todo resultado de un ensayo, sin embargo asumiendo que las

distribuciones del error son normales, se puede esperar que la variación generada
por este error tenga valores diferentes en los distintos laboratorios, sin embargo,
se asume que tales diferencias deben ser pequeñas y se establece un valor
común para la varianza intra-laboratorio.
Cálculo
𝑝: número de laboratorios
𝑛𝑖 : número de replicas para el laboratorio 𝑖
𝑦𝑖 : promedio de la medición para el laboratorio 𝑖
𝑠𝑖 : desviación estándar para el laboratorio 𝑖
𝑠𝑟 : desviación estándar de repetibilidad
𝑠𝐿 : desviación estándar que incluye variabilidades entre-operarios y entre-equipos
𝑠𝑅 : desviación estándar de reproducibilidad
𝑇1 = 𝑛𝑖 𝑦𝑖 (45)
𝑇2 = 𝑛𝑖 𝑦𝑖 2 (46)
𝑇3 = 𝑛𝑖 (47)
𝑇4 = 𝑛𝑖 2 (48)
𝑇5 = (𝑛𝑖 − 1)𝑠𝑖2 (49)

𝑇
𝑠𝑟2 = 𝑇 −𝑝
5
(50)
3
𝑇2 𝑇3 −𝑇1 2 𝑇3 (𝑝−1)
𝑠𝐿2 = − 𝑠𝑟2 (51)
𝑇3 (𝑝−1) 𝑇3 2 −𝑇4
𝑠𝑅2 = 𝑠𝑟2 − 𝑠𝐿2 (52)

𝑇
𝑚 = 𝑇1 (53)
3
𝑟 = 2 2 𝑠𝑟2 (54)
𝑅 = 2 2 𝑠𝑅2 (55)
51
POSTOBÓN S.A.
Procedimiento para cálculo de repetibilidad y precisión intermedia usando el

coeficiente de variación
- Repetibilidad
La determinación de la repetibilidad se basa en una serie de replicas realizadas

bajo las mismas condiciones y en un intervalo de tiempo corto, se recomiendan un
mínimo de 9 mediciones en total y un mínimo de 3 niveles de ensayo, ó 6
determinaciones a una concentración nominal [19].
El estudio de repetibilidad en el rango de trabajo es importante ya que
generalmente la desviación estándar relativa o coeficiente de variación aumenta al
disminuir la concentración del analito, aunque la desviación estándar como tal
puede ser directamente proporcional a la concentración.
La ICH (International Conference on Harmonization) recomienda reportar tanto los
coeficientes de variación como los intervalos de confianza para nivel de
concentración analizado.
Cálculo de coeficiente de variación

𝑆
𝐶𝑉(%) = 𝜇 ∗ 100 (56)
Donde,
𝑆: es la desviación estándar
𝜇: media aritmética de los resultados
Cálculo de Intervalo de confianza
El intervalo de confianza para el promedio se calcula con el estadístico t de

student:
𝑠
𝑥±𝑡∗ (57)
𝑛
Donde,
𝑥: promedio se la serie de resultados
𝑠: desviación estándar
𝑛: número de mediciones
𝑡: estadístico t de Student con 𝑛 − 1 grados de libertad y 𝛼 = 0.05
A cada uno de los tipos de repetibilidad, instrumento y método, se les realiza el

mismo tratamiento matemático para obtener el CV y el intervalo de confianza:
Repetibilidad del instrumento: se calcula a partir de mediciones repetidas

realizadas a una muestra homogénea que ha pasado por todo el proceso del
52
POSTOBÓN S.A.
método, es decir, realizar mediciones a la misma muestra como tal y no réplicas

de ella. El número mediciones en este ensayo está condicionado por la cantidad
de muestra que destruye el equipo en su determinación. Se recomienda de 6 a 10
veces.
Repetibilidad del método: a diferencia del ensayo anterior, en este caso se parte
de alícuotas de una misma muestra homogénea y se les realiza todo el
procedimiento indicado de forma individual, se analizan de forma independiente
como si fueran réplicas de una misma muestra y con un mismo analista. Tal como
lo propone la ICH se recomiendan mínimo 9 mediciones para un total 3 niveles de
concentración (3 mediciones por nivel).
La repetibilidad del método debe ser mayor a la repetibilidad del instrumento, su

relación teórica está dada por la ecuación propuesta por Carporal-Gautier [5]:
𝐶𝑉𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜 = 2𝐶𝑉𝑖𝑛𝑠𝑡𝑟𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (58)
Con la precisión intermedia se busca evaluar la variabilidad del método usado en

un mismo laboratorio pero a condiciones operativas distintas, los factores a
modificar incluyen el día de análisis, analista, instrumento, entre otros.
Se recomienda un diseño matricial y aleatorio, para muestras preparadas de forma
independiente, mínimo por triplicado para cada factor y un mínimo de 9
determinaciones en total, la precisión intermedia se calcula entonces como el
coeficiente de variación global de todas las respuestas obtenidas o la respectiva
desviación estándar.
El criterio de aceptación de la precisión intermedia está dado por:
𝐶𝑉𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖𝑜𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 < 2 ∗ 𝐶𝑉𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚é𝑡𝑜𝑑𝑜 (59)
Si este no se cumple se debe estudiar qué factor generó la variabilidad en el

estudio de precisión intermedia, esto se hace calculando el CV para cada grupo de
análisis, por ejemplo en un equipo especificado o para un analista en particular.
En la tabla 12 se puede apreciar el modelo propuesto para el análisis de la

precisión intermedia en un laboratorio con dos analistas y dos instrumentos, en un
rango de tres días, se recomienda que los estándares o patrones se lean mínimo
por triplicado.
Prueba F para comparación de varianzas: antes de realizar cualquier análisis

con los datos suministrados para el cálculo de la precisión intermedia, se debe
verificar que los analistas tienen varianzas similares, esto se logra con la prueba F
53
POSTOBÓN S.A.
o ANOVA descrita en los cálculos de robustez, si son sólo dos analistas se verifica
con una forma especial de la prueba F:
Las hipótesis a comprobar son:
Ho: Las varianzas son iguales, 𝜍1 = 𝜍2

Hi: las varianzas son distintas, 𝜍1 ≠ 𝜍2
Teniendo las varianzas de dos conjuntos de datos se calcula:
𝑆2
𝐹 = 𝑆12 (60)
2
La hipótesis nula se acepta si 𝐹1−∝/2 ≤ 𝐹 ≤ 𝐹∝/2 (61)
𝐹∝/2 y 𝐹1−∝/2 se leen de la distribución F de Fisher-Snedecor con 𝛾1 y 𝛾2 grados de

libertad y un nivel de significancia generalmente 𝛼 = 0,05.
Tabla 12. Diseño matricial genérico propuesto [5]
Analista X Día 1 Día 2 Día 3

Instrumento A
Analista Y Día 1 Día 2 Día 3
Analista X Día 1 Día 2 Día 3
Instrumento B
Analista Y Día 1 Día 2 Día 3
Tabla 13. Procedimiento general para evaluar la precisión

"r y R" usando una 9 repeticiones como R, r y m Se recomienda
muestra preparada, mínimo en un mínimo de 3 realizarlo en mínimo 2
estándar o muestra típica laboratorios niveles de
de análisis. concentración.
Repetibilidad (método e 9 repeticiones en 3 niveles CV e intervalo

instrumento) usar de concentración de confianza
estándares o muestras
preparadas con
concentración conocida.
Precisión intermedia 3 por analista por día y por CV de Se recomienda
cada instrumento. Un total instrumento, y realizarlo en mínimo 2
mínimo de 9 analista. niveles de
determinaciones. concentración.
4.1.4.9. Exactitud
Según la ICH la exactitud de un procedimiento analítico expresa el acercamiento

entre el valor admitido como valor verdadero o como una referencia aceptada y el
valor encontrado [19]. También es llamada en algunos casos fidelidad. En el
54
POSTOBÓN S.A.
método de validación se busca con el cálculo de la exactitud valorar

conjuntamente los efectos sistemáticos y aleatorios, y está muy ligado con la
precisión, incluso algunos autores [3] dividen la exactitud en dos componentes:
fidelidad y precisión. Para no crear confusiones, en este estudio se tomará la
exactitud como fidelidad o trueness y la precisión será un factor independiente,
aunque no aislado.
Se recomienda que la exactitud se calcule después de que la precisión, linealidad

y especifidad hayan sido establecidas.
Existen dos procedimientos en general para determinar la exactitud de un método.

El primero y más común es realizar la comparación contra un material de
referencia, que puede ser un estándar trazable, un placebo o una muestra con una
cantidad de analito conocida. El segundo método es comparar los resultados con
otra técnica aún más exacta o que por consenso común es referencia, este caso
se usa cuando no existen materiales de referencia certificados o trazables. En la
figura 7 se puede observar la anterior clasificación en forma de diagrama.
Material de
referencia o
analito puro
Valor de
Referencia
Placebo + analito
Exactitud
Muestra + analito
Método Validado
o de referencia
Figura 7. Procesos para cálculo de exactitud.
El uso de materiales de referencia o estándares está dado según los siguientes

criterios:
- Material de referencia o patrones certificados: se usan para validación de

métodos a largo plazo. Su uso no es extensivo.
- Estándares: utilizados en los cálculos de exactitud a corto plazo, verificaciones
y estudios no críticos.
Interpretación de la parcialidad o sesgo
La figura 8 muestra los dos componentes principales de la parcialidad en la

medición de una muestra, referida al laboratorio y al método como tal. La
parcialidad del método reside en el error sistemático inherente al mismo
55
POSTOBÓN S.A.
independiente del laboratorio que lo use. La parcialidad del laboratorio proviene de

los errores sistemáticos peculiares del laboratorio y la interpretación del método.
Figura 8. Componentes del sesgo en una medida
En la figura 8 la parcialidad de laboratorio y parcialidad del método se muestran

como si actuaran en la misma dirección, aunque se puede tener el caso contrario.
Cálculo de la exactitud
- Comparación con un valor de referencia
La exactitud normalmente es dada en términos de porcentaje de recuperación,

calculada como la razón entre el resultado y la cantidad conocida de analito
adicionada a la muestra o valor del patrón, aunque también puede expresarse solo
como la diferencia entre ambos valores. La ICH recomienda usar más de 9
mediciones en un mínimo de 3 niveles de concentración dentro del rango
específico, es decir, un mínimo de 3 determinaciones por cada nivel [19]. Se debe
calcular entonces el promedio de las mediciones de una misma concentración y su
respectiva desviación estándar, y usar este promedio en el cálculo de la
recuperación. Es de anotar que en ocasiones es difícil adquirir materiales o
soluciones de referencia a distintos niveles de concentración, cuando esto suceda
se deben realizar los análisis en la mayor cantidad de concentraciones posibles.
En el análisis de exactitud respecto a un valor referencia se pueden usar tres tipos

de muestra:
o Método aplicado a un material de referencia o analito puro: se realizan

sucesivas mediciones y se realizan los cálculos de % de recuperación con
56
POSTOBÓN S.A.
la media. Si hay suficientes datos realizar una prueba de hipótesis para

comparación de media y un valor real.
o Método aplicado a un placebo: se prepara un placebo que contiene todos
los ingredientes menos el analito, es decir, que sea la misma matriz. A
este se agregan cantidades conocidas de analito, mínimo tres niveles y
tres repeticiones a cada uno. Se calcula la recuperación. Este método
puede presentar cierto grado de incertidumbre y constituye solo una
aproximación a la muestra en casos reales.
o Método de adición de patrón: este método se usa cuando no es posible
fabricar un placebo que no contenga el analito. En este caso una cantidad
conocida de este es adicionado a una muestra, se evalúan mínimo tres
niveles de concentración dentro del rango de trabajo y un mínimo de tres
réplicas. Se determina la concentración del analito inicial en la muestra y
la aportada por la cantidad agregada, se calcula la recuperación respecto
al valor teórico.
- Comparación con un método validado o de referencia [5]
En esta metodología se comparan los resultados obtenidos con el método

analítico que se quiere validar y los logrados con el método de referencia, cuya
exactitud esté bien determinada. Ambos métodos deben ser independientes.
Se realizan mediciones repetidas, un mínimo de 10 veces en cada nivel de

concentración, y al menos en tres concentraciones distintas dentro del rango de
trabajo. Calcular la recuperación de cada punto y realizar una prueba de hipótesis
para comparación de una media con un valor verdadero. Esto indicará si existen
diferencias entre ambos métodos y si la concentración influye en las mediciones.
Cuando hay suficientes niveles de concentración evaluados, más de 20, se puede

realizar la comparación con un análisis de regresión: en el eje 𝑥 (abscisas) se
representan los promedios de cada nivel de concentración hallados con el método
de referencia y en la ordenada los promedios encontrados para cada punto del
método a evaluar.
La línea resultante ideal es una recta de 45°, o en otras palabras una ecuación de
recta 𝑦 = 𝑥. La regresión se realiza en los puntos dados y se obtiene una ecuación
de la forma 𝑦 = 𝑏𝑥 + 𝑎
A partir de esto pueden evaluarse varios aspectos:
- Si la línea resultante es curva, los métodos conducen a resultados distintos y el

grado de diferencia es dependiente de la concentración.
- Si la pendiente de la línea es b = 1 o cercano a este, teniendo como criterio de
aceptación el intervalo de confianza calculado con la desviación estándar de la
57
POSTOBÓN S.A.
pendiente y un 𝛼 = 0,05 bilateral, indica que ambos métodos son

proporcionales.
- El intercepto con el eje debe ser a = 0, tener como criterio de aceptación el
intervalo de confianza calculado a partir de la desviación estándar del término
independiente y un 𝛼 = 0.05 bilateral.
- Cuando la pendiente y el término independiente están dentro de lo permitido,
se dice que los métodos son equivalentes.
Ecuaciones usadas en el cálculo de la exactitud:
Porcentaje de recuperación
𝑥𝑚
%𝑅 = (62)
𝜇
Diferencia o sesgo
𝑆𝑒𝑠𝑔𝑜 = 𝑥𝑚 − 𝜇 (63)
Donde,
𝑥𝑚 : es el promedio de las mediciones de una determinada concentración

𝜇: valor aceptado como verdadero
El cálculo de la regresión lineal se hace de la misma manera que en la sección

4.1.4.5.
Tabla 14. Procedimiento general para evaluar la exactitud
Análisis Repeticiones Cálculo Comentarios

Analizar la Un mínimo de 3 Promedio y El criterio de aceptación
muestra/referencia por veces por nivel, y 9 desviación depende mucho del tipo de
el método a validar determinaciones estándar por nivel análisis y uso que se le dé,
en total como de concentración. en general se acepta una
mínimo. recuperación de 100 ± 3 %
Si hay suficientes cuando se realizan con
datos realizar una materiales de referencia y
prueba de 100 ± 5 % con estándares.
hipótesis para la
media.
Comparación por
recuperación y
diferencia.
58
POSTOBÓN S.A.
Analizar la Un mínimo de 10 Promedio y Métodos independientes

muestra/referencia por veces por nivel. desviación tienen parcialidades por su
el método a validar y un estándar por nivel propia cuenta por lo tanto
método independiente de concentración. esta exactitud es relativa y
preferiblemente validado no absoluta.
o primario. Comparación por Métodos primarios
recuperación y idealmente no tienen
diferencia. Y parcialidad por lo que son
análisis de mejores para realizar las
regresión si hay medidas de exactitud.
suficientes datos Se tiene un criterio de
aceptación de 100 ± 5 %
Dar una medida
relativa de la
parcialidad del
método.
4.1.4.10. Incertidumbre
La incertidumbre se define como un "parámetro asociado al resultado de una

medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pueden ser atribuidos
razonablemente a lo que se mide" [20]
La incertidumbre de una medición puede estar asociada a muchas fuentes, entre

las principales se encuentran: el instrumento de medida, el objeto de medida o
mesurando, condiciones ambientales (humedad relativa, presión y temperatura) y
el analista. Estas incertidumbres se calculan realizando un análisis estadístico de
un conjunto de mediciones a condiciones controladas y/o a partir de otras fuentes
fiables como certificados y fenomenología del proceso de medición.
La incertidumbre es un parámetro asociado generalmente con la calidad de la

medición, y hace referencia a la duda que existe respecto al resultado de la
medición, pero no respecto a la validez del proceso de medida. Al contrario, el
conocimiento de la incertidumbre aumenta el nivel de confianza de la validez del
método.
Es de vital importancia no confundir el error o exactitud del método con su

incertidumbre, el error expresa la diferencia entre el valor medido y el valor
convencionalmente verdadero que se está midiendo, mientras que la
incertidumbre es la duda asociada al resultado.
La organización A2LA propone un procedimiento para estimar la incertidumbre en

laboratorios con la intención de facilitar la conformidad con la ISO/IEC 17025 [21].
La estimación de la incertidumbre puede realizarse bajo cuatro métodos generales
según las políticas de esta norma:
59
POSTOBÓN S.A.
- Pruebas cualitativas y semicuantitativas basadas en respuestas

continuas o cuantitativas.
- A partir de muestras control del laboratorio
- Usando datos provenientes de la validación
- Identificación de todos los componentes de incertidumbre
En el presente proyecto resulta práctico el uso de los análisis de muestras control

o datos derivados de la validación:
A partir de muestras control del laboratorio (MCL)
Existen ciertos requisitos que deben cumplirse para el uso de las muestras control
en el cálculo de la incertidumbre:
- Las MCL deben pasar por todos los pasos del método, entonces el
laboratorio puede usar la desviación estándar (𝑆𝐷𝑃 ) como una
precisión intermedia en el estimado de la incertidumbre estándar
combinada.
- Cuando las MCL no han sido corridas bajo todos los pasos del
método, el laboratorio debe incorporar los componentes adicionales
o consideraciones apropiadas en el cálculo de la incertidumbre
usando el método de sumas cuadradas y combinándola con el 𝑆𝐷𝑃 .
- Cuando se conoce que el método tiene un sesgo consistente y que
es inherente a este (por ejemplo, bajas recuperaciones en analitos
difíciles), el sesgo no debe añadirse a los cálculos de incertidumbre,
sin embargo debe quedar claramente establecido y reportado.
Se recomienda usar más de 20 datos individuales de MCL para estimar el 𝑆𝐷𝑃 . El

estimado de la incertidumbre combinada se expande usando la fórmula:
𝑈 = 𝑘 ∗ 𝑆𝐷𝑃 (64)
Donde 𝑘 (factor de cobertura) es igual a 2 (para 95 % de confianza) asumiendo

distribución normal.
Si se usan menos de 20 datos, el factor de cobertura estará dado en términos del

estadístico 𝑡 para un nivel de significancia del 95 % y a los respectivos grados de
libertad.
Si las muestras control se encuentran a diferentes concentraciones y agrupadas

en conjuntos, el estimado 𝑆𝐷𝑃 se calcula así:
𝑆𝐶𝑃 (𝑥 𝑖𝑗 −𝑥 𝑖 )2
𝑉𝑃 = = (65)
𝑛 𝑖 −𝑘 𝑛 𝑖 −𝑘
60
POSTOBÓN S.A.
𝑆𝐷𝑃 = 𝑉𝑃 (66)
Donde,
𝑉𝑃 : varianza de las muestras control

𝑆𝐶𝑃 : suma de cuadrados de cada grupo
𝑥𝑖 : promedio de un grupo de datos pertenecientes a una misma concentración o
de un ensayo en específico.
𝑖: número de grupo
𝑗: número de una réplica dentro de un grupo
𝑛𝑖 : número de réplicas en un grupo
𝑘: número de grupos o concentraciones
Se recomienda, además, para el uso de éste método de cálculo, demostrar la

competencia del laboratorio según las directrices descritas en el próximo apartado,
y haciendo en las ecuaciones 𝑆𝐷𝑃 = 𝑆𝐷𝑅 como estimado de la incertidumbre
estándar. Aunque no es estrictamente necesario si no hay datos de validación
disponibles.
Usando los datos provenientes de la validación
También es posible usar datos adquiridos en un proceso de validación, pero antes

el laboratorio debe demostrar su competencia con el método, tal y como lo
determinan los siguientes criterios.
El laboratorio debe reportar una desviación estándar para reproducibilidad

(interlaboratorios) o precisión intermedia (intralaboratorio), 𝑆𝐷𝑅 , como un estimado
de la incertidumbre estándar combinada bajo las siguientes condiciones:
- El estudio de validación debe incluir todas las fuentes de incertidumbre

(incluyendo preparación de la muestra y analistas diferentes)
- El laboratorio debe tener un sesgo aceptable.
- El laboratorio debe tener una repetibilidad aceptable.
Para demostrar la competencia con el método, el laboratorio debe calcular la

desviación estándar del laboratorio 𝑆𝐷𝐿 como la diferencia cuadrática entre
reproducibilidad y repetibilidad 𝑆𝐷𝑟 , del estudio de validación:
𝑆𝐷𝐿 = 𝑆𝐷𝑅 2 − 𝑆𝐷𝑟 2 (67)
61
POSTOBÓN S.A.
El laboratorio se considera competente si:
- Su sesgo debe es menor a 2 ∗ 𝑆𝐷𝐿

- La repetibilidad intra es menor a 𝐹 ∗ 𝑆𝐷𝑟 , donde 𝑆𝐷𝑟 es la repetibilidad dada
por un estudio colaborativo en caso de haberse realizado. 𝐹 debe tomarse de
una tabla estadística F usando los grados de libertad apropiados y bajo un 95
% de confianza, sin embargo, el laboratorio puede usar un estimado de 1.5.
Si el estudio de validación no incluye todos los pasos del método, entonces las
incertidumbres estándares de estos pasos deben añadirse al 𝑆𝐷𝑅 usando el
método de sumas cuadradas.
El estimado de la incertidumbre combinada (usualmente 𝑆𝐷𝑅 ) es expandido

usando la siguiente fórmula:
𝑈 = 𝑘 ∗ 𝑆𝐷𝑅 (68)
Donde 𝑘 (factor de cobertura) es igual a 2 (para 95 % de confianza) asumiendo

distribución normal.
4.2. EQUIPOS Y PRINCIPIOS DE FUNCIONAMIENTO
4.2.1. Densímetro: DMA 58 Anton Paar
4.2.1.1. Especificaciones y condiciones de operación del equipo
Tabla 15. Resumen de especificaciones del densímetro [22]
Propiedad Valor Comentario

Fabricante Anton Paar
Modelo DMA 58
3
Exactitud (Densidad) ± 0.00001 g/cm
Exactitud (°B) 0.01 °B
Rango de exactitud 3
0.5 - 1.5 g/cm
(densidad)
Los grados Brix corresponden a una
Rango de exactitud (°B) 0.00 - 0 - 79.3° B
densidad de 0.99829 y 1.40660 g/cm3
Rango de lectura 0 - 3 g/cm3
Precisión ± 0.000005 g/cm3
Tamaño de muestra 0.7 cm3
Rango de temperatura -10 a 70 °C
Precisión sensor de
± 0.01 °C
temperatura
Rango de presión 0 - 10 bars
Dígitos display 7 dígitos
Automuestreador 24 viales SP3 Anton Paar
62
POSTOBÓN S.A.
Tabla 16. Condiciones de operación del densímetro:
Temperatura ambiente 15 a 35 °C
Humedad relativa 10 a 90 %RH
Figura 9. Esquema del sistema para medir densidad
4.2.1.2. Teoría de operación [22]
El densímetro DMA 58 determina la densidad (masa dividida por volumen) de

líquidos y gases midiendo el período de oscilación electrónica. Para esto, la
muestra es introducida en un sistema el cual oscila y cuya frecuencia natural es
influenciada por la masa de la muestra. Este sistema está formado por un tubo en
U el cual es excitado por vibración oscilatoria por medios electrónicos (ver figura
10). El volumen de oscilación es limitado por los puntos de montaje los cuales
están fijos. Manteniendo el volumen constante entonces se asume que la masa de
la muestra es proporcional a su densidad. Si el oscilador es llenado mas allá de
los puntos de montaje no hay ningún efecto en la medición.
63
POSTOBÓN S.A.
Asumiendo que la temperatura es constante, generalmente 20.00 °C, la densidad

puede ser calculada a partir del periodo de oscilación considerando un cuerpo
hueco de masa m suspendida de un resorte de constante k. El volumen V del
cuerpo hueco se llena con la muestra de densidad ρ. La frecuencia natural del
sistema masa-resorte es:
1 𝑘
𝑓 = 2𝜋 (69)
𝑚 +𝜌𝑉
Y el periodo sería
𝑚 +𝜌𝑉
𝑇 = 2𝜋 (70)
𝑘
Despejando obtenemos
𝑘 𝑚
𝜌 = 𝑇 2 4𝜋 2 𝑉 − (71)
𝑉
Usando la abreviación
𝑘
𝐴 = 4𝜋 2 𝑉 (72)
𝑚
𝐵= (73)
𝑉
Se llega a
𝜌 = 𝐴𝑇 2 − 𝐵 (74)
Figura 10. Esquema del proceso de medición en un densímetro tipo tubo en U
Las constantes A y B incluyen la constante del resorte, la masa del tubo en U

vacío y el volumen de la muestra inyectada en el tubo. A y B son, por lo tanto,
64
POSTOBÓN S.A.
constantes propias del instrumento y dependen de cada oscilador. Estas

constantes pueden hallarse de las medidas de dos periodos cuando el oscilador
ha sido llenado con sustancias de densidad conocida, normalmente aire y agua.
Mientras más densa es la muestra, más amortiguadas son las oscilaciones. La
densidad de la muestra es, según la ecuación, inversamente proporcional al
cuadrado de la frecuencia de liberación, o en otras palabras proporcional al
cuadrado del periodo de oscilación.
Para el oscilador presente en el equipo DMA 58 la relación proporcional entre la

diferencia de densidad y la diferencia del cuadrado del periodo nos da una
exactitud de ±0.00001 g/cm3 para una densidad en el intervalo de 0.5 y 1.5 g/cm3
si las constantes fueron determinadas usando aire y agua. Se asocia un error
aleatorio o repetibilidad de ±0.000005 g/cm3.
Debido a que este instrumento no diferencia entre los tipos de sólido disueltos se
debe asegurar que la matriz no posea otras sustancias en proporciones relevantes
que aporten a la densidad de la muestra. Es por esto que en el densímetro sólo se
realiza medición a jarabes terminados de baja concentración o producto terminado
libre de CO2 y en ausencia de sólidos no disueltos. Otra característica derivada de
esta propiedad es que la escala para Brix es única tanto para directo como para
invertido.
4.2.1.3. Calibración
La calibración o determinación de las constantes A y B se efectúa con aire

deshumidificada y agua destilada. Se realizan dos verificaciones con estándares a
12.00 °B directo y 12.63 °B invertido.
El procedimiento de calibración se realiza según lo descrito en el manual del

equipo. La calibración a una temperatura en particular es válida para 100 días.
Densidad del aire:
La densidad del aire en g/cm3 depende principalmente de la presión en mbar y

temperatura en °C.
A t °C y p Torr la densidad se calcula usando:

0.0012930 p
ρ = 1+0.00367 t 760 = g/cm3 (75)
Este cálculo es válido para un contenido de CO2 en el aire de 0.03 % en volumen.
65
POSTOBÓN S.A.
Tabla 17. Composición del aire seco
N2 O2 Ar CO2 Ne He Kr X H2
-7 -5
%Volumen 78.09 20.95 0.93 0.03 0.0018 0.0005 0.0001 8 x 10 5 x 10
-5 -5 -4
%Masa 75.52 23.15 1.28 0.05 0.0013 7 x 10 0.0003 4 x 10 4 x 10
En el laboratorio central, con una presión 680 torr y una temperatura de 20 °C

controlada internamente en el equipo se obtiene:
𝜌𝑎𝑖𝑟𝑒 = 0.00101 𝑔/𝑐𝑚3 (76)
Densidad del agua:
La densidad del agua en kg/m3 depende en mayor medida de la temperatura, el

equipo controla la temperatura a 20.00 ± 0.01 °C por lo tanto a estas condiciones
se tiene:
𝜌𝑎𝑔𝑢𝑎 = 0.99820 𝑔/𝑐𝑚3 (77)
Cálculo de las constantes de calibración:
(𝜌 −𝜌 )
𝐴 = (𝑇 12 −𝑇22 ) (78)
1 2
(𝑇2 2 𝜌 1 −𝑇1 2 𝜌 2 )
𝐵= (79)
(𝑇1 2 −𝑇2 2 )
𝜌: densidad
𝑇: periodo
Los índices 1 y 2 indican el periodo o la densidad del primer y segundo estándar

respectivamente.
4.2.1.4. Conversión a grados Brix
Los densímetros dan la respuesta en valores de densidad. Los grados de Brix son
entonces derivados de tablas de sacarosa estándar, tales como las reportadas por
National Bureau of Standards (NBS) o actualmente National Institute of Standards
and Technology (NIST) [23]; y de ecuaciones de conversión desarrolladas a partir
de estas tablas, o para nuestro caso las disponibles en la normatividad interna de
POSTOBÓN S.A. [24]. El equipo posee un software interno que realiza esta
conversión.
66
POSTOBÓN S.A.
4.2.1.5. Posibles causas de error del instrumento
- Burbujas dentro de la muestra a medir

- El equipo recibe la luz del sol directa
- Error de calibración
- Iluminación de la celda de medida encendida
- Sedimentos dentro de la celda
- La muestra no llena los puntos de montaje del tubo U
- Calibración con sustancias coloidales o muestras coloidales
- Retener mucho tiempo muestras coloidales dentro del tubo
- Condensado debido a una alta humedad del aire y baja temperatura de la
celda
La medida de la densidad es afectada por la viscosidad de la muestra, sin

embargo el equipo DMA 58 tiene compensación por viscosidad, esta opción se
mantiene activa para todas las mediciones.
4.2.2. Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley
Éste refractómetro perteneciente a la serie RFM300 es un instrumento autónomo

y fácil de usar que puede emplearse en aplicaciones de laboratorio e industriales.
Dispone de un prensador abatible que puede colocarse sobre la muestra en el
prisma. El objetivo del prensador es forzar el contacto con las muestras,
mejorando las condiciones para la medición. Éste modelo está equipado con un
controlador de temperatura y una camisa interna de agua (ver figura 11) [25].
Figura 11. Esquema del lector para el refractómetro
67
POSTOBÓN S.A.
4.2.2.1. Especificaciones y condiciones de trabajo del equipo
Tabla 18. Resumen de especificaciones del refractómetro
Propiedad Valor Comentario

Fabricante Bellingham Stanley
Modelo RFM 340
Escala Índice de refracción 1.32 - 1.54
°B para azúcar 0 - 95
Resolución IR 0.00001
Resolución °B 0.01
Precisión IR ± 0.00003
Precisión °B ± 0.03
Exactitud °B ± 0.03
Tipo de prensador Poliacetilo
Tiempo de lectura Mínimo 4 segundos
Intervalo de temperatura ambiente 0 - 40 °C
Precisión sensor de temperatura ± 0.03 °C
Estabilidad de temperatura ± 0.05 °C
Material Prisma Zafiro artificial
IR Prisma 1.7686
Compensación automática de
5 - 70 °C Activa
temperatura
Ninguna Ninguna para análisis en laboratorio
Comprobación de estabilidad de Tiempo de retardo central
temperatura Repetibilidad Tiempo de retardo para análisis en
inteligente línea
Intervalo de humedad ambiente < 80 %RH
Prisma Se activa la medición de temperatura
Sonda de temperatura
Prensador por el prisma.
4.2.2.2. Teoría de operación [26, 27]
La luz viaja en el vacío a casi 300 000 km/s, sin embargo, esta baja su velocidad
en medios transparentes tales como aire, agua y vidrio. La proporción por la cual
disminuye su velocidad se conoce como el índice de refracción del medio, y es
siempre mayor que la unidad. El índice de refracción se denota como n.
n = (Velocidad de la luz en el vacío) / (Velocidad de la luz en la sustancia) (80)
Tabla 19. Relación entre algunos medios y el índice de refracción
Medio Índice de refracción Velocidad de la luz

en el medio
Vacío 1.0000 299792 km/s
Aire 1.0003 299703 km/s
Hielo 1.31 228849 km/s
Agua 1.33 225408 km/s
Vidrio 1.50 199862 km/s
68
POSTOBÓN S.A.
Un refractómetro es un aparato de medición diseñado para determinar esta

variación en la velocidad de la luz. Para visualizar cómo se mide el índice de
refracción podemos considerar lo siguiente:
Primero se debe visualizar la luz como rayos. Cuando estos rayos al emerger del
agua alcanzan el aire, cambiará su dirección, o en otras palabras son refractados.
Los rayos de luz también serán parcialmente reflejados.
Este cambio de dirección también puede ser observado de manera inversa cuando
la luz ingresa al agua viniendo de aire, en este caso los rayos son refractados
desde el "lado del aire".
Como se observa en la figura 12, la luz incidente corta este círculo a una distancia
b de la luz normal reflejada a una distancia a.
Figura 12. Geometría de la refracción
Si el ángulo bajo el cual la luz alcanza la superficie del agua cambia, b cambiará,
así como también a, pero su razón no lo hará:
a/b = Constante (81)
Para la luz amarilla a 20 °C esta constante es 1.333.
De lo indicado arriba se puede ver que b tiene un máximo a un punto específico.

Si los rayos de luz que emergen del agua golpean la superficie de frontera en un
ángulo aún más bajo, no serán refractados, sino completamente reflejados.
69
POSTOBÓN S.A.
En la figura 13 se pueden ver los efectos de los rayos de luz golpeando la

superficie de frontera en ángulos diferentes.
Figura 13. Esquema de refracción a distintos ángulos
En esta figura se pueden ver nueve rayos. Cinco de estos son parcialmente
reflejados y parcialmente refractados, los otros son totalmente reflejados. Debido a
esto existe una línea de frontera (línea roja) entre lo brillante, área totalmente
reflejada, y lo no tan brillante, área parcialmente reflejada. Esta línea de frontera
describe un ángulo específico, que se conoce como ángulo crítico de reflexión
total. El valor de este ángulo crítico depende de los índices de refracción de los
dos materiales.
Matemáticamente esta relación es descrita por la ley de Snell que, en vez de las
líneas a y b, usa los ángulos 𝛼1 y 𝛼2 con respecto a la normal respectivamente. En
ésta ley los índices de refracción en los dos medios 𝑛1 y 𝑛2 son incluidos:
𝑛1 ∗ 𝑠𝑒𝑛 𝛼1 = 𝑛2 ∗ 𝑠𝑒𝑛(𝛼2 ) (82)
Lo siguiente aplica al ángulo crítico:
𝛼𝐺 = 𝑠𝑒𝑛−1 (𝑛1 /𝑛2 ) (83)
La constante indicada arriba para luz viajando de agua a aire, representa la

relación entre los índices de refracción de agua y aire. A partir de la fórmula puede
verse que una reflexión total solamente ocurrirá si la luz ingresa a un medio con un
70
POSTOBÓN S.A.
índice de refracción más bajo (el seno inverso no está definido para valores
mayores que uno) [27].
La mayoría de los refractómetros se basan en el efecto del ángulo crítico, que

define el punto de equilibrio o límite de sombra entre la refracción y el reflejo
interno total de la luz en una interfaz prisma/muestra. El índice de refracción deriva
de la geometría de la vía óptica y el índice de refracción del material del prisma.
Los refractómetros automáticos usan un circuito integrado de luz (una matriz de
autobarrido, ver figura 14) para detectar la posición exacta del límite [28].
Figura 14. Esquema de medición en un refractómetro con autobarrido
El índice de refracción aumenta con los sólidos disueltos totales, por lo tanto
cualquier sustancia disuelta (azúcar, sal, ácido) contribuirá en el índice de
refracción. Los sólidos insolubles, tales como pulpas o polvo de té no contribuirán
significativamente al índice de refracción. En la figura 15 se aprecia claramente el
fenómeno en un caso muy común.
Figura 15. Efecto de la concentración de azúcar en el índice de refracción

71
POSTOBÓN S.A.
Efecto de la temperatura: para medir Brix, es esencial que la dependencia con la

temperatura se tome en consideración. Una solución de 30 g de sacarosa en 100
g de solución tiene la misma concentración en azúcar tanto a 20 °C como a 40 °C.
Por esta razón la solución debería dar 30 Brix, independiente de la temperatura.
Pero como los índices de refracción cambian con la temperatura, una escala de
Brix también debe tomar en cuenta la temperatura para poder calcular el valor
correcto. Por obvias razones, establecer un valor de Brix "no corregido por
temperatura" no tiene sentido, ya que depende de la temperatura de referencia.
Por lo tanto, para mediciones exactas, la corrección por temperatura es muy
importante.
Existen tablas reportadas por ICUMSA que muestran la corrección que se debe
realizar al efectuar la lectura a una temperatura distinta de 20 °C, en un rango de
15 °C a 40 °C [29]. Por extrapolación se pueden obtener una corrección incluso
para 10 °C. Los materiales de referencia usualmente vienen con certificados que
reportan valores para el índice de refracción y grados Brix a varias temperaturas,
como ejemplo se pueden observar las tablas de los patrones usados en este
estudio (anexo B)
4.2.2.3. Calibración
El equipo tiene la opción de realizar calibraciones con uno o dos puntos,

normalmente los valores zero y span. El valor zero corresponde al valor de 0 °B en
este caso agua destilada que posee un índice de refracción de 1.333. El span por
lo general es un valor que cubre el rango de medición en el cual se realizarán las
mediciones, generalmente 12 °B directo o 12.63 °B invertido para lectura de
gaseosas y producto terminado, y 60 °B en el caso de lectura en jarabes o
producto semi-terminado
4.2.2.4. Conversión de unidades
La respuesta del refractómetro está dada como índice de refracción asociada a

una temperatura por compensación. Esta lectura la convierte a grados Brix directo
o invertido dependiendo de la escala a la cual se desea imprimir en la pantalla del
refractómetro. Esta conversión la realiza usando polinomios de grado 5.
𝑢 = 𝐴 + 𝐵𝑥 + 𝐶𝑥 2 + 𝐷𝑥 3 + 𝐸𝑥 4 + 𝐹𝑥 5 (84)
Donde
𝑢: lectura en unidades definidas por el usuario
𝑥: índice de refracción – 1.33
A, B, C, D, E, F: constantes polinómicas
72
POSTOBÓN S.A.
- Grados Brix directo a partir de un índice de refracción a 20 °C
El instrumento tiene incorporado su propia tabla de conversión y no es posible

observar las constantes polinómicas que usa, sin embargo se ha comprobado que
la conversión es equivalente a la tabla dada por AOAC 2005 Apéndice C, p 78:
concentración de sacarosa acuosa como función del índice de refracción medida a
20 °C [7].
- Grados Brix Invertido a partir de un índice de refracción a 20 °C
Se han ingresado manualmente los parámetros expuestos en la tabla 20 para

dicho polinomio, este arroja resultados equivalentes a los datos reportados por
ICUMSA [30].
Tabla 20. Coeficientes para regresión polinómica de grados Brix invertido a partir del índice de
refracción
Constante Valor
A -2.12283
B 715.89
C -1813.93
D 5412.71
E -12959.5
F 20235.6
4.2.2.5. Posibles causas de error del instrumento
- Prisma en mal estado: rayado, empañado, roto.

- Compensación por temperatura desactivado
- Poco tiempo para estabilizar la temperatura
- Desecador en mal estado
- Realizar lecturas con mucho tiempo de retardo, especialmente si tiene sólidos
no disueltos.
- Error de calibración
- Matriz con alto contenido de sólidos no disueltos o muy heterogénea.
4.3. EL AZÚCAR
4.3.1. Definición
El término azúcar o azúcares en el ámbito industrial y científico se usa para

designar los distintos monosacáridos y disacáridos, que generalmente tienen
sabor dulce, y en ocasiones designa a cualquier tipo de carbohidrato soluble en
73
POSTOBÓN S.A.
agua. Por convención en el presente estudio se define el azúcar como el

disacárido conformado por alfa-glucosa y beta-fructosa unidos por un enlace
glicósido, o sacarosa.
4.3.2. Propiedades fisicoquímicas y composición
Su nombre químico es β-D-fructofuranosil-(2→1)-α-D-glucopiranósido con fórmula

molecular C12H22O11. Es un azúcar no reductor y por lo tanto no reacciona con el
reactivo de Fehling o el reactivo de Tollens.
La sacarosa se presenta generalmente como un polvo fino, blanco, inodoro y

cristalino de un sabor dulce agradable. Se aísla generalmente de fuentes naturales
sin embargo su síntesis química fue alcanzada por primera vez en 1953 por
Raymond Lemieux [31].
La sacarosa es un producto intermedio principal de la fotosíntesis, en muchas
plantas constituye la forma principal de transporte de azúcar desde las hojas a
otras partes de la planta. En las semillas germinadas de plantas, las grasas y
proteínas almacenadas se convierten en sacarosa para su transporte a partir de la
planta en desarrollo.
La sacarosa es estable al aire pero en polvo se torna higroscópica, absorbiendo

hasta el 1 % de humedad. Es fermentable a concentraciones altas (aprox. 17 % en
peso), resiste a la descomposición bacteriana. Funde a 186 °C para formar
caramelo y al hacer combustión produce carbón, dióxido de carbono, y agua.
Glucosa Fructosa
Figura 16. Estructura química de la sacarosa
Peso molecular: 342.296 g/mol

Densidad: 1.587 g/cm³, estado sólido
Solubilidad en agua: 203.9 g/100 mL (20 °C)
4.3.3. Usos comerciales y producción
La sacarosa es el edulcorante más extendido industrialmente, aunque en los

últimos años ha sido reemplazado en parte por otros que tienen un mayor poder
endulzante y son de bajas calorías. Es usada principalmente en la industria de
alimentos debido a su poder endulzante y sus propiedades funcionales; es
74
POSTOBÓN S.A.
importante en la preparación de muchos productos alimenticios, como dulces,

bebidas, tortas, entre otros. También ayuda en la preservación de los alimentos.
En la nutrición humana, la sacarosa es asimilada fácilmente como macronutriente

que proporciona una rápida fuente de energía para el cuerpo, y provoca un rápido
incremento en los niveles de glucosa en la sangre con su ingestión. Su consumo
excesivo está ligado a algunos efectos adversos, como la caries dental y caída de
dientes.
La sacarosa es el principal azúcar presente en los vegetales, se extrae

generalmente de la caña de azúcar (Saccharum officinarum L) la cual tiene entre 8
y 15 % de sacarosa, o de la remolacha azucarera (Beta vulgaris L). El jugo
obtenido de la molienda de la caña se concentra y cristaliza al evaporarse el agua
por calentamiento. Los cristales formados son el azúcar crudo o, de ser lavados, el
azúcar blanco. En las refinerías el azúcar crudo es disuelto, limpiado y cristalizado
de nuevo para producir el azúcar refinado [26].
Tipos de azúcar [24].
El azúcar se clasifica generalmente por su grado de refinamiento el cual,

generalmente, se expresa de manera visual debido al color característico que
presenta. El color está relacionado indirectamente con el porcentaje de sacarosa
que contienen los cristales.
- Azúcar moreno: se obtiene de la caña de azúcar, en su producción no se

somete a refinación, solo es cristalizado y centrifugado. Su color se debe a una
capa de melaza que cubre los cristales de azúcar. Tiene entre 96 a 98 % de
sacarosa.
- Azúcar rubio: es más claro que el azúcar moreno, y tiene un porcentaje mayor
de sacarosa.
- Azúcar blanco: tiene 99.5 % de sacarosa, también se le denominada azúcar

sulfitado.
- Azúcar refinado o extrablanco: es altamente puro y tiene entre 99.8 a 99.9 %

de sacarosa. No es tan integral como el azúcar rubio o blanco, ya que en su
proceso de refinamiento se desechan algunos nutrientes complementarios
como minerales y vitaminas, que son consideradas impurezas.
- Azúcar de licor fino: corresponde al obtenido en el primer ciclo en el proceso de

producción del azúcar refinado, y no se somete a recirculación a diferencia de
éste último. Tiene una mayor pureza ya que presenta menor cantidad de
cenizas sulfatadas y tiene mejores propiedades fisicoquímicas.
75
POSTOBÓN S.A.
Usos del azúcar en Postobón S.A. [24]:
- Azúcar blanco: se usa como edulcorante en la preparación de refrescos de

fruta.
- Azúcar refinado: usado como edulcorante en la elaboración de gaseosas
- Azúcar de licor fino: componente utilizado en hidratantes y té.
4.4. BRIX
4.4.1. Generalidades
Brix es uno de los parámetros más importantes encontrados en la industria de

bebidas. De forma estricta el Brix es usado para indicar la cantidad de sólidos
disueltos en una solución. En la industria de bebidas, es usado específicamente
para cuantificar la cantidad de azúcar en una bebida, jarabe o refresco.
La escala de Brix fue establecida en el siglo XIX por el químico alemán A.F.W.
Brix. Él encontró que al sumergir un hidrómetro en un jugo de fruta, se podía
conocer, a partir de su densidad, el porcentaje de azúcar presente en el jugo.
En este estudio se define Brix como el porcentaje peso-peso de azúcar disuelta en

una solución acuosa y se expresa como grados Brix (°B). Por ejemplo, una
solución de 10 °B implica que una solución de 100 g tiene 10 g de azúcar disuelta.
Es de aclarar, que en una bebida gaseosa o refresco, hay, además del azúcar,
otros sólidos disueltos. Sin embargo, estos se encuentran en pequeñas cantidades
si la comparamos con el contenido de azúcar, aunque contribuyen ligeramente en
la medición de grados Brix. Por conveniencia se considera que esta contribución
también es debida al azúcar, el error asociado individualmente a los otros
componentes disueltos para las distintas formulaciones se acepta sobre una base
universal y es ignorado en la mayoría de los casos, además los parámetros
definidos para los productos como tal se reportan incluyendo esta desviación
causada por otros componentes disueltos. En conclusión, para el análisis como tal
de grados Brix, en el ámbito industrial, se asume que la bebida es una solución
pura de sacarosa en agua [32].
Las bebidas gaseosas tienen un rango de Brix típico entre 8 y 14 °B, sin embargo
para su preparación es necesario el uso de soluciones concentradas denominadas
jarabes. En el proceso se hace distinción entre jarabe simple y jarabe terminado.
El jarabe simple es aquella solución madre que posee solo azúcar y agua, y tiene
aproximadamente 61 °B; esta es usada, por medio de una dilución para obtener el
jarabe terminado el cual tiene además de azúcar el resto de componentes propios
de un producto, excepto gas carbónico. Este tipo de jarabe, aún concentrado,
tiene un Brix que depende de la huella técnica del producto y su rango típico es
entre 35 y 60 °B.
76
POSTOBÓN S.A.
4.4.2. Medición de grados Brix
Existe gran variedad de formas para medir la cantidad de sacarosa en solución y

expresarla en término de unidades grados Brix, entre las técnicas más comunes
están la densimetría, en los cual se puede usar tanto un densitómetro,
termohidrómetro o picnómetro; la refractometría, polarimetría o titulación inversa
con el reactivo de Fehling, entre otras.
En Postobón S.A. se encuentra normalizado el método de determinación de

grados Brix por densimetría y refractometría [24], debido a su practicidad y gran
precisión y exactitud. La medición se describe para tres equipos en específico:
densitómetro, refractómetro y termohidrómetro.
La medición por termohidrómetro fue la técnica pionera en este tipo de medición,

sin embargo, actualmente es considerada obsoleta y no es usada en condiciones
normales. Es descrita en la norma como método alternativo y por el bajo costo de
los equipos necesarios para su medición. Esta técnica posee ciertas desventajas
prácticas como la fragilidad del hidrómetro, el cual está fabricado de vidrio y
necesita ser calibrado periódicamente y con mucha exactitud. El procedimiento
para leer Brix con este instrumento en ocasiones es difícil y requiere tiempo, y no
puede ser automatizado, además la lectura visual tiene asociado un error que
depende del operario, en muchas ocasiones tres o más personas no coinciden en
la lectura. El hidrómetro no es costoso y puede usarse de forma alternativa cuando
no es posible realizar las lecturas con otros equipos.
La AOAC International también recomienda el método volumétrico Lane-Eynon [9],

en éste se usa la solución de Fehling titulada con una solución de azúcar
previamente invertido (muestra), ya que la sacarosa como tal no es un azúcar
reductor mientras que los derivados de su inversión si lo son (este concepto se
aclarará en la siguiente sección). Esta técnica es usada principalmente para
análisis de soluciones con baja concentración de azúcar, alrededor de 9,5 g por
litro (aprox. 1 °B). Debido a que es una titulación inversa la calidad de la medición
disminuye con el aumento de la concentración de sacarosa invertida presente en
la solución, el procedimiento como tal es difícil y los cálculos descritos en la norma
AOAC no expresan el resultado en grados Brix.
El uso de densímetro y refractómetros y su principio de funcionamiento ya han

sido expuestos en la sección 4.2.1. y 4.2.2., respectivamente.
77
POSTOBÓN S.A.
4.4.3. Uso de grados Brix en la industria
El azúcar, después del agua, es el componente natural más usado en la

fabricación de bebidas azucaradas, puede alcanzar concentraciones de 13 °B en
la bebida final, y da su característico sabor dulce. En conjunto con otros
ingredientes, la cantidad de azúcar determina el perfil de la bebida y es parte
importante en la caracterización por parte del consumidor. Por lo tanto cualquier
desviación significativa en el contenido de azúcar podría resultar en un bajo nivel
de aceptación por parte del consumidor, la principal pesadilla de cualquier
organización en el mercado.
Es por esto que los grados Brix deben ser constantemente monitoreados y
controlados en la línea de producción, que en ocasiones involucra un gran flujo de
solución de sacarosa envasada usando llenadores a alta velocidad en cientos de
botellas por minuto. El control de los grados Brix tiene que ser por lo tanto de gran
precisión y la desviación de la concentración objetivo debe ser mínima. Tales
desviaciones afectan tanto la calidad del producto como el rendimiento en la
producción, y ambas, a la vez, afectan negativamente los costos totales.
4.5. INVERSIÓN DEL AZÚCAR
4.5.1. Generalidades
El propósito de la inversión es dividir la molécula de sacarosa (disacárido) para

formar una de glucosa y otra de fructosa (monosacáridos). Para romper el enlace
que une estas dos moléculas se requiere de una hidrólisis, en este proceso
químico una molécula de agua rompe el enlace y se une a las moléculas
derivadas. Para una solución de sacarosa la hidrólisis requiere medio ácido y
calentamiento, mientras más bajo sea el pH más rápida será la reacción. La
reacción que ocurre bajo estas condiciones es la siguiente [32]:
𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 +∆
𝐶12 𝐻22 𝑂11 + 𝐻2 𝑂 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 𝐶6 𝐻12 𝑂6 (85)
𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑔𝑢𝑎 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎
𝑔
342,3 18,0 180,6 180,6
𝑚𝑜𝑙
78
POSTOBÓN S.A.
Figura 17. Representación esquemática de la reacción de inversión
Cuando el agua entra en reacción se divide en dos componentes el hidrógeno (H)

y el hidroxilo (OH), estos rompen el enlace del oxígeno que une las dos unidades
monosacáridas. El hidrógeno se combina con el oxígeno para formar glucosa en
su configuración regular, mientras el radical OH se combina con el átomo de
carbono libre.
Expresando la reacción en forma de pesos moleculares, tenemos que 342.3 g de

sacarosa reaccionan con 18.0 g de agua para formar un total de 180.6 g x 2 =
360.2 g de mezcla glucosa/fructosa. Esto significa que si partimos de una cantidad
conocida de 342.3 g de sacarosa en solución acuosa al invertir obtenemos un
peso extra de 18 g de azúcar pero ahora en forma de dos monosacáridos: glucosa
y fructosa.
Si la reacción anterior toma lugar en una cantidad X g de solución total (sacarosa

+ agua), esto significa que después de la reacción habrán 18 g más de sólidos
disueltos en la misma cantidad X g de solución. El incremento de sólidos puede
ser expresado como un factor de 360.32 g finales / 342.3 g iniciales = 1.0526, en
otras palabras, se puede esperar que el Brix después de la inversión aumente en
5.26 %.
79
POSTOBÓN S.A.
La hidrólisis ácida con calentamiento que causa este aumento en los grados Brix
se denomina inversión de azúcar y se expresa como Brix invertido. Cuando el
análisis se realiza sin la inversión y usando soluciones de sacarosa recién
preparadas y/o almacenadas a condiciones especiales, es decir, refrigeradas y en
un medio no ácido, se asume que la sacarosa no ha sufrido la inversión y por lo
tanto la medición se expresa como Brix directo. Por lo anterior, el Brix de una
solución totalmente invertida es 5.26 % mayor que su lectura como Brix directo.
En la industria, se define como Brix fresco el valor de Brix de un producto en el

momento de su preparación, debido a que este valor usualmente corresponde al
valor teórico calculado del total de sólidos disueltos en el producto. El Brix fresco
por tanto implica la no inversión y se registra como Brix directo.
El Brix invertido, en cambio, es el valor de un producto en el cual la sacarosa se

ha convertido totalmente en glucosa y fructosa, técnicamente se debería llamar
Brix invertido total, sin embargo, en el argot industrial se le designa llanamente
"Brix invertido".
4.5.2. Química de la inversión del azúcar
Las soluciones de azúcar tienen la propiedad de rotar el plano de la luz polarizada

en sentido horario (derecha) o anti-horario (izquierda), la glucosa por ejemplo rota
la luz en sentido horario y se define como dextrógiro, si el giro es hacia la
izquierda, como pasa con la fructosa, se denomina levógira. La reacción de
inversión se expone a continuación con los respectivos ángulos de rotación de los
azúcares involucrados para aclarar este fenómeno:
𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑔𝑢𝑎 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑎 (86)
𝛼 = 66.5° 𝛼 = 52.7° 𝛼 = −92.4°
El ángulo de rotación (α) o rotación específica es el ángulo formado por el plano

de la luz polarizada sobre la horizontal y es característico de cada azúcar, si el
ángulo es levógiro se denota por un signo menos (-).
La reacción muestra pues que la sacarosa y la glucosa son azúcares dextrógiras,

mientras la fructosa es levógira, después de la inversión la glucosa y fructosa
quedan en relación 50/50 %, la mezcla entonces tiene un ángulo de rotación que
debería ser la suma de los efectos de cada monosacárido. Como la rotación
levógira de la fructosa es mayor que la aportada por la glucosa, la solución final
tendrá una rotación levógira, en conclusión el término "invertido" se deriva del
cambio de la dirección de la rotación de la luz polarizada que ocurre después de
invertir el azúcar. Por lo tanto el azúcar invertido no es más que una mezcla
glucosa/fructosa producto de la inversión de la sacarosa.
80
POSTOBÓN S.A.
4.5.3. Cinética de la inversión
A condiciones normales cuando el agua está en exceso, la reacción entre la

sacarosa y el agua puede interpretarse como una reacción unimolecular
(pseudounimolecular). Suponiendo esto, la velocidad de inversión es:
𝑑𝐶
= 𝑘𝐶 (87)
𝑑𝑡
Donde 𝐶 es la concentración actual de la sacarosa, 𝑘 la constante de velocidad y 𝑡

el tiempo. La constante de velocidad puede medirse por el cambio en el ángulo de
rotación durante el proceso, así:
1 𝑅0 −𝑅∞
𝑘 = 𝑡 ln (88)
𝑅𝑡 −𝑅∞
Donde 𝑅0 y 𝑅∞ son, la rotación inicial y final respectivamente, y 𝑅𝑡 es la rotación

en el tiempo dado. Algunos experimentos muestran que la constante de velocidad
no es independiente de la concentración de sacarosa, ésta incrementa levemente
cuando la concentración aumenta.
La constante de velocidad depende de la temperatura según la siguiente relación:
𝑑 𝐿𝑜𝑔 (𝐾) 𝑄
= 𝑅𝑇 2 (89)
𝑑𝑡
En donde 𝑄 representa la energía de activación, 𝑅 la constante de gases y 𝑇 la

temperatura absoluta. La energía de activación se ha calculado como 25.9 kcal a
20 °C, y disminuye débilmente con el incremento en la temperatura.
Además, 𝑘 depende de la concentración de hidrogeniones (H3O+). En pequeñas

concentraciones de H3O+ (menor a 0.01 M o pH mayor a 2) 𝑘 es proporcional a la
concentración de hidrogeniones. Para concentraciones H3O+ mayores 𝑘
incrementa aún más que de la forma proporcional.
No obstante, para el cálculo de la cantidad de sacarosa invertida se puede recurrir

a la tabla 21 que contiene datos reportados por Jackson-Gillis y relaciona la
temperatura con la constante de velocidad de la reacción y el tiempo aproximado
para alcanzar un 99.99 % de inversión, o la figura 18 donde se representa el
diagrama de King-Jison, el cual relaciona por medio de varias curvas el pH, la
temperatura y el porcentaje en peso-volumen de sacarosa invertida [33].
81
POSTOBÓN S.A.
Tabla 21. Tabla Jackson-Gillis
Temperatura (°C) Constante de velocidad 𝒌 a Tiempo para el 99,99 % de inversión

pH=2 (horas)
20 0.000 018 99 3511
40 0.000 318 6 209
60 0.003 806 17.5
80 0.033 03 2.02
90 0.089 82 0.74
Figura 18. Diagrama King-Jison
4.5.4. El porqué de la lectura en Brix invertido
La sacarosa es el edulcorante más extendido en bebidas azucaradas. La mayoría

de bebidas producidas en Postobón S.A., con excepción de las bebidas tipo light,
usan sacarosa como endulzante y son saborizadas con varios tipos de ácidos
(fosfórico, cítrico y málico) en cantidades que dependen de su formulación; por lo
tanto son bebidas ácidas con pH generalmente en un rango de 2 a 4. Como tal,
tomará lugar cierto grado de inversión de sacarosa en estas bebidas,
incrementando la lectura del Brix. El grado de inversión depende de las
condiciones ambientales especialmente de la temperatura, el pH de la gaseosa, y
en mayor medida del tiempo. El Brix de bebidas preparadas y analizadas en la
línea de producción se expresa como Brix directo y está asociado a los
parámetros de calidad de producto en forma de Brix directo. Cuando la bebida
tiene cierto tiempo en el mercado o en stock, el proceso de inversión se empieza a
producir aumentando la medida de Brix en forma proporcional al grado de
inversión, con un máximo de 5.26 % respecto al Brix directo.
82
POSTOBÓN S.A.
En el ámbito cotidiano nunca encontraremos soluciones de sacarosa totalmente

invertidas, tanto en la fábrica como en el mercado, esto es porque para una
inversión completa se requieren altas temperaturas y bajo pH. En el laboratorio se
deben garantizar estas condiciones y de esta forma realizar la hidrólisis completa.
Esta práctica de invertir totalmente la solución a analizar, se realiza debido al

grado de dificultad para determinar el grado de inversión de un producto, que,
como se mencionaba anteriormente, depende de varios factores externos difíciles
de controlar o determinar. Es por esto que llevando las bebidas a su Brix invertido
total se asegura una mejor calidad en el análisis y permite, por tanto, comparar
muestras que pueden poseer distintos grados de inversión; además, el Brix fresco,
puede determinarse a partir del valor de Brix invertido dividiendo por el factor
1.0526.
83
POSTOBÓN S.A.
5. DESARROLLO DEL PROYECTO
5.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Día a día se realizan innumerables determinaciones en laboratorios de todo el

mundo, estas mediciones son necesarias en muchos campos de aplicación desde
el análisis de agua potable y bebidas en el caso de POSTOBÓN S.A., hasta
análisis médicos para diagnóstico de enfermedades. Virtualmente cada aspecto de
la sociedad y la vida cotidiana está soportado de alguna manera en mediciones
analíticas. Estas mediciones son usadas para tomar decisiones, que pueden tener
repercusiones de alto o bajo grado. Se observa claramente la importancia de
determinar si los resultados obtenidos son fiables y a la vez establecer hasta qué
punto se puede tener confianza de su exactitud. Sin embargo, este nivel de
certidumbre no es determinado sólo por la exactitud del método, existen además
otros parámetros que ayudan a caracterizar su rendimiento y que aportan
información valiosa para su correcta ejecución e interpretación de resultados. El
proceso para obtener estos parámetros se denomina validación, que en cortas
palabras es el establecimiento de una base de datos experimental que certifica el
rendimiento de un método analítico.
El Laboratorio Central de POSTOBÓN S.A. es el encargado de realizar la

evaluación mensual de los centros productores por medio de un diagnóstico de su
competencia mediante la determinación de cantidad de producto dentro de
especificación; por esta razón todas sus mediciones deben estar debidamente
certificadas desde el punto de vista analítico, esto se logra con una adecuada
validación de los métodos usados. En este trabajo se presenta el proceso de
validación del método para la determinación de grados Brix en bebidas y jarabes;
dado el su uso extensivo de este método, tanto en los centros productores como
dentro del mismo Laboratorio Central, Adicionalmente los grados Brix son una
cualidad importante en el perfil de los productos.
5.2. HOMOLOGACIÓN
El objetivo primordial de esta etapa preliminar es establecer las diferencias

existentes entre los métodos aprobados y/o validados aportados por asociaciones,
normas estándar o manuales de calidad, y los existentes en la normativa
POSTOBÓN S.A.
84
POSTOBÓN S.A.
Este análisis comparativo se realizó para los métodos analíticos de mayor uso,
que se pueden clasificar en cuatro tipos de análisis:
- Fisicoquímico evaluación: son los ensayos realizados a producto terminado

procedente de las plantas, a los cuales se les evalúa sus características
fisicoquímicas, datos primordiales para establecer el índice de calidad de la
planta; actualmente este índice se expresa como porcentaje de unidades
dentro de parámetros.
- Fisicoquímico pureza: son aquellos análisis realizados a materias primas e

insumos con el objeto de determinar su pureza. Se usa extensivamente en la
recepción de materias primas, ya que de este análisis depende su aceptación o
rechazo.
- Fisicoquímico azúcar: aunque el azúcar es una materia prima, debido a su

grado de importancia hubo la necesidad de separarla de otros tipos de análisis.
Estos ensayos determinan trazas y la calidad fisicoquímica del azúcar.
- Fisicoquímico agua: son los ensayos realizados a las aguas procedentes de

pozos, agua industrial y aguas para consumo.
Normas usadas en el análisis comparativo de métodos:
- NTC 2740: bebidas no alcohólicas. Bebidas Gaseosas o carbonatadas [34]: los

métodos de interés reportados en esta norma citan la AOAC como fuente de
métodos, por lo tanto los métodos de AOAC y los aportados por la NTC se
consideran como una misma fuente.
- Official Methods of Analysis of AOAC international, 2006 [7]: usada

principalmente en los métodos de evaluación, azúcar y agua.
- USP 29 - NF 24 2006, Farmacopea de los Estados Unidos de América [35]:

usada en los métodos para determinación de pureza en materias primas.
- Normas PEPSICO 2004 [27]: Manual de calidad Volumen 2 Métodos

Analíticos. PEPSICO International: esta norma se usa en especial para los
métodos de evaluación, azúcar y agua.
- Normas Postobón SIAD [24]: Sistema de Administración Documental, son las

normas vigentes y las usadas en los centros productores de Postobón en todo
el país.
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POSTOBÓN S.A.
- Métodos Laboratorio Central [24]: métodos usados en el Laboratorio Central,

solo difieren en algunos casos con la norma Postobón SIAD, incluye aquellos
métodos en estudio o con modificaciones.
- Food Chemicals Codex 5th Edition [36]: métodos usados para el análisis de
pureza o trazas en materias primas. Contiene métodos muy similares a los
encontrados en la USP.
Aunque el análisis se efectuó de forma extensa, los métodos aportados por

PEPSICO son los que tienen mayor peso, y la homologación o disminución de
brechas se realiza teniendo en cuenta esta fuente como principal referente, en
caso de ser necesario se usan las otras fuentes y se ajusta el método de tal forma
que su ejecución cumpla los estándares citados, sea logísticamente viable y,
además, acorde a los recursos disponibles en los laboratorios. Es de anotar que
estos ajustes o modificaciones se realizan de manera interna y de forma
confidencial.
Ver anexo C: matriz de comparación de métodos.
5.3. VALIDACIÓN DEL MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE GRADOS

BRIX
El objetivo de esta validación, como se mencionó anteriormente, es demostrar la

aptitud o competencia del Laboratorio Central para la determinación de grados
Brix en bebidas y jarabes por el método de refractometría y densimetría, que
obedece a los requisitos regulados por la norma NTC-ISO 17025 en el numeral
5.4.5. sobre validación de métodos: „„el laboratorio debe validar los métodos no-
normalizados, los métodos diseñados/desarrollados por el laboratorio, los métodos
normalizados empleados por fuera del alcance propuesto, ampliaciones y
modificaciones de métodos normalizados a fin de confirmar que los métodos sean
los apropiados para el uso propuesto. La validación debe ser tan extensiva como
sea necesario para cumplir con todas las necesidades de la aplicación o campo de
aplicación determinados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el
procedimiento empleado para la validación y un informe en cuanto a la afinidad del
método para su uso propuesto‟‟ [37].
El método está descrito detalladamente en la norma BE1-06-3 presente en la

documentación privada de POSTOBÓN S.A [24].
5.3.1. Equipos y recursos usados en la validación
5.3.1.1. Instrumentos de análisis
- Densímetro: DMA 58 Anton Paar

- Refractómetro: RFM 340 Bellingham Stanley
86
POSTOBÓN S.A.
5.3.1.2. Equipos para preparación de muestra
Sonicor Ultrasonido SC-101
Se dispone de un ultrasonido Sonicor referencia SC-101 para realizar la

desgasificación y homogenización de las muestras que lo requieran,
especialmente mayores a 40 °B. El equipo no dispone de cronómetro ni
calentamiento.
Tabla 22. Resumen de especificaciones del ultrasonido
Propiedad Valor
Capacidad 1 galón
Output 100 watts
Dimensión tanque 9 x 5 x 6 (in)
Dimensión equipo 10.5 x 6 x 11 (in)
Para su uso se llena con 3.2 litro de agua destilada, o lo necesario según lo
requerido con un mínimo de 5 cm de nivel de agua.
Baño maría
Baño de maría Memmert AUM-500PD con control de temperatura en un rango de

25 a 100 °C.
Estación de desgasificación
Este equipo se usa para la desgasificación previa de bebidas gaseosas, posee 10

puestos de desgasificación por medio de burbujeo con aire y durante un tiempo
determinado a flujo y presión constante. El desgasificador está conformado por:
- Filtro de aire en línea

- Trampa de aceite
- Trampa de NaOH con fenolftaleína para absorción de CO2
- Trampa de humedad
- Fuente de aire
- Válvula
- Manómetro y medidor de flujo
- Tubo de inserción o difusor
87
POSTOBÓN S.A.
Condiciones de operación:
Todos los puestos de desgasificación deben ser usados. Para desgasificar menos
de 10 muestras, completar los puestos con recipientes llenos de agua.
Presión: 7.5 psi
Flujo de aire: 5.5 LPM O2
Volumen de muestra: 250 mL
Balanza analítica
Marca: Mettler-Toledo
Modelo: AB204
Clase de exactitud: clase 1
Precisión: 0.002 g
Rango: 0 – 120 g
Balanza
Marca: Mettler-Toledo
Modelo: PM4800
Clase de exactitud: clase 2
Precisión: 0.2 g
Rango: 0 – 4000 g
5.3.1.3. Reactivos
- Sacarosa grado reactivo

- HCl 2.5 N
- Etanol 95 %
- Aire a presión constante
- Agua destilada
- Fenolftaleína
- NaOH 0.1N
5.3.1.4. Recursos complementarios
- Tubos de ensayo de 30 ml con tapa rosca

- Gradillas metálicas para calentamiento
- Frasco lavador
- Probeta de 50 ml
- Viales para automuestreador densímetro de 50 ml
- Toallas de papel suaves, libres de hilo y pelusas
- Vasos desechables de 500 ml para desgasificación de bebidas
- Desecador para filtro de humedad del refractómetro
88
POSTOBÓN S.A.
5.3.2. Resumen del método para determinación de grados Brix
- Preparación de la muestra para Brix directo: se debe garantizar homogeneidad

de la muestra, ausencia de burbujas de aire y de CO2.
- Preparación de la muestra para Brix invertido:
- Al igual que la preparación para Brix directo se debe garantizar

homogeneidad de la muestra, ausencia de burbujas de aire y de
CO2.
- En un tubo de ensayo depositar aproximadamente 25 ml de muestra,
agregar 2 gotas de HCl a 2.5 N.
- Calentar a 100 ± 2 °C en baño maría durante 40 ± 2 minutos. Si es
necesario, corregir el tiempo de inversión por efecto de altitud. Para
el Laboratorio Central este tiempo es de 50 minutos.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Proceda a leer Brix invertido o directo (según la necesidad) en el equipo

disponible. Los jarabes y refrescos se leen exclusivamente en el refractómetro,
mientras que las bebidas gaseosas se pueden leer en ambos equipos.
Lectura en refractómetro:
- Realizar verificación de la calibración correspondiente (span y zero), aceptar

para una diferencia menor de 0.03 °B. Si no es aceptable, calibrar.
- Abrir y limpiar el prensador junto con el prisma con papel suave y alcohol.
- Depositar cantidad suficiente de muestra para tapar completamente el prisma,
aproximadamente 1.5 ml.
- Cerrar el prensador y realizar la lectura.
- Nota: si es necesario hacer lecturas con tiempo de espera para que la muestra
alcance la temperatura del equipo.
Lectura en el densímetro
- Realizar una verificación de la calibración, aceptar para una diferencia 0.00005

g/cm3 respecto al valor teórico y usando agua destilada, si no es aceptable
calibrar.
- Servir la muestra en un vial, previamente purgado con la muestra y proceder a
su lectura.
Rangos de trabajo: antes de proceder a cualquier análisis, se debe tener en

cuenta que rangos de trabajo estimados aplican:
89
POSTOBÓN S.A.
Las bebidas gaseosas poseen un Brix directo en un rango de 8 a 14 °B, en el caso

de Brix invertido este rango aumenta levemente. Las soluciones con alto contenido
de azúcar o jarabes, usadas dentro del proceso de producción, tienen un valor
cercano a 60 °B; estas las lecturas para jarabes se realizan únicamente en forma
de Brix directo ya que estas soluciones recién preparadas se usan
inmediatamente en la fabricación de bebidas. Por recomendación de fabricante,
Anton-Paar, no se recomiendan lecturas de muestras con alto contenido de azúcar
en el densímetro debido a su alta viscosidad, por esto las lecturas en Brix directo
para jarabes se realizan exclusivamente en el refractómetro. Las lecturas en Brix
invertido se pueden hacer tanto en el refractómetro como en el densímetro
abarcando un rango correspondiente al producto terminado que oscila entre 8 y 14
°B.
5.3.3. Clasificación del método
El método para determinación de grados Brix se encuentra estandarizado en la

norma PEPSICO TM200.009 (densimetría) y TM200.010 (refractometría), la cual a
su vez es similar a la reportada por la AOAC International 932.14. POSTOBÓN
S.A. adecuó este método a sus necesidades y lo reguló en la norma BE1-06-3.
El método para determinación de grados Brix por lo tanto es del tipo normalizado
con modificaciones y entra en la categoría I ya que cuantifica un componente
mayoritario: sólidos disueltos (sacarosa).
5.3.4. Parámetros a validar y criterios de aceptación
Debido a que el método para análisis de grados Brix se encuentra actualmente

normalizado por instituciones de referencia, no es necesario evaluar todos los
parámetros, sin embargo, debido a que el presente trabajo será usado para
realizar el protocolo de validación de posteriores métodos, se requiere evaluar
tantos parámetros como sea posibles, y estos, según los lineamientos de la tabla 3
(parámetros a evaluar según la categoría del método) son:
- Robustez
- Selectividad/especifidad
- Linealidad
- Intervalo de trabajo (rango)
- Sensibilidad
- Precisión:
- Repetibilidad
- Exactitud
- Incertidumbre
90
POSTOBÓN S.A.
Como se puede observar, los límites de cuantificación y detección no se evalúan,

porque el compuesto a medir es el componente mayoritario en las soluciones y por
tanto no se espera que esté a bajas concentraciones.
El estudio comparativo o interlaboratorio, también necesario para el cálculo de la
reproducibilidad, se realizará en posteriores estudios ya que su ejecución excede
el alcance del presente proyecto.
Criterios de aceptación
- Robustez: se debe determinar el rango de trabajo en los cuales los efectos no

sean significativos, juicio obtenido de la prueba t usando una desviación
estándar de 0.03 °B como máximo valor de variabilidad significativa.
- Selectividad/especifidad: se debe obtener para los placebos o muestras

preparas una especifidad mayor a 0.90.
- Linealidad: como primer criterio el coeficiente de correlación mayor a 0.999,

además debe superar la prueba de la ANOVA de regresión lineal y la
significancia de la pendiente e intercepto.
- Intervalo de trabajo (Rango): se define el rango de trabajo como aquel donde

el sesgo sea menor a 0.03 °B, o la recuperación este entre 105 y 95 %, este
último criterio es usado especialmente para métodos de análisis de trazas.
- Sensibilidad: este parámetro solo es de tipo informativo, sin embargo una

sensibilidad alta se traduce en un buen desempeño por parte del método.
- Precisión
o Repetibilidad: esta debe ser menor a 0.02 °B en todas las
concentraciones, este criterio fue estimado a partir de la experiencia en el
laboratorio, ya que el fabricante no reporta esta variable en la
especificación técnica del equipo.
o Precisión intermedia: se establece un máximo de 0.03 °B para la
precisión intermedia o reproducibilidad, este criterio se basa en la mayor
precisión reportada para los instrumentos. Además se debe verificar que
la precisión intermedia es menor a dos veces la repetibilidad de método
en términos del coeficiente de variación.
- Exactitud: en el Laboratorio Central se acepta un sesgo de 0.03 °B o menor.
- Incertidumbre: debe ser menor a 0.06 °B en su forma expandida para

distribución normal y una confidencia de 95 %.
91
POSTOBÓN S.A.
5.3.5. Muestras, estándares y patrones de referencia
5.3.5.1. Muestras
Como se indicó anteriormente el rango real de trabajo está determinado por las
muestras típicas que se analizan de forma rutinaria en los laboratorios, que
generalmente son de tipo jarabe, 40 a 60 °B, o producto terminado, 8 a 14 °B.
Como los jarabes no poseen ningún otro componente se asumirán como
estándares.
Las muestras a analizar durante el desarrollo del proyecto fueron tomadas de la

planta Postobón Bello según lineamientos dados para el procedimiento de
muestreo:
- No tomar muestras al comienzo o terminación de un lote de producción.

- Se debe esperar un tiempo de al menos 5 minutos en el cual las muestras
sean producidas de manera estable sin que sus propiedades cambien
abruptamente, especialmente grados Brix y volumen de CO2.
- Clasificar por altura de llenado y sellado.
Tabla 23. Descripción de muestras usadas en el desarrollo del proyecto
Producto Presentación Codificación Fecha de producción

25JUN09 07:43
Pepsi 500 ml 05 FEB 09
LB0001107584
25JUN09 05:07
Colombiana Nacional 500 ml 05 FEB 09
LB0001107392
25SEP09 00:59
Manzana Interior 500 ml 08 MAY 09
LB0001145113
Muestra control
Dentro del proceso de validación se hace uso de dos tipos de muestras control:
aquellas usadas en todo el proceso de validación o muestra control general y
aquellas usadas en el ensayo de robustez o muestra control de robustez, ambas
tienen objetivos distintos.
- Muestra control general
Como muestra control general se eligió agua destilada, debido su uso en

calibraciones y verificaciones de los equipos, además no se degrada o contamina
fácilmente, por lo tanto su análisis nos garantizará la validez de posteriores
determinaciones. La muestra control siempre se analiza al principio de cualquier
ensayo o grupo de lecturas, sus resultados no se reportarán ya que solo actúa
como verificador.
92
POSTOBÓN S.A.
- Muestra control de robustez
En los ensayos de robustez también se define un ensayo control, el cual

corresponde al efectuado sin ninguna modificación deliberada, estas muestras
control de robustez se usan como referencia para calcular los efectos y pueden
ser estándares de sacarosa o muestras de bebidas gaseosas.
5.3.5.2. Estándares
En este proyecto se entiende como estándar aquellas soluciones preparadas en el

laboratorio usando sacarosa grado reactivo y agua destilada (ver certificados en el
anexo B8, B9 y B10), debidamente pesadas, y de concentración (°B) conocida. Es
de anotar que para el ensayo de selectividad/especifidad se prepararon placebos
(estándares con ingredientes adicionales que buscan simular la matriz de una
bebida azucarada) los cuales se consideran estándares al poseer concentración
conocida de todos sus componentes.
En el transcurso del proyecto se usaron distintos niveles de concentración desde 7

hasta 60 °B, en su preparación se tuvo muy en cuenta la homogeneización de la
matriz y su respectiva refrigeración en caso de ser necesario.
5.3.5.3. Patrones de referencia
Refractómetro:
- AG12.50 𝑛𝐷20 = 1.35186, °𝐵 = 12.5 (ver anexo B1)

- OIL BSLP23 𝑛𝐷20 = 1.46990 (ver anexo B4)
- Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233
- Solución sacarosa 60.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.44193
Estos patrones pertenecientes a la casa Bellingham-Stanley tienen sus

respectivos certificados de trazabilidad y tablas de dependencia con la
temperatura; estas tablas sólo aplican para los dos primeros patrones, ya que no
son soluciones de sacarosa y su lectura debe realizarse sin compensación de
temperatura.
Densímetro:
- Agua ultra pura, Serial No. 1022 Certificado 18691 SH Calibration Service
GmbH. 0.99820 ± 0.000011 g/cm3 (95 %) a 20 °C (certificado en el anexo B6 y
B7)
93
POSTOBÓN S.A.
5.3.6. Condiciones ambientales y tiempo de experimentación
El proceso de validación se llevó a cabo desde el 11 de mayo de 2009 hasta el 3

de agosto de 2009. Las condiciones ambientales promedio del laboratorio central
en este rango de tiempo fueron (ver anexo D):
Tabla 24. Condiciones ambientales promedio en el laboratorio central
Parámetro Intervalo (95 % de confianza)

Temperatura (°C) 22.41 ± 1.65
HR (%) 56.74 ± 12.49
40 80
70
35
60
Temperatura (°C)
50
30
HR (%)
40
25
30
20
20
Temperatura 10
HR
15 0
07/05/09 17/05/09 27/05/09 06/06/09 16/06/09 26/06/09 06/07/09 16/07/09 26/07/09 05/08/09
Tiempo (Fecha)
Figura 19. Condiciones ambientales en el Laboratorio Central a través del tiempo
5.3.7. Metodología
Basados en los procedimientos descritos en la sección del marco teórico referente

a la validación se desprenden los siguientes grupos de experimentos.
5.3.7.1. Robustez
Para la evaluación de la robustez se identificaron las variables mostradas en la

tabla 25 que tiene una influencia importante en las lecturas.
94
POSTOBÓN S.A.
Tabla 25. Variables con influencia apreciable sobre el método analítico.
Equipo Tipo Etapa Variable

Densímetro Bebida Inversión - Cantidad de HCl adicionado
- Volumen de muestra
- Tiempo de inversión
- Temperatura de Inversión
Lectura en - Estabilidad de la muestra
equipo - Homogenización previa a la lectura
Refractómetro Bebida Inversión - Cantidad de HCl adicionado
- Volumen de muestra
- Temperatura de Inversión
equipo - Tiempo de retardo en lectura
- Temperatura
- Homogeneización previa a la lectura
Jarabe Desgasificación - Tiempo de ultrasonido
equipo - Tiempo de retardo en la lectura
- Temperatura
- Homogeneización previa a la lectura
Resumen de factores
- Estabilidad de la muestra o edad.

- Tiempo de ultrasonido (sólo jarabe)
- Cantidad de HCl adicionado, expresado como gotas.
- Volumen de muestra a invertir
- Temperatura de inversión
- Homogeneización previa a la lectura o agitación.
- Temperatura de lectura
- Tiempo de retardo en lectura (sólo refractómetro)
Niveles de influencia
Los niveles de influencia, ver tabla 26, especifican los valores en los cuales puede
variar un factor determinado.
95
POSTOBÓN S.A.
Tabla 26. Niveles de influencia para los distintos factores
Nivel de influencia Total

Factor
1 2 3 4 5 6 7 Niveles
Estabilidad (días) 0 1 3 6 4
Tiempo de ultrasonido (min) 0 2 4 8 4
Cantidad de HCl adicionado (gotas) 0 1 2 4 8 5
Volumen de muestra a invertir (ml) 20 25 30 3
Tiempo de inversión (min) 15 30 40 50 60 70 6
Temperatura de inversión (°C) 50 90 95 100 4
Agitación de la muestra Si No 2
Tiempo de retardo en lectura (s) 0 12 24 36 48 60 72 7
Temperatura de lectura (°C) 10 22 30 3
Las celdas en gris corresponden a los valores actuales del método en el

Laboratorio Central y definen el ensayo control, estos valores pueden diferir con la
forma en que el método es llevado a cabo en los laboratorios de las plantas
productoras, especialmente en el tiempo de inversión, que depende la altitud, y el
tiempo de retardo en la lectura.
Niveles de concentración
Los factores pueden influir de distinta manera dependiendo de la concentración de

azúcar en las soluciones, es necesario realizar cada estudio en un mínimo de dos
niveles de concentración por medio de análisis de estándares o muestras de
bebidas gaseosas, y en Brix invertido o directo según sea necesario.
Tabla 27. Niveles de concentración evaluados en la robustez
Muestra Estándar
Factor
Pepsi Colombiana Manzana 8 °B 14 °B 40 °B 60 °B
Estabilidad X X X X
Tiempo de ultrasonido X X
Cantidad de HCl adicionado X X X X
Volumen de muestra a invertir X X
Tiempo de inversión X X
Temperatura de inversión X X
Agitación de la muestra X X
Tiempo de retardo en lectura X X X X
Temperatura de lectura X X X X
En la tabla 27 se señalan los valores de concentración y muestras bajo las cuales

se analizó la robustez en los distintos factores. Tener en cuenta que los análisis de
40 y 60 °B sólo se realizan en el refractómetro y como Brix directo, el resto de
análisis se realizan como Brix invertido, en este caso, los estándares de 8 y 14 °B
pasan a un valor teórico de 8.421 y 14.736 °B debido a la inversión.
96
POSTOBÓN S.A.
En éstas pruebas se evaluarán dos o más niveles en cada factor y cada uno a
distintas concentraciones, por consiguiente el número de variables asciende a una
cantidad considerable; en este caso un diseño factorial resultaría difícil de llevar a
cabo, se elige, entonces, un diseño univariable donde cada factor es estudiado por
separado asumiendo interacciones nulas entre estos. Se realizarán 10 réplicas por
cada ensayo permitiendo el cálculo de un promedio más exacto y con unos grados
de libertad mayores.
5.3.7.2. Confirmación de identidad: selectividad/especifidad
Las bebidas azucaradas, como se ha mencionado anteriormente, tiene además de

azúcar y agua, otros componentes en muy pequeña proporción; el azúcar, como
tal, aporta más del 95 % de sólidos disueltos en una bebida azucarada, porcentaje
que depende de las especificaciones del producto. Aunque en la definición de
grados Brix se asume que este tipo de bebidas se puede considerar idealmente
como una solución de sacarosa pura en agua, es necesario estudiar el efecto de
los demás componentes para corroborar esta conjetura.
Basados en la huella técnica de los productos de tipo bebida azucarada en

Postobón S.A. se determinaron aquellos componentes que por la cantidad
agregada al producto terminado, pudieran afectar significativamente la lectura de
grados Brix. En la tabla 28 se encuentran los componentes seleccionados y su
rango típico de concentración:
Tabla 28. Componentes seleccionados para el análisis de especifidad
Componentes Estado Variable Rango (g/ 100 g)

Azúcar Sólido 𝑥𝐴 8 14
Ácido débil Sólido 𝑥𝐵 0 0.4
Ácido fuerte (Sol. 85 %) Líquido 𝑥𝐶 0 0.05
Benzoato de Potasio Sólido 𝑥𝐷 0 0.043
Emulsión Naranja Emulsión 𝑥𝐸 0 0.12
Enturbiante Emulsión 𝑥𝐹 0 0.42
A cada componente se le asigna una variable 𝑥𝑖 que corresponde a la

concentración dada en gramos presentes en cada 100 gramos de muestra.
Para el cálculo de la especifidad es necesario realizar experimentos repetidos a

diferentes concentraciones de analito e interferencias, en este caso se hará uso
97
POSTOBÓN S.A.
del diseño factorial fraccional Plackett-Burman 26 3/16 aleatorizado, proporcionado

por el programa estadístico Statgraphics.
Se prepararon 12 soluciones de 100 gramos cada una, con la respectiva cantidad

de componentes especificada en la tabla 29. El análisis de especifidad se realiza
tanto para Brix directo como invertido.
Tabla 29. Diseño de experimentos tipo Plackett-Burman para especifidad
Solución 𝒙𝑨 𝒙𝑩 𝒙𝑪 𝒙𝑫 𝒙𝑬 𝒙𝑭 g Agua g totales

1 14.0000 0.0000 0.0500 0.0000 0.0000 0.0000 85.9500 100
2 14.0000 0.4000 0.0500 0.0000 0.1200 0.4200 85.0100 100
3 8.0000 0.0000 0.0000 0.0430 0.1200 0.0000 91.8370 100
4 14.0000 0.0000 0.0500 0.0430 0.0000 0.4200 85.4870 100
5 8.0000 0.0000 0.0500 0.0430 0.1200 0.0000 91.7870 100
6 14.0000 0.4000 0.0000 0.0430 0.0000 0.4200 85.1370 100
7 14.0000 0.4000 0.0000 0.0430 0.1200 0.0000 85.4370 100
8 14.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.1200 0.4200 85.4600 100
9 8.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.4200 91.5800 100
10 8.0000 0.4000 0.0500 0.0000 0.1200 0.0000 91.4300 100
11 8.0000 0.4000 0.0000 0.0000 0.0000 0.4200 91.1800 100
12 8.0000 0.4000 0.0500 0.0430 0.0000 0.0000 91.5070 100
Total 132 2.400 0.300 0.258 0.720 2.520
5.3.7.3. Linealidad
La evaluación de la linealidad se realiza para ambos instrumentos, densímetro y

refractómetro, en lecturas invertidas y directas, para 10 concentraciones, en
triplicado y evaluando un rango un poco mayor al de trabajo. De los análisis se
obtuvo las señales correspondientes expresadas como densidad (mg/cm3) o
índice de refracción.
Los rangos a evaluar fueron los siguientes:
Densímetro:
- Rango invertido: 7 - 15 °B (10 concentraciones)
- Rango directo: 7 - 15 °B (10 concentraciones)
Refractómetro:
- Rango invertido: 7 - 15 °B (10 concentraciones)
- Rango bajo directo: 7 - 15 °B (10 concentraciones)
- Rango alto directo: 7 - 65 °B (18 concentraciones)
98
POSTOBÓN S.A.
Las soluciones preparadas se detallan en la tabla 30.
Tabla 30. Soluciones preparadas según el instrumento.
Densímetro Refractómetro
Invertido Directo Invertido Directo Bajo Directo Alto
7.37 7.00 7.37 7.00 7.00
8.42 8.00 8.42 8.00 8.00
9.47 9.00 9.47 9.00 9.00
10.53 10.00 10.53 10.00 10.00
11.58 11.00 11.58 11.00 11.00
12.10 11.50 12.10 11.50 11.50
12.63 12.00 12.63 12.00 12.00
13.68 13.00 13.68 13.00 13.00
14.74 14.00 14.74 14.00 14.00
15.79 15.00 15.79 15.00 15.00
30.00
35.00
40.00
45.00
50.00
55.00
60.00
5.3.7.4. Rango
El rango propiamente lo dan las especificaciones de los productos, sin embargo se

debe emitir un juicio que corrobore la exactitud y/o precisión en la lectura para
estos intervalos de concentración, se usan los mismos datos aportados en el
análisis de linealidad.
La curva respuesta Vs concentración obtenida para el análisis de la sensibilidad se

elabora con los datos proporcionados en el análisis de linealidad.
5.3.7.6. Precisión
Como es sabido la precisión se puede desglosar en varios términos: repetibilidad

instrumental, repetibilidad del método, precisión intermedia y reproducibilidad.
En este estudio en particular se usa el método para el cálculo de la repetibilidad

instrumental/método y la precisión intermedia. La reproducibilidad se puede hallar
por medio de un estudio colaborativo, el cual debe involucrar otros laboratorios,
con una capacidad de análisis similar o superior al del laboratorio central, este
99
POSTOBÓN S.A.
estudio sobrepasa los límites del presente proyecto y se deja propuesto para
estudios futuros en la empresa.
Repetibilidad del instrumento
En la repetibilidad del instrumento se evaluarán tres estándares invertidos: 8, 11 y

14 °B, y dos estándares con lectura directa: 40 y 60 °B (sólo refractómetro), los
datos para estas dos últimas soluciones se tomaron de los análisis para robustez.
A cada solución se le realizarán 10 mediciones consecutivas. Sin embargo, como
saldrá a la luz en los análisis, el densímetro realiza las lecturas de forma
parcialmente destructiva y por lo tanto el estudio para la repetibilidad del
instrumento no aplica.
Repetibilidad del método
Se harán mediciones a 10 alícuotas de una misma solución que han pasado todos
los pasos del método por separado y a tres niveles de concentración: 8, 11 y 14
°B. Es de anotar que los datos para 8 y 14 °B se extrajeron de las lecturas para el
análisis de robustez, experimentos que se realizaron bajo las mismas condiciones.
Precisión intermedia
Tal como lo propone la literatura en el cálculo de la precisión intermedia cada

analista realiza tres análisis por día en cada instrumento, ver diseño de
experimentos en la tabla 31. Estas lecturas se realizaron a dos soluciones
debidamente invertidas: 8 y 14 °B
Tabla 31. Diseño de experimentos para precisión intermedia
Día 1 Día 2 Día 3 Día 1 Día 2 Día 3 Total analista
Analista X 3 3 3 3 3 3 18
Analista Y 3 3 3 3 3 3 18
Total por
18 18
instrumento
5.3.7.7. Exactitud
Este parámetro se evalúa con respecto a dos valores de referencia: estándares y

patrones.
Exactitud con estándares
El cálculo de exactitud con estándares se realiza a partir de los datos obtenidos en

el estudio de linealidad. Usando estos resultados pero no en términos de
100
POSTOBÓN S.A.
respuesta (densidad o índice de refracción) si no con su conversión a grados Brix,

se puede determinar la exactitud a lo largo del rango de trabajo y a varias
concentraciones, como los análisis se realizaron por triplicado no es posible
realizar una prueba de hipótesis concluyente. Los cálculos y resultados obtenidos
en este caso son idénticos a los expuestos en el análisis para el rango del método.
Exactitud con patrones
Las soluciones de referencia son costosas y vienen en pequeños volúmenes, por

esto solo se puede realizar una limitada cantidad de lecturas, en general menor a
tres mediciones. Debido a la disponibilidad de un solo patrón para el densímetro,
se realiza una calibración con este patrón e inmediatamente se leen varios
estándares, con estos datos se establece el sesgo y la recuperación.
Densímetro
La exactitud se evalúa de dos formas y usando el mismo material de referencia

(agua ultra pura):
- Calibración con agua destilada
Se calibra de forma rutinaria, usando agua destilada obtenida del mismo

laboratorio y aire. Se valora el sesgo en densidad respecto al patrón después de la
debida calibración.
Tabla 32. Descripción del patrón usado en el cálculo de exactitud para el densímetro.
Densidad teórica
Patrón T (°C) 3
(g/cm )
Agua pura 20 0.99820 ± 0.000011
- Calibración con patrón de referencia
Se calibra bajo la misma metodología, sólo que en lugar de usar el agua destilada
se usa el patrón de referencia, y se analizan estándares distintos preparados en el
laboratorio según la tabla 33. Este procedimiento nos permite evaluar el sesgo en
densidad y grados Brix.
Tabla 33. Estándares usados en el cálculo de la exactitud para el densímetro.
Estándar Valor teórico (°B)

Agua destilada 0.000
8 °B 8.000
11 °B 11.000
14 °B 14.000
101
POSTOBÓN S.A.
Refractómetro
Se evaluó la exactitud en dos niveles de calibración: alto y bajo. Las calibraciones

se realizan según la tabla 34 y usando estándares de sacarosa preparados en el
laboratorio.
Tabla 34. Descripción de estándares usados para la calibración del refractómetro a distintos
rangos.
Rango Zero (Agua destilada) Span

Bajo 0.00 °B 12.00 °B
Alto 0.00 °B 60.00 °B
Según el rango, alto o bajo, se verifica con los patrones correspondientes la

exactitud del método, ver tabla 35.
Tabla 35. Descripción de patrones usados en el cálculo de exactitud para el refractómetro.
Rango Patrones Valor teórico

(20 °C)
AG12.50 𝑛𝐷20 = 1.35186, °𝐵 = 12,5 12.50 °B
Bajo
Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233 25.00 °B
Solución sacarosa 25.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.37233 25.00 °B
Alto Solución sacarosa 60.00 °B, 𝑛𝐷20 = 1.44193 60.00 °B
OIL BSLP23 𝑛𝐷20 = 1.46990 71.81 °B
Es de aclarar que los patrones AG12.50 y OIL BSLP23, no son soluciones de

sacarosa si no fluidos de referencia, por lo tanto su Brix teórico no corresponde a
los sólidos disueltos y depende altamente de la temperatura; es necesario
desactivar la compensación automática del instrumento y leer manualmente el
grado Brix a una temperatura determinada reportada en las tablas del certificado
metrológico (ver anexo B2, B3 Y B5).
La incertidumbre puede calcularse de dos maneras tal como se indica en la

sección 4.1.4.10. En el presente estudio esta se estimará usando el peor
escenario, es decir, aquel en el cual se encuentre una mayor variabilidad y que
involucre la mayor cantidad de fuentes de incertidumbre.
Se determina entonces que el peor escenario se presenta al analizar muestras

control de robustez, específicamente aquellas de bebida gaseosa (Colombiana,
Manzana y Pepsi) y jarabes (60 °B). Estas fueron analizadas con distintas
calibraciones, en un rango de tiempo prolongado y preparadas en fechas distintas.
102
POSTOBÓN S.A.
Las muestras de control usadas para el cálculo de la incertidumbre en el

densímetro corresponden a los siguientes ensayos en robustez:
- Estabilidad: Pepsi y Colombiana

- Cantidad de HCl: Pepsi y Manzana
- Agitación de la muestra: Pepsi y Colombiana
En total son 60 datos, agrupados en 6 grupos de 10 elementos cada uno.
En el refractómetro (rango bajo) las muestras control de robustez usadas son las
correspondientes a las pruebas de:
- Estabilidad: Pepsi y Colombiana

- Cantidad de HCl: Pepsi y Manzana
- Agitación de la muestra: Pepsi y Colombiana
- Temperatura de lectura: Pepsi
Estos ensayos representan un total de 70 lecturas, agrupados en 7 grupos con 10

datos cada uno.
Para evaluar la incertidumbre del refractómetro en un rango alto se procedió de

igual forma, pero usando los estándares de 60 °B pertenecientes a los ensayos de
control en el análisis de robustez:
- Estabilidad
- Tiempo ultrasonido
- Temperatura de lectura
Es de anotar que se emplearon solo las muestras control de 60 °B ya que, como

se verá en el análisis de repetibilidad, reportan la mayor desviación, la cual es tres
veces mayor que la encontrada para 40 °B.
5.3.8. Resultados y análisis
En esta sección se reportan los resultados relevantes del estudio de validación,

para obtener más información sobre las memorias de cálculo y resultados
parciales ver anexo E.
5.3.8.1. Robustez
El error estándar para todas las pruebas de hipótesis se calculó a partir de la

desviación estándar asociada al método de determinación de grados Brix, que
corresponde a 0.03 °B, siempre y cuando esta sea mayor a la desviación estándar
103
POSTOBÓN S.A.
de los ensayos, lo cual se verifica usando una prueba de hipótesis para

comparación de varianzas.
El estimado de la desviación estándar igual a 0.03 °B es el mismo para ambos
equipos y determina el criterio máximo de aceptación significativo usado en las
mediciones.
Estabilidad de la muestra
La estabilidad de la muestra se evaluó a condiciones ambientales controladas,

(ver tabla 24 y figura 10) y con el tubo de ensayo destapado, en otras palabras,
libre al ambiente, esto con el fin de simular una situación extrema. En este caso la
medida referencia es aquella realizada en el día cero. Con este estudio se quiere
demostrar si dejar una muestra a condiciones ambientales y de forma
“desatendida” incide significativamente en el valor de Brix reportado.
Tabla 36. Resultados prueba de estabilidad para refractómetro
Estándar 40 °B 60 °B
Día 0 1 3 6 0 1 3 6
Promedio 40.012 40.070 40.230 40.486 59.979 60.062 60.231 60.498
Desv. estándar 0.008 0.008 0.007 0.008 0.009 0.018 0.009 0.012
Teórico 39.998 39.998 39.998 39.998 59.999 59.999 59.999 59.999
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex 0.0000 0.0580 0.2180 0.4740 0.0000 0.0830 0.2520 0.5190
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 4.3231 16.2488 35.3299 6.1865 18.7830 38.6840
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si Si Si Si Si Si
significativo?
Muestra Pepsi Colombiana

Día 0 1 3 6 0 1 3 7
Promedio 11.204 11.236 11.325 11.426 10.518 10.556 10.619 10.725
Desv. estándar 0.007 0.019 0.011 0.010 0.010 0.007 0.006 0.007
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex 0.0000 0.0320 0.1210 0.2220 0.0000 0.0380 0.1010 0.2070
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 2.3851 9.0188 16.5469 2.8324 7.5281 15.4289
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si Si Si Si Si Si
significativo?
104
POSTOBÓN S.A.
Tabla 37. Resultados prueba de estabilidad para densímetro
Muestra Pepsi Colombiana

Día 0 1 3 6 0 1 3 7
Promedio 11.225 11.265 11.336 11.428 10.504 10.549 10.623 10.732
Desv. estándar 0.010 0.005 0.009 0.010 0.011 0.007 0.004 0.011
n 10 9 10 10 10 10 10 10
Ex 0.0000 0.0402 0.1108 0.2026 0.0000 0.0444 0.1185 0.2279
SE (s=0.03) 0.0134 0.0138 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 2.9196 8.2585 15.1009 3.3094 8.8325 16.9867
t (crítico) 2.1098 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
significativo? Si Si Si Si Si Si
En las figuras 20, 21 y 22 se presentan las medidas de Brix contra el tiempo para
ambos equipos:
Figura 20. Grados Brix en jarabes respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría
105
POSTOBÓN S.A.
Figura 21. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en refractometría
Figura 22. Grados Brix en bebidas respecto al tiempo para estudio de estabilidad en densimetría
Como se observa en las tablas 36 y 37, la muestra es poco estable si se deja

destapada ya que, incluso a condiciones controladas, el aire se volatiliza
lentamente en el transcurso del tiempo, pero lo suficiente como para producir un
aumento considerable en los grados Brix. Por esto se recomienda no leer
muestras destapadas luego de 24 horas transcurridas a su preparación; esto
aplica específicamente para el densímetro, en el cual las muestras servidas
carrusel pueden estar sin analizar más de tres horas.
106
POSTOBÓN S.A.
A partir de los grados Brix iniciales y los encontrados después de cierto tiempo es
posible calcular un estimado del porcentaje de agua perdida por evaporación (ver
tabla 38), calculando un promedio para cada día y graficando los resultados se
encontró una relación lineal casi perfecta (figura 23), este análisis es corroborado
además por las figuras 20, 21 y 22, donde a distintas concentraciones el
comportamiento de los grados Brix con respecto al tiempo es claramente lineal.
Tabla 38. Promedios de porcentaje de agua perdida respecto al día de lectura
Día % Agua perdida

0.00 0
1.00 0.3637
3.00 1.0937
6.00 2.1350
Figura 23. Promedio de todos los ensayos de estabilidad en porcentaje de agua perdida respecto
al tiempo
Tiempo de ultrasonido
Esta prueba sólo realizada en jarabes, surge de la pregunta: ¿es necesaria la

agitación de la muestra por medio de ultrasonido antes de su lectura?
Después de la preparación de una muestra con alto contenido de Brix, entre 40 y
60 °B, su viscosidad alta permite la dispersión de una cantidad de burbujas
minúsculas pero apreciables a la vista, con este estudio se desea encontrar si la
presencia de burbujas incide significativamente en el resultado.
107
POSTOBÓN S.A.
Tabla 39. Resultados para el tiempo homogeneización en ultrasonido
Tiempo (min) 0 2 4 8 0 2 4 8
Promedio 40.023 40.020 40.026 40.027 59.998 59.980 59.980 59.973
Desv. estándar 0.008 0.012 0.010 0.008 0.013 0.015 0.017 0.008
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Teórico 39.994 39.994 39.994 39.994 59.993 59.993 59.993 59.993
Ex 0.000 -0.003 0.003 0.004 0.0000 -0.0180 -0.0180 -0.0250
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 0.2236 0.2236 0.2981 1.3416 1.3416 1.8634
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
No No No No No No
significativo?
Según la prueba t respecto a la muestra a la cual no se le realizó la agitación por

ultrasonido, se demuestra que esta homogenización no es necesaria; sin embargo
para el estándar de 60 °B se recomienda un breve tiempo de reposo después su
preparación, para permitir que las burbujas grandes se disipen.
Cantidad de HCl 2,5 N
En el laboratorio central las muestras se acidulan para su inversión con 2 gotas de

HCl 2.5 N, cantidad suficiente de ácido para generar un pH que permita la
inversión. Sin embargo, debido a su función de catalizador, no es necesaria una
adición exacta y por lo tanto se usa un gotero en este paso. Se genera entonces la
pregunta, ¿hasta qué punto es significativa la cantidad de HCl agregado? Se
evaluaron tres matrices específicas: solución de sacarosa pura, Pepsi y Manzana.
Esta distinción entre matrices se debe principalmente a la acidez que presentan.
Una solución de sacarosa pura se puede considerar de pH neutro, mientras que
los productos Pepsi y Manzana al poseer un ácido fuerte y débil respectivamente
tornan la solución ácida, es decir, con un bajo pH; parámetro que, como se
mencionó anteriormente, desempeña un papel fundamental en el proceso de
inversión.
108
POSTOBÓN S.A.
Tabla 40. Resultados para la prueba de cantidad de HCl para refractómetro
Gotas HCl 0 1 2 4 8 0 1 2 4 8
Promedio (°B) 8.002 8.424 8.434 8.462 8.493 13.974 14.702 14.700 14.696 14.682
Desv. estándar 0.004 0.007 0.005 0.008 0.009 0.012 0.004 0.005 0.008 0.008
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736
pH 6.78 2.36 2.11 1.92 1.59 6.78 2.36 2.11 1.92 1.59
n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex -0.432 -0.010 0.0000 0.0280 0.0590 -0.726 0.0020 0.0000 -0.004 -0.018
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 32.199 0.7454 2.0870 4.3976 54.112 0.1491 0.2981 1.3416
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si No No Si Si No No No
significativo?
Muestra Pepsi Manzana
Gotas HCl 0 1 2 4 8 0 1 2 4 8
Promedio 11.228 11.228 11.231 11.234 11.244 10.840 10.907 10.914 10.916 10.929
Desv. estándar 0.006 0.009 0.010 0.007 0.007 0.009 0.005 0.011 0.005 0.006
pH 2.43 2.08 1.92 1.68 1.38 3.00 2.51 2.21 1.85 1.58
n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9
Ex -0.003 -0.003 0.0000 0.0030 0.0130 -0.074 -0.007 0.0000 0.0020 0.0149
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138
t 0.2236 0.2236 0.2236 0.9690 5.5156 0.5217 0.1491 1.0802
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1098
¿Efecto
No No No No Si No No No
significativo?
Tabla 41. Resultados prueba de cantidad de HCl para densímetro

Gotas HCl 0 1 2 4 8 0 1 2 4 8
Promedio 7.999 8.418 8.424 8.432 8.441 14.010 14.701 14.688 14.674 14.632
Desv. estándar 0.003 0.009 0.004 0.004 0.006 0.012 0.007 0.008 0.005 0.011
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736
pH 6.78 2.36 2.11 1.92 1.59 6.78 2.36 2.11 1.92 1.59
n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex -0.425 -0.006 0.0000 0.0080 0.0169 -0.678 0.0136 0.0000 -0.013 -0.056
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 31.655 0.4398 0.5963 1.2597 50.490 1.0137 0.9988 4.1814
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si No No No Si No No Si
significativo?
109
POSTOBÓN S.A.
Muestra Pepsi Manzana

Gotas HCl 0 1 2 4 8 0 1 2 4 8
Promedio 11.246 11.240 11.232 11.229 11.218 10.804 10.889 10.894 10.876 10.872
Desv. estándar 0.007 0.005 0.008 0.009 0.006 0.008 0.006 0.011 0.006 0.005
pH 2.43 2.08 1.92 1.68 1.38 3.00 2.51 2.21 1.85 1.58
n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9
Ex 0.0135 0.0073 0.0000 -0.003 -0.014 -0.089 -0.005 0.0000 -0.018 -0.022
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138
t 1.0062 0.5441 0.2385 1.0659 6.6784 0.3578 1.3118 1.6065
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1098
¿Efecto
No No No No Si No No No
significativo?
En las siguientes figuras, 24 y 25, se presentan los resultados de forma

normalizada, en este caso y para fines de interpretación se calcularon las
diferencias con respecto al valor de la muestra analizada con 8 gotas de HCl. La
normalización se hizo con el fin de tener todos los puntos bajo una misma escala,
permitiendo mejor su interpretación.
Figura 24. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el
refractómetro
110
POSTOBÓN S.A.
Figura 25. Grados Brix normalizados respecto a la cantidad de HCl adicionada a la muestra para el
densímetro
Brix aparente según cada instrumento para el HCl 2.5N:
- Refractómetro: 13.42 °B invertido (IR = 1.35296)

- Densímetro: 10.73 °B (Densidad = 1.0412 g/cm3)
En las tablas 40 y 41 se observa que los estándares de 8 y 14 °B sin adición de

ácido, no invirtieron, esto porque su pH era aproximadamente neutro y no
favorecía la cinética de inversión, se comprobó además que se requiere al menos
una gota de HCl a 2.5 N para bajar lo suficiente el pH y realizar la inversión en
menos de una hora con calentamiento.
A pesar de esto, se manifiesta que agregando 8 gotas a los estándares, los
valores de Brix difieren significativamente, ya que con esta cantidad de HCl se
empieza a modificar la matriz y actúa como diluyente o concentrador. El HCl tiene
un Brix aparente dependiendo del instrumento, para el refractómetro es de 13.42
°B y para el densímetro 10.73 °B; por esto, cuando se adicionan altas cantidades
del ácido a una muestra puede concentrarla o diluirla en términos de Brix y afectar
los resultados significativamente. Este efecto lo vemos más claramente en las
figuras 24 y 25, para la solución de 8 °B al añadir más HCl la diferencia respecto al
valor dado por la solución con 8 gotas es positiva y disminuye proporcionalmente a
la cantidad de ácido agregado, esto significa que al añadir más HCl los grados Brix
aumentan; en el caso de 14 °B sucede lo contrario, el ácido actúa como diluyente
y los grados Brix disminuyen proporcionalmente a la cantidad agregada.
Para el caso de bebidas (Pepsi y Manzana) se sabe que Pepsi tiene entre sus
componentes un ácido fuerte que disminuye lo suficiente el pH como para no
necesitar adición de ácido, teoría que se confirma en los dos instrumentos. En la
111
POSTOBÓN S.A.
producción de Manzana se usa un ácido débil, este baja el pH significativamente

pero no lo suficiente como para invertir la muestra totalmente en 50 minutos de
calentamiento, se comprobó entonces que se requiere al menos una gota de ácido
para este propósito.
En general se establece que para todas las muestras se requiere adicionar al

menos una gota de ácido clorhídrico en una concentración de 2.5 N, y que,
especialmente para los estándares, adicionar más de 4 gotas afecta los resultados
negativamente.
Volumen de muestra a invertir
En estos ensayos se busca determinar si el volumen a invertir es significativo en el

análisis de Brix. El calentamiento se realiza en tubos de ensayo con tapa rosca,
cerrados herméticamente para evitar evaporación de la muestra. Dichos tubos
tienen una capacidad límite de 30 ml. En los ensayos rutinarios estos se llenan
con aproximadamente 25 ml de muestra, pero es posible agregar tan sólo 20 ml si
la muestra es pequeña.
Tabla 42. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para refractómetro
Concentración 8 °B 14 °B
Volumen (ml) 20 25 30 20 25 30
Promedio 8.448 8.448 8.440 14.70 14.71 14.70
Desv. estándar 0.006 0.008 0.007 0.012 0.008 0.011
Teórico 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 9 10 10
Ex 0.0000 0.0000 -0.0080 -0.0016 0.0000 -0.0040
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138 0.0134 0.0134
t 0.0000 0.5963 0.1129 0.2981
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1199 2.1098
¿Efecto
No No No No
significativo?
112
POSTOBÓN S.A.
Tabla 43. Resultados del ensayo de volumen de muestra a invertir para densímetro
Volumen (ml) 20 25 30 20 25 30
Promedio 8.414 8.421 8.413 14.681 14.679 14.697
Desv. estándar 0.009 0.007 0.005 0.009 0.013 0.004
Teórico 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 9 10 10
Ex -0.0067 0.0000 -0.0076 0.0015 0.0000 0.0173
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0138 0.0134 0.0134
t 0.4994 0.5665 0.1072 1.2895
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1199 2.1098
¿Efecto
No No No No
significativo?
Se comprueba que el volumen de muestra a invertir no es muy relevante cuando

varia en un rango de 20 a 30 ml, aunque este rango puede ser extrapolable a
valores más pequeños o grandes con un grado aceptable de confianza.
Tiempo de inversión
Una de las variables de cuidado en el proceso de inversión es el tiempo requerido

para asegurar una inversión completa. Debido a que la presión atmosférica varía
dependiendo de la región geográfica, la temperatura de ebullición del agua
alcanzada por el baño maría puede cambiar levemente. Cada laboratorio está en
la obligación de realizar un estudio del tiempo de requerido para una inversión
completa. En la norma para determinación de grados Brix de Postobón S.A. se
recomienda un tiempo de 40 minutos, sin embargo, en el caso del laboratorio
central se determinó un tiempo de 50 minutos para las condiciones específicas de
Medellín. Con este ensayo se busca determinar un rango de tiempo en el cual se
asegura una inversión completa.
Tabla 44. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para refractómetro

Concentración 8 °B
Tiempo (min) 15 30 40 50 60 70
Promedio 8.419 8.441 8.446 8.453 8.448 8.444
Desv. estándar 0.007 0.010 0.007 0.005 0.004 0.007
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421
n 10 10 10 10 10 10
Ex -0.034 -0.012 -0.007 0.0000 -0.005 -0.009
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 2.5342 0.8944 0.5217 0.3727 0.6708
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto significativo? Si No No No No
113
POSTOBÓN S.A.
Tiempo (min) 15 30 40 50 60 70
Promedio 14.670 14.694 14.696 14.695 14.692 14.696
Desv. estándar 0.011 0.005 0.007 0.010 0.004 0.013
Teórico (inv) 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 10 10 10
Ex -0.025 -0.001 0.0010 0.0000 -0.003 0.0010
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 1.8634 0.0745 0.0745 0.2236 0.0745
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto significativo? No No No No No
Tabla 45. Resultados del ensayo de tiempo de inversión para densímetro
Tiempo (min) 15 30 40 50 60 70
Promedio 8.400 8.410 8.412 8.413 8.412 8.403
Desv. estándar 0.009 0.008 0.006 0.007 0.004 0.008
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421 8.421
n 10 10 10 10 10 10
Ex -0.0130 -0.0030 -0.0010 0.0000 -0.0003 -0.0101
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 0.9690 0.2236 0.0745 0.0224 0.7528
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto significativo? No No No No No
Tiempo (min) 15 30 40 50 70
Promedio 14.655 14.687 14.683 14.681 14.684
Desv. estándar 0.011 0.005 0.008 0.011 0.014
Teórico (inv) 14.736 14.736 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 10 10
Ex -0.0260 0.0057 0.0019 0.0000 0.0025
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 1.9379 0.4249 0.1416 0.1863
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto significativo? No No No No
En este estudio se evaluó un rango de tiempo relativamente extenso, desde los 15

minutos hasta 70 minutos. Se encontró que sólo en el ensayo a de 8 °B y con
lectura en el refractómetro, el valor encontrado para un tiempo de 15 minutos de
114
POSTOBÓN S.A.
calentamiento fue significativamente distinto. Por esto se recomienda realizar un

calentamiento en un mínimo de 30 minutos, siendo 40 el tiempo aceptable. Para
tiempos mayores no se encontraron diferencias apreciables, pese a esto se define
un tiempo máximo de 70 minutos y así evitar efectos perjudiciales si se ejecuta el
método fuera de este rango.
Temperatura de inversión
Normalmente los baños maría tienen un sensor de temperatura que puede no

tener buena exactitud, estudiar el efecto de la temperatura sobre las muestras es
necesario para reconocer qué importancia tiene esta en el proceso de inversión, y
asegurar un rango de temperatura en el cual las mediciones sean confiables.
Tabla 46. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para refractómetro
Temperatura (°C) 50 90 95 100 50 90 95 100
Promedio 8.136 8.422 8.433 8.444 14.204 14.691 14.695 14.703
Desv. estándar 0.005 0.006 0.005 0.005 0.018 0.003 0.005 0.0067
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex -0.3080 -0.0220 -0.0110 0.0000 -0.4990 -0.0120 -0.0080 0.0000
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 22.9570 1.6398 0.8199 37.1933 0.8944 0.5963
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si No No Si No No
significativo?
Tabla 47. Resultados del ensayo de temperatura de inversión para densímetro
Temperatura (°C) 50 90 95 100 50 90 95 100
Promedio 8.068 8.413 8.407 8.409 14.100 14.682 14.680 14.678
Desv. estándar 0.005 0.005 0.003 0.006 0.011 0.009 0.006 0.011
Teórico (inv) 8.421 8.421 8.421 8.421 14.736 14.736 14.736 14.736
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex -0.3412 0.0041 -0.0018 0.0000 -0.5780 0.0032 0.0015 0.0000
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 25.4315 0.3056 0.1342 43.0816 0.2385 0.1118
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si No No Si No No
significativo?
115
POSTOBÓN S.A.
Como se esperaba, solo el nivel más bajo de temperatura (50 °C) fue insuficiente
para lograr una inversión completa en 50 minutos. Una temperatura de 90 °C
resulta ser apta para tener una desviación no significativa respecto a los ensayos
realizados a 100 °C.
Agitación antes de la lectura
Con esta prueba se quiere determinar la importancia y el efecto de la agitación en

la lectura de las muestras. La agitación suministrada a la muestra se realiza de
forma manual inmediatamente antes de la lectura y de forma suave para no crear
burbujas que puedan afectar los análisis.
Tabla 48. Resultados del ensayo de agitación para refractómetro y densímetro
Instrumento Refractómetro Densímetro

Muestra Pepsi Colombiana Pepsi Colombiana
¿Agitación? Si No Si No Si No Si No
Promedio 11.204 11.159 10.518 10.488 11.225 11.229 10.504 10.511
Desv. estándar 0.007 0.011 0.010 0.024 0.010 0.011 0.011 0.009
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Ex -0.0450 -0.0300 0.0037 0.0064
SE (s=0.03) 0.0134 0.0134 0.0134 0.0134
t 3.3541 2.2361 0.2758 0.4770
t (crítico) 2.1009 2.1009 2.1009 2.1009
¿Efecto
Si Si No No
significativo?
Estadísticamente se comprueba que la agitación para medición en el refractómetro

es necesaria; cuando no se agita es probable que la sacarosa se haya
estratificado en el tubo de ensayo, lo cual afectaría la medición si ésta no se
homogeniza antes de servir unas cuantas gotas en el prisma. En el densímetro, a
diferencia del refractómetro, la muestra es trasvasada totalmente al vial de lectura,
proceso en el cual se garantiza una homogenización de la muestra sin necesidad
de agitarla, efecto corroborado en las pruebas t de la tabla 48.
Retardo de lectura (refractómetro)
El tiempo de retardo, que en este caso solo aplica al refractómetro, es un

parámetro de configuración del instrumento que permite hacer la medición cierto
tiempo después de colocar la muestra sobre el prisma. Se usa principalmente
cuando la muestra no está a la temperatura ambiente y por lo tanto se debe dejar
un tiempo de reposo en el instrumento hasta alcanzar un equilibrio térmico. En el
laboratorio central se usa un tiempo de 3 segundos, ya que a condiciones
normales la muestra siempre es leída a temperatura ambiente, incluso es posible
116
POSTOBÓN S.A.
realizar la medición sin ningún tiempo de espera; en cambio, en los laboratorios de

planta la muestra generalmente se encuentra fría (aprox. 10 °C) en el caso de
bebidas gaseosas, por esta razón y otros factores, como la temperatura ambiente,
que varían considerablemente, el tiempo de retardo puede estar entre 30 a 60
segundos, dependiendo de las condiciones puntuales en cada laboratorio de
planta.
En el presente estudio las muestras se someten a una lectura continua, es decir,

una vez colocadas en el prisma se procede a realizar lecturas repetidas cada 12
segundos hasta un tiempo de 72 s. Este proceso se realiza por triplicado en las
muestras: Colombiana y Pepsi; y a tres temperaturas: 10 ± 1 °C, ambiente (21 –
24 °C), y 30 ± 1 °C. Este ensayo no busca evaluar la robustez del método como
tal, si no establecer el tiempo óptimo de retardo cuando se tiene muestras a
temperatura ambiente, 10 °C, 30 °C.
El densímetro posee un sistema que le permite llevar las muestras a una

temperatura de 20.00 ± 0,01 °C, por esto la temperatura inicial no tiene ningún
efecto relevante en la medición, pero puede influir en el tiempo que tarda el equipo
en llevarla a 20.00 °C, sin embargo esto último no tiene importancia práctica y no
se será valorado.
Tabla 49. Resultados del ensayo de tiempo de retardo en lectura
Muestra Colombiana Pepsi

Tiempo (s) 10 °C 22.5 °C 30 °C 10 °C 22.5 °C 30 °C
0 10.57 10.51 10.47 11.30 11.22 11.17
12 10.54 10.51 10.48 11.27 11.23 11.18
24 10.52 10.51 10.49 11.24 11.23 11.19
36 10.52 10.51 10.49 11.23 11.22 11.19
48 10.51 10.51 10.49 11.22 11.22 11.19
60 10.51 10.51 10.49 11.22 11.22 11.20
72 10.50 10.51 10.50 11.22 11.22 11.20
Tiempo (s) 10 °C 24 °C 30 °C 10 °C 24 °C 30 °C
0 40.05 40.00 39.99 60.02 59.96 59.92
12 40.03 40.00 40.00 59.99 59.96 59.93
24 40.02 40.00 40.00 59.98 59.96 59.94
36 40.01 40.00 40.01 59.97 59.96 59.95
48 40.00 40.00 40.01 59.96 59.96 59.95
60 40.00 40.00 40.01 59.96 59.96 59.95
72 40.00 40.00 40.01 59.96 59.96 59.95
117
POSTOBÓN S.A.
Figura 26. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en bebida
gaseosa.
Figura 27. Grados Brix de muestras a varias temperaturas respecto al tiempo de lectura en jarabe
De las gráficas 26 y 27 se puede inferir que las muestras cuando se encuentran a

temperatura ambiente no necesitan ningún tiempo de retardo, ya que la lectura de
grados Brix no varía en el tiempo. Por otro lado, las muestras que están a
temperaturas de 10 y 30 °C necesitan un tiempo mínimo de 50 segundos para
obtener estabilidad térmica y reportar una lectura en Brix constante.
118
POSTOBÓN S.A.
Adicionalmente, se observa que la medida en grados Brix es inversamente

proporcional a la temperatura, tal como lo demuestra la teoría.
Se define entonces que para muestras, bebidas gaseosas o jarabes, a

temperatura ambiente no es necesaria una lectura con tiempo de retardo. Sin
embargo, en el Laboratorio Central por experiencia, se acostumbra dejar la
muestra 3 segundos en el prisma y así asegurar aún más la calidad de los
resultados. Las muestras que se encentren a temperaturas distintas necesitan al
menos 50 segundos de espera.
Temperatura de lectura (refractómetro)
Después de determinar el tiempo óptimo de lectura para muestras que no están a

temperatura ambiente, se procede a evaluar el efecto de éste factor en las
mediciones. De igual forma que el ensayo anterior, éste solo aplica para el
refractómetro.
Tabla 50. Resultados del ensayo para temperatura de lectura
Muestra Colombiana Pepsi

Temperatura (°C) 10 ± 1 23 ± 2 30 ± 1 10 ± 1 23 ± 1 30 ± 1
Temp. Promedio Muestra (°C) 10.7 22.5 29.8 10.3 22.5 30.0
Temp. Promedio Equipo (°C) 23.8 23.9 24.0 23.9 23.8 24.1
Tiempo de retardo (s) 50 3 50 50 3 50
Promedio Lectura (°B) 10.523 10.517 10.499 11.224 11.217 11.204
Desv. estándar (°B) 0.005 0.007 0.008 0.014 0.012 0.008
n 9 9 9 10 10 10
Ex 0.007 -0.018 0.007 -0.013
SE (s=0.03) 0.014 0.014 0.013 0.013
t 0.471 1.257 0.522 0.969
t (crítico) 2.120 2.120 2.101 2.101
Muestra 40 °B 60 °B
Temperatura (°C) 10 ± 1 23 ± 2 30 ± 1 10 ± 1 23 ± 1 30 ± 1
Temp. Promedio Muestra (°C) 10.0 24.5 30.0 9.8 24.5 30.2
Temp. Promedio Equipo (°C) 24.71 24.68 25.08 24.79 24.79 24.89
Tiempo de retardo (s) 50 3 50 50 3 50
Promedio Lectura (°B) 40.019 40.008 40.040 59.978 59.985 59.992
Desv. estándar (°B) 0.009 0.004 0.016 0.015 0.014 0.029
Teórico (°B) 40.00 40.00 40.00 60.00 60.00 60.00
n 10 10 4 10 10 10
Ex 0.011 0.032 -0.007 0.007
SE (s=0.03) 0.013 0.018 0.013 0.013
t 0.820 1.803 0.522 0.522
t (crítico) 2.101 2.179 2.101 2.101
119
POSTOBÓN S.A.
Bajo las condiciones dadas se establece que la temperatura inicial de la muestra

no afecta significativamente los resultados.
5.3.8.2. Especifidad
Las concentraciones reales (g / 100 g solución) de las soluciones preparadas bajo

los lineamientos del diseño de experimento para esta prueba se muestran en la
tabla 51.
Tabla 51. Concentraciones reales de las soluciones placebo preparadas para la especifidad
Solución 𝒙𝑨 𝒙𝑩 𝒙𝑪 𝒙𝑫 𝒙𝑬 𝒙𝑭 g agua g totales
1 13.9972 0.0000 0.0520 0.0000 0.0000 0.0000 85.9508 100.0000
2 13.9971 0.4006 0.0677 0.0000 0.1228 0.4254 84.9865 100.0000
3 8.0005 0.0000 0.0000 0.0458 0.1368 0.0000 91.8169 100.0000
4 13.9965 0.0000 0.0660 0.0458 0.0000 0.4235 85.4682 100.0000
5 8.0002 0.0000 0.0497 0.0447 0.1889 0.0000 91.7165 100.0000
6 13.9999 0.4004 0.0000 0.0433 0.0000 0.4205 85.1360 100.0000
7 14.0003 0.4019 0.0000 0.0435 0.1216 0.0000 85.4327 100.0000
8 13.9962 0.0000 0.0000 0.0000 0.1480 0.4319 85.4239 100.0000
9 8.0001 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.4255 91.5744 100.0000
10 8.0000 0.4026 0.0574 0.0000 0.1295 0.0000 91.4105 100.0000
11 8.0001 0.3996 0.0000 0.0000 0.0000 0.4500 91.1503 100.0000
12 7.9988 0.4009 0.0847 0.0434 0.0000 0.0000 91.4722 100.0000
Las respuestas como °B de cada una de las soluciones son las siguientes:
Tabla 52. Respuesta en °B para las soluciones placebo en el análisis de especifidad

Solución 𝒚 (Dto) 𝒚 (Inv) 𝒚 (Dto) 𝒚 (Inv)
1 14.04 14.96 14.089 14.796
2 14.62 15.31 14.724 15.376
3 8.13 8.53 8.064 8.487
4 14.27 15.01 14.294 15.000
5 8.16 8.57 8.136 8.545
6 14.57 15.29 14.644 15.321
7 14.46 15.15 14.488 15.173
8 14.21 14.90 14.184 14.854
9 8.17 8.61 8.160 8.585
10 8.50 8.86 8.536 8.932
11 8.57 9.01 8.620 9.055
12 8.51 8.90 8.582 8.974
120
POSTOBÓN S.A.
Usando una regresión múltiple por el método de mínimos cuadrados, se calculan

las sensibilidades parciales reportadas en la tabla 53.
Tabla 53. Sensibilidades parciales para los componentes presentes en las soluciones placebo
Equipo 𝑺𝑨𝑨 𝑺𝑨𝑩 𝑺𝑨𝑪 𝑺𝑨𝑫 𝑺𝑨𝑬 𝑺𝑨𝑭 𝒚𝟎 𝒓𝟐

Refractómetro Directo 0.9963 0.9323 0.8214 1.0480 0.3232 0.3684 0.0551 1.000
Invertido 1.0551 0.7772 0.6970 -0.1425 -0.3075 0.1882 0.1270 1.000
Densímetro Directo 1.0011 1.0863 1.4028 0.7212 0.1278 0.3836 -0.0033 1.000
Invertido 1.0462 1.0408 1.1905 0.7259 -0.0279 0.3614 0.0798 1.000
Las especifidades calculadas para cada solución son las siguientes:
Tabla 54. Especifidades calculadas para las soluciones placebo

Solución 𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒅𝒕𝒐 ) 𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒊𝒏𝒗 ) 𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒅𝒕𝒐 ) 𝒔𝒑𝒆𝒄(𝑨𝒊𝒏𝒗 )
1 0.9969 0.9976 0.9948 0.9958
2 0.9571 0.9688 0.9518 0.9572
3 0.9886 0.9943 0.9937 0.9956
4 0.9818 0.9911 0.9799 0.9822
5 0.9817 0.9884 0.9845 0.9886
6 0.9605 0.9739 0.9571 0.9606
7 0.9681 0.9765 0.9667 0.9700
8 0.9854 0.9915 0.9870 0.9892
9 0.9807 0.9906 0.9800 0.9820
10 0.9449 0.9555 0.9374 0.9446
11 0.9367 0.9553 0.9296 0.9353
12 0.9422 0.9573 0.9318 0.9384
Como se puede corroborar en la tabla 54, las especifidades calculadas para todas
las soluciones fueron mayores a 0.90. Se verifica entonces la adecuada
especifidad del método en la matriz de bebida gaseosa. Como conclusión
adicional, esta prueba confirma la hipótesis del factor de inversión; se puede
apreciar que para las soluciones invertidas la sensibilidad parcial de la sacarosa
es de 1.0551 y 1.0462, para el refractómetro y densímetro respectivamente,
valores muy cercanos al factor de inversión teórico 1.0526.
5.3.8.3. Linealidad
Las respuestas entregadas por ambos equipos este estudio se reportan en las
tablas 55, 56, 57, 58 y 59.
121
POSTOBÓN S.A.
Resultados para lectura en densímetro
- Brix invertido
Tabla 55. Resultados para linealidad por densimetría en Brix invertido
3
°B °B Inv. Lectura densidad (g/cm ) Promedio Lectura °B Inv. Promedio
3
Teórico Teórico 1 2 3 (g/cm ) 1 2 3 (°B inv.)
7.000 7.369 1.02734 1.02734 1.02737 1.02735 7.367 7.367 7.373 7.369
8.000 8.421 1.03163 1.03163 1.03161 1.03162 8.421 8.422 8.417 8.420
9.001 9.474 1.03592 1.03592 1.03591 1.03592 9.468 9.469 9.466 9.468
10.000 10.526 1.04020 1.04023 1.04024 1.04022 10.504 10.512 10.514 10.510
11.000 11.579 1.04459 1.04457 1.04458 1.04458 11.559 11.554 11.556 11.556
11.499 12.104 1.04678 1.04678 1.04676 1.04677 12.069 12.082 12.078 12.076
12.000 12.631 1.04896 1.04898 1.04893 1.04896 12.601 12.607 12.594 12.601
13.000 13.684 1.05339 1.05330 1.05335 1.05335 13.651 13.628 13.642 13.640
14.000 14.737 1.05782 1.05780 1.05776 1.05779 14.691 14.687 14.678 14.685
14.999 15.788 1.06225 1.06225 1.06229 1.06226 15.725 15.725 15.733 15.728
- Brix directo
Tabla 56. Resultados para linealidad por densimetría en Brix directo
3
°B Lectura densidad (g/cm ) Lectura °B directo
Promedio Promedio
Teórico 1 2 3 1 2 3
7.000 1.02583 1.02585 1.02585 1.02584 6.996 6.999 6.999 6.998
8.000 1.02991 1.02991 1.02993 1.02992 8.000 8.001 8.004 8.002
9.000 1.03401 1.03401 1.03401 1.03401 9.004 9.002 9.004 9.003
10.000 1.03813 1.03813 1.03813 1.03813 10.002 10.003 10.004 10.003
11.000 1.04228 1.04228 1.04228 1.04228 11.004 11.005 11.006 11.005
11.500 1.04436 1.04437 1.04437 1.04437 11.505 11.505 11.504 11.505
12.000 1.04639 1.04647 1.04641 1.04642 11.989 12.010 11.993 11.997
13.000 1.05062 1.05070 1.05066 1.05066 12.994 13.014 13.004 13.004
13.997 1.05480 1.05485 1.05487 1.05484 13.983 13.994 14.000 13.992
15.000 1.05917 1.05915 1.05916 1.05916 15.008 15.003 15.004 15.005
122
POSTOBÓN S.A.
Resultados para lectura en refractómetro
- Brix invertido
Tabla 57. Resultados para linealidad por refractometría en Brix invertido
Lectura índice de
°B °B Inv. Promedio Lectura °B Inv. Promedio
refracción
Teórico Teórico (IR) (°B inv.)
1 2 3 1 2 3
7.000 7.369 1.34372 1.34372 1.34372 1.34372 7.37 7.37 7.37 7.37
8.000 8.421 1.34531 1.34531 1.34531 1.34531 8.43 8.43 8.43 8.43
9.001 9.474 1.34692 1.34692 1.34693 1.34692 9.50 9.50 9.51 9.50
10.000 10.526 1.34849 1.34849 1.34849 1.34849 10.53 10.53 10.53 10.53
11.000 11.579 1.35010 1.35010 1.35009 1.35010 11.57 11.58 11.57 11.57
11.499 12.104 1.35090 1.35090 1.35091 1.35090 12.11 12.09 12.10 12.10
12.000 12.631 1.35172 1.35171 1.35171 1.35171 12.62 12.61 12.62 12.62
13.000 13.684 1.35332 1.35332 1.35332 1.35332 13.65 13.65 13.65 13.65
14.000 14.737 1.35498 1.35497 1.35496 1.35497 14.71 14.69 14.69 14.70
14.999 15.788 1.35664 1.35664 1.35664 1.35664 15.76 15.76 15.76 15.76
- Brix directo (rango bajo)
Tabla 58. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango bajo
°B Lectura índice de refracción Promedio Lectura °B directo Promedio

Teórico 1 2 3 (IR) 1 2 3 (°B)
7.000 1.34325 1.34326 1.34325 1.34325 7.00 7.01 7.00 7.00
8.000 1.34477 1.34476 1.34477 1.34477 8.00 8.00 8.00 8.00
9.000 1.34630 1.34630 1.34633 1.34631 9.01 9.01 9.02 9.01
10.000 1.34785 1.34786 1.34786 1.34786 10.02 10.03 10.02 10.02
11.000 1.34936 1.34936 1.34936 1.34936 11.00 11.00 11.00 11.00
11.500 1.35014 1.35014 1.35014 1.35014 11.50 11.50 11.50 11.50
12.000 1.35093 1.35093 1.35092 1.35093 12.00 12.01 12.00 12.00
13.000 1.35247 1.35250 1.35248 1.35248 12.99 13.01 12.99 13.00
13.997 1.35401 1.35401 1.35402 1.35401 13.96 13.96 13.96 13.96
15.000 1.35566 1.35566 1.35567 1.35566 14.99 14.99 15.00 14.99
123
POSTOBÓN S.A.
- Brix directo (rango alto)
Tabla 59. Resultados para linealidad por refractometría en Brix directo rango alto
°B Lectura índice de refracción Promedio Lectura °B directo Promedio

Teórico 1 2 3 (IR) 1 2 3 (°B)
7.000 1.34326 1.34326 1.34327 1.34326 7.01 7.01 7.01 7.01
8.000 1.34477 1.34477 1.34477 1.34477 8.00 8.01 8.01 8.01
9.000 1.34632 1.34633 1.34632 1.34632 9.03 9.03 9.03 9.03
10.000 1.34787 1.34787 1.34787 1.34787 10.03 10.03 10.03 10.03
11.000 1.34936 1.34937 1.34936 1.34936 11.00 11.00 11.00 11.00
11.500 1.35015 1.35016 1.35016 1.35016 11.51 11.51 11.51 11.51
12.000 1.35094 1.35093 1.35094 1.35094 12.01 12.01 12.01 12.01
13.000 1.35249 1.35251 1.35248 1.35249 13.00 13.01 12.99 13.00
13.997 1.35405 1.35403 1.35405 1.35404 13.98 13.97 13.98 13.98
15.000 1.35567 1.35569 1.35568 1.35568 15.00 15.01 15.00 15.00
30.000 1.38109 1.38109 1.38110 1.38109 29.98 29.98 29.98 29.98
34.998 1.39032 1.39032 1.39032 1.39032 35.01 35.01 35.01 35.01
39.998 1.39986 1.39987 1.39987 1.39987 40.01 40.01 40.01 40.01
45.000 1.40974 1.40976 1.40975 1.40975 44.99 45.00 45.00 45.00
50.000 1.42009 1.42008 1.42006 1.42008 50.01 50.01 50.00 50.01
55.000 1.43082 1.43082 1.43082 1.43082 55.02 55.02 55.02 55.02
60.000 1.44187 1.44184 1.44187 1.44186 59.98 60.00 59.99 59.99
64.999 1.45348 1.45346 1.45345 1.45346 65.01 65.00 65.00 65.00
Regresión lineal y homoscedasticidad de los residuos
Cada ensayo se ajusta a una regresión lineal y se hallan los correspondientes

parámetros, presentados en la tabla 60.
Tabla 60. Parámetro de regresión lineal en el análisis de linealidad
Equipo Directo Directo
Invertido Directo Invertido
(rango bajo) (rango alto)
𝑏(pendiente) 0.00414 0.00416 0.00153 0.00155 0.00186
𝑎(intersecto) 0.99668 0.99659 1.33240 1.33239 1.32843
𝑟 0.99997 0.99997 0.99997 0.99996 0.99866
𝑟2 0.99994 0.99993 0.99993 0.99992 0.99732
𝑆𝑏2 3.967E-11 4.309E-11 5.832E-12 6.970E-12 1.781E-10
𝑆𝑎2 5.631E-09 5.521E-09 8.279E-10 8.930E-10 2.016E-07
124
POSTOBÓN S.A.
La linealidad en ambos instrumentos teóricamente es polinómica, incluso los

polinomios usados para convertir IR o densidad a grados Brix tienen en la
literatura un orden de 4 ó 5. Sin embargo cuando se evalúan rangos estrechos en
este caso 7 y 15 °B, se puede ver claramente una linealidad alta confirmada en las
gráficas y en los coeficientes de correlación (mayores a 0.999). En el caso de
lecturas por refractometría para un rango de 7 a 65 °B no cumple este último
criterio, y por esta razón podemos asumir la no linealidad. La regresión en este
rango más amplio se recalculó usando un polinomio de grado 2, que arrojó los
siguientes parámetros ajustados a una ecuación del tipo:
𝑦 = 𝑎𝑥 2 + 𝑏𝑥 + 𝑐 (90)
Tabla 61. Parámetros de regresión polinómica en el análisis de linealidad por refractometría en

rango alto.
Directo
(rango alto)
𝑎 7.3600E-06
𝑏 1.3661E-03
𝑐 1.3334
𝑟 1.0000
𝑟2 1.0000
Para el densímetro se obtuvo las siguientes gráficas:
- Brix Invertido
Figura 28. Regresión lineal para densidad respecto a °B invertido
125
POSTOBÓN S.A.
Figura 29. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix
invertido
- Brix directo
Figura 30. Regresión lineal para densidad respecto a Brix directo
Figura 31. Homoscedasticidad de residuos de densidad respecto a la densidad estimada para Brix
directo
126
POSTOBÓN S.A.
De las lecturas por refractometría se obtuvo las siguientes figuras de regresión

lineal y homoscedasticidad:
- Brix Invertido
Figura 32. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix invertido
Figura 33. Homoscedasticidad de residuos de índice de refracción respecto al estimado para Brix
invertido
- Brix directo (rango bajo)
Figura 34. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango bajo
127
POSTOBÓN S.A.
directo en rango bajo
- Brix directo (rango alto)
Figura 36. Regresión lineal para índice de refracción respecto a Brix directo en rango alto
directo en rango alto
128
POSTOBÓN S.A.
ANOVA y verificación de supuestos en linealidad
Tabla 62. ANOVA y pruebas de verificación de supuestos para linealidad
Verificación de supuestos (homogeneidad y normalidad de residuos)
𝐶𝐸𝑋𝑃 0.386 0.344 0.429 0.425 0.191

𝐶(𝑘, 𝑣, 𝛼) 0.445 0.445 0.445 0.445 0.296
¿Homogénea?
Si Si Si Si Si
𝛼 = 0.05
¿Normal?
𝛼 = 0.05 Si Si Si Si Si
(Kolmogorov-Smirnov)
ANOVA
𝑆𝐶𝑅𝐸𝐺 3.438E-03 3.127E-03 4.689E-04 4.320E-04 7.251E-02

𝑆𝐶𝑅𝐸𝑆 2.223E-07 2.179E-07 3.268E-08 3.525E-08 1.949E-04
𝑆𝐶𝐹𝐴 2.118E-07 2.079E-07 3.221E-08 3.374E-08 1.949E-04
𝑆𝐶𝐸𝑋𝑃 1.053E-08 1.007E-08 4.667E-10 1.507E-09 3.133E-09
𝑆𝐶𝑇 3.438E-03 3.127E-03 4.690E-04 4.321E-04 7.271E-02
𝐺𝐿𝑅𝐸𝐺 1 1 1 1 1
𝐺𝐿𝑅𝐸𝑆 28 28 28 28 52
𝐺𝐿𝐹𝐴 8 8 8 8 16
𝐺𝐿𝐸𝑋𝑃 20 20 20 20 36
𝐺𝐿 𝑇 29 29 29 29 53
𝑉𝑅𝐸𝐺 3.438E-03 3.127E-03 4.689E-04 4.320E-04 7.251E-02
𝑉𝑅𝐸𝑆 7.939E-09 7.784E-09 1.167E-09 1.259E-09 3.748E-06
𝑉𝐹𝐴 2.647E-08 2.598E-08 4.027E-09 4.218E-09 1.218E-05
𝑉𝐸𝑋𝑃 5.267E-10 5.033E-10 2.333E-11 7.537E-11 8.704E-11
𝐹1 432999.89 401693.34 401762.6 343169.509 19348.32496
𝐹1.𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 4.196 4.196 4.196 4.196 4.027
¿Pendiente ≠ 0? Si Si Si Si Si
𝐹2 50.261 51.624 172.575 55.963 139935.401
𝐹2.𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎𝑠 2.447 2.447 2.447 2.447 1.934
¿Linealidad? No No No No No
129
POSTOBÓN S.A.
Significancia de la pendiente e intercepto
Tabla 63. Pruebas de significancia para pendiente e intercepto
𝑏 0.00414 0.00416 0.00153 0,00155 0,00186
𝑡𝑏 2.048 2.048 2.048 2,048 2,048
Mayor 0.004157 0.004174 0,001536 0,001552 0,001883
Intervalo (𝑏)
Menor 0.004132 0.004147 0,001526 0,001541 0,001829
¿𝑏 ≠ 0 ? Si Si Si Si Si
𝑎 0.99668 0.99659 1.33240 1,33239 1,32843
𝑡𝑎 2.048 2.048 2.048 2,048 2,048
Mayor 0.99683 0.99674 1,33246 1,33245 1,32933
Intervalo (𝑎)
Menor 0.99652 0.99644 1,33235 1,33233 1,32753
¿𝑎 = 0? No No No No No
El método llevado a cabo por densimetría y refractometría en rango bajo, directo o

invertido, tiene un coeficiente de correlación satisfactorio; sin embargo la
homoscedastisidad, especialmente en el densímetro, nos muestra una curva de
residuos en forma de U invertida muy similar a la que se debería obtener de datos
que siguen una función polinómica. De la misma manera, el método falla en
linealidad según la prueba ANOVA para regresión, esto porque la repetibilidad de
cada serie de datos es muy buena (numéricamente baja), y aumenta
significativamente el valor F2, usado para la verificación de linealidad. Pese a esto
se corrobora que la pendiente es estadísticamente diferente de cero tanto en la
ANOVA como en la prueba t de significancia. El intercepto de la regresión lineal
para los dos métodos es diferente de cero, hecho indiscutible teniendo en cuenta
que para ambos equipos el mínimo valor de Brix es el obtenido cuando se analiza
agua destilada, que tiene una señal distinta de cero, 0.99820 g/cm3 para el
densímetro y un índice de refracción 1.333 para el refractómetro.
Las lecturas en refractometría para rango alto son claramente no lineales, hecho
que se puede verificar directamente en la gráfica o en el coeficiente de correlación
0.9986.
En general se puede confirmar la no linealidad entre las señales, densidad e

índice de refracción, y los grados Brix de las soluciones. Sin embargo si tenemos
como criterio único el coeficiente de correlación, se puede asumir con un buen
grado de confianza, que existe una buena linealidad para un rango de 7 a 14 °B en
ambos equipos.
130
POSTOBÓN S.A.
5.3.8.4. Rango
A partir de los datos de linealidad obtenemos la recuperación y sesgo a distintas

concentraciones, reportados en las tablas 64, 65 y 66. Con estos valores se
establece el rango de trabajo permitido.
Tabla 64. Recuperación (%) para datos de linealidad
Concentración/Equipo Directo
(rango bajo)
7.00 100.00 99.96 100.02 100.04
8.00 99.99 100.02 100.11 100.00
9.00 99.93 100.04 100.31 100.15
10.00 99.85 100.03 100.04 100.23
11.00 99.81 100.04 99.95 100.00
11.50 99.77 100.04 99.97 100.00
12.00 99.76 99.98 99.89 100.03
13.00 99.68 100.03 99.75 99.98
14.00 99.65 99.96 99.73 99.73
15.00 99.62 100.03 99.82 99.95
Tabla 65. Sesgo (°B) para datos de linealidad
Concentración/Equipo Directo
(rango bajo)
7.00 0.000 -0.002 0.001 0.003
8.00 -0.001 0.002 0.009 0.000
9.00 -0.006 0.003 0.029 0.013
10.00 -0.016 0.003 0.004 0.023
11.00 -0.023 0.005 -0.006 0.000
11.50 -0.027 0.004 -0.004 0.000
12.00 -0.030 -0.003 -0.014 0.003
13.00 -0.043 0.004 -0.034 -0.003
14.00 -0.051 -0.005 -0.040 -0.037
15.00 -0.060 0.005 -0.028 -0.007
Los dos equipos tanto en Brix invertido como directo presentan una excelente
recuperación en las concentraciones evaluadas; sin embargo, el sesgo en las
lecturas invertidas son claramente altas. Esto puede tener varias causas: la
muestra no fue totalmente invertida, aunque ya se ha verificado que la inversión si
es total, o la sacarosa pesada tenía trazas de otros componentes, en esto último
afecta principalmente la humedad.
Las lecturas en Brix invertido en el densímetro tienen un sesgo aceptable para

concentraciones entre 7 y 12 °B, en directo se acepta todo el rango (7 a 15 °B).
Similarmente en el refractómetro para el rango de calibración bajo se recomienda
131
POSTOBÓN S.A.
una lectura entre 7 y 12 °B para muestras invertidas, y entre 7 y 13 °B para

directas.
Tabla 66. Recuperación y sesgo (°B) para datos de linealidad por refractometría en rango alto
Refractómetro (Rango alto)

Concentración/Equipo
%R Sesgo (°B)
7.00 100.14 0.010
8.00 100.08 0.007
9.00 100.33 0.030
10.00 100.30 0.030
11.00 100.00 0.000
11.50 100.08 0.010
12.00 100.08 0.010
13.00 100.00 0.000
14.00 99.85 -0.021
15.00 100.02 0.003
30.00 99.93 -0.020
35.00 100.03 0.012
40.00 100.03 0.012
45.00 99.99 -0.003
50.00 100.01 0.006
55.00 100.04 0.020
60.00 99.98 -0.010
65.00 100.01 0.007
Para el caso específico de análisis de grados Brix en jarabes (rango alto), el sesgo
es aceptable en todo el rango evaluado (7 a 65 °B), sin embargo las lecturas de
Brix a concentraciones bajas (9 y 10 °B) tienen un sesgo alto. Por lo tanto se
recomienda no hacer mediciones a soluciones con similares concentraciones
cuando se tiene calibrado el refractómetro para lecturas en rango alto.
Para las respuestas aproximadamente lineales la sensibilidad se expresa como la

pendiente de la ecuación de calibración, según la tabla 67.
Tabla 67. Sensibilidades para respuestas aproximadamente lineales
Invertido Directo Invertido Directo (rango bajo)
Concentración/Equipo
𝒈/𝒄𝒎𝟑 𝒈/𝒄𝒎𝟑 𝑰𝑹 𝑰𝑹
°𝑩 °𝑩 °𝑩 °𝑩
Sensibilidad 0.004145 0.004161 0.001531 0.001547
132
POSTOBÓN S.A.
En el caso de respuestas no lineales (rango alto), se puede usar la siguiente

ecuación, que corresponde a la derivada del polinomio y así calcular la
sensibilidad a distintas concentraciones:
𝑦 = 1,472 ∗ 10−5 𝑥 + 1,3661 ∗ 10−3 (91)
Donde 𝑥 es la concentración en grados Brix y 𝑦 la sensibilidad en 𝑰𝑹

°𝑩
De igual forma en la tabla 68 está reportada la sensibilidad para distintas

concentraciones.
Tabla 68. Sensibilidades a varias concentraciones para rango alto en refractometría
Directo (rango alto)

𝑰𝑹
°B Sensibilidad
°𝑩
7.00 0.00147
8.00 0.00148
9.00 0.00150
10.00 0.00151
11.00 0.00153
11.50 0.00154
12.00 0.00154
13.00 0.00156
14.00 0.00157
15.00 0.00159
30.00 0.00181
35.00 0.00188
40.00 0.00195
45.00 0.00203
50.00 0.00210
55.00 0.00218
60.00 0.00225
65.00 0.00232
Estas sensibilidades son numéricamente bajas, sin embargo si tomamos en

cuenta la precisión de cada instrumento en la señal de respuesta, 0.00003 como
índice de refracción para el refractómetro y 0.000005 g/cm3 para el densímetro, se
puede observar que la sensibilidad es relativamente alta
133
POSTOBÓN S.A.
5.3.8.6. Precisión
Repetibilidad
La repetibilidad instrumental en el densímetro aunque fue calculada no se ajusta a

los requerimientos necesarios para ser considerada como repetible, ya que el
instrumento cuando realiza la lectura en una muestra puede regresar parte de esta
al vial con la muestra original y contaminarla, después de la tercera lectura se
obtienen datos no concordantes e incluso se obtienen desviaciones estándar
mayores a las obtenidas en la repetibilidad del método, lo cual es claramente
improbable.
El rango alto (hasta 60 °B) para el refractómetro se usa específicamente en la

lectura de jarabes, estas muestras no son sometidas a ningún tipo de inversión y
por lo tanto su análisis no requiere ningún pre-tratamiento, por tal motivo la
repetibilidad del método será la misma que la repetibilidad del instrumento.
Los resultados a distintas concentraciones en el análisis de repetibilidad se

reportan en la tabla 69.
Tabla 69. Repetitividades para densimetría y refractometría
Concentración
8.421 11.579 14.736 8.421 11.579 14.736 40.00 60.00
(°B inv.)
n 10 10 10 10 10 10 10 10
Promedio (°B)
Instrumento N/A N/A N/A 8.411 11.567 14.673
40.008 59.985
Método 8.424 11.546 14.688 8.434 11.556 14.700
Desviación estándar (°B)
0.0042 0.0135
Método 0.0035 0.0033 0.0080 0.0051 0.0070 0.0047
Coeficiente de variación CV (%)
0.0105 0.0225
Método 0.0416 0.0289 0.0548 0.0612 0.0605 0.0321
Los intervalos de confianza para los promedios se calculan a partir de un 𝑡 =

2,2622, calculado para 𝛾 = 9 y 𝛼 = 0,05.
134
POSTOBÓN S.A.
Tabla 70. Intervalos de confianza para densimetría y refractometría en el análisis de repetibilidad
Concentración Densímetro (°B) Refractómetro (°B)

Teórica (°B inv.) Instrumento Método Instrumento Método
8.421 N/A 8.424±0.00251 8.411±0.00226 8.434±0.00369
11.579 N/A 11.546±0.00238 11.567±0.00346 11.556±0.00500
14.736 N/A 14.688±0.00575 14.673±0.00346 14.700±0.00337
40.00 N/A N/A 40.008±0.00302
60.00 N/A N/A 59.985±0.00969
Precisión intermedia
Antes de realizar cualquier análisis sobre la precisión intermedia se debe

determinar si los analistas tienen una varianza similar, para esto usamos una
prueba F tal como se indica en la tabla 71.
Tabla 71. Verificación de varianzas similares entre analistas para precisión intermedia
Equipo Densímetro Refractómetro

Concentración (°B inv.) 8.421 14.736 8.421 14.736
n (por analista) 9 9 9 9
𝐹 0.860 1.109 1.688 1.000
𝛾1 = 𝛾2 8 8 8 8
𝐹1−∝/2 0.226 0.226 0.226 0.226
𝐹∝/2 4.433 4.433 4.433 4.433
¿Varianzas iguales?
Si Si Si Si
(𝛼 = 0.05)
Tabla 72. Resultados del análisis de precisión intermedia

Concentración (°B inv.) 8.421 14.736 8.421 14.736
n (por analista) 9 9 9 9
n (total) 18 18 18 18
Promedio (°B)
Analista 1 8.412 14.676 8.427 14.683
Analista 2 8.416 14.679 8.432 14.683
Total 8.414 14.677 8.429 14.683
Desviación estándar (°B)
Analista 1 0.00592 0.00985 0.00866 0.00500
Analista 2 0.00638 0.00935 0.00667 0.00500
Total 0.00628 0.00949 0.00802 0.00485
Coeficiente de variación CV (%)
Analista 1 0.0703 0.0671 0.1028 0.0341
Analista 2 0.0758 0.0637 0.0791 0.0341
Total 0.0746 0.0646 0.0952 0.0330
135
POSTOBÓN S.A.
Los intervalos de confianza de los promedios se calculan para cada analista a

partir de un 𝑡 = 2,306, calculado para 𝛾 = 8 y 𝛼 = 0,05, en el caso del intervalo de
confianza global un 𝑡 = 2,1098, calculado para 𝛾 = 17 y 𝛼 = 0,05
Tabla 73. Intervalos de confianza para la precisión intermedia
Intervalos de confianza
Concentración
8.421 14.736 8.421 14.736
(°B inv.)
Analista 1 8.412±0.00455 14.676±0.00757 8.427±0.00666 14.683±0.00384
Analista 2 8.416±0.00490 14.679±0.00719 8.432±0.00512 14.683±0.00384
Total 8.414±0.00312 14.677±0.00472 8.429±0.00399 14.683±0.00241
El método pasa los criterios de aceptación para la repetibilidad y precisión

intermedia en las concentraciones evaluadas, las desviaciones estándar son
menores a 0.02 y 0.03 °B respectivamente, y la precisión intermedia es menor a
dos veces la repetibilidad del método en términos del coeficiente de variación
coeficiente de variación.
Cabe anotar que a los jarabes no se les hace ningún pre-tratamiento, la lectura se
realiza directamente en el refractómetro y prácticamente en ausencia de pasos
intermedios, por esto se puede asumir que la repetibilidad del método y precisión
intermedia son similares.
5.3.8.7. Exactitud
Exactitud por datos de linealidad
Ver tablas 64 y 65.
Exactitud por patrones
En el densímetro para la calibración con agua destilada se calculan los siguientes

sesgos:
Tabla 74. Resultados de exactitud para calibración con agua destilada en densimetría
Densidad Teórica Densidad Promedio Sesgo

Patrón T (°C) 3 n 3 3
(g/cm ) (g/cm ) (g/cm )
Agua ultra-pura 20 0.99820 5 0.998204 0.000004
En la calibración con patrón de referencia se calcula el sesgo de la señal y de

grados Brix arrojando los siguientes resultados:
136
POSTOBÓN S.A.
Tabla 75. Resultados de exactitud para calibración con patrón de referencia en densimetría
T Densidad Teórica Densidad Promedio Sesgo

Estándar 3 n 3 3
(°C) (g/cm ) (g/cm ) (g/cm )
Agua 20.00 0.99820 3 0.99817 -0.00003
8 °B 20.00 1.02995 3 1.02989 -0.00006
11 °B 20.00 1.04230 3 1.04227 -0.00003
14 °B 20.00 1.05495 3 1.05490 -0.00005
T
Estándar °B Teórico n °B Promedio %R Sesgo (°B)
(°C)
Agua 20.00 0.000 3 - - -
8 °B 20.00 8.000 3 7.994 99.921 -0.006
11 °B 20.00 11.000 3 11.003 100.030 0.003
14 °B 20.00 14.000 3 14.007 100.052 0.007
Para el análisis de Brix en el refractómetro se calcularon los siguientes sesgos:
Tabla 76. Resultados de exactitud para refractómetro en un rango de calibración alto y bajo
°B °B
Rango Patrón T (°C) n %R Sesgo
Teórico Promedio
AG12.50 23.9 12.17 3 12.183 100.11 0.013
Bajo
Solución sacarosa
23.9 25.00 3 24.987 99.95 -0.013
25.00 °B
Solución sacarosa
23.3 25.00 3 25.020 100.08 0.020
25.00 °B
Solución sacarosa
Alto 23.2 60.00 3 60.020 100.03 0.020
60.00 °B
OIL BSLP23 23.1 71.35 1 71.380 100.04 0.030
El método en general es satisfactorio teniendo en cuenta los criterios de

aceptación, todos los sesgos fueron menores a 0,03 °B en el rango de trabajo y
respecto a los patrones que, en algunos casos, superaban las concentraciones de
los rangos de calibración.
Debido a que los datos se encuentran agrupados en conjuntos de 10 lecturas y a

diferentes concentraciones, es necesario el cálculo por el procedimiento de suma
de cuadrados.
137
POSTOBÓN S.A.
Método por densimetría
Tabla 77. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando densímetro
Ensayo 1 2 3 4 5 6
Promedio (°B) 11.23 10.50 11.23 10.89 11.23 10.50
Desv. estándar
0.010 0.011 0.008 0.011 0.010 0.011
(°B)
ni 10 10 10 10 10 10
2
SCi (°B ) 0.0008656 0.0011641 0.0005401 0.0010081 0.0008656 0.0011641
Parámetro Valor Observación
2
SCP (°B ) 0.0056076
2
VP (°B ) 0.0001038
SDP (°B) 0.0101904
Corresponde a la mayor desviación estándar en el estudio de
SDr (°B) 0.00804
repetibilidad del método para el densímetro (tabla 69)
SDL (°B) 0.00626
2*SDL (°B) 0.01251
Corresponde al mayor sesgo encontrado en el densímetro (tabla
Sesgo (°B) 0.007
75)
Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal de
U (°B) 0.02038
los datos.
Método por refractometría (rango bajo)
Tabla 78. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en
un rango de calibración bajo
Ensayo 1 2 3 4 5 6
Promedio (°B) 11.20 10.52 11.23 10.91 11.20 10.52
Desv. estándar
0.007 0.010 0.010 0.011 0.007 0.010
(°B)
ni 10 10 10 10 10 10
2
SCi (°B ) 0.00044 0.00096 0.00089 0.00104 0.00044 0.00096
2
SCP (°B ) 0.0059400
2
VP (°B ) 0.0000943
SDP (°B) 0.0097101
Corresponde a la mayor desviación estándar en el estudio de
SDr (°B) 0.00699 repetibilidad del método para el refractómetro en el rango bajo
(tabla 69)
SDL (°B) 0.00674
2*SDL (°B) 0.01348
Corresponde al mayor sesgo encontrado en el refractómetro
Sesgo (°B) 0.013
para el rango bajo (tabla 76)
Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal de
U (°B) 0.01942
los datos.
138
POSTOBÓN S.A.
Método por refractometría (rango alto)
Tabla 79. Resultados parciales e incertidumbre reportada para el método usando refractómetro en
un rango de calibración alto
Muestra Control
Parámetro
60 °B
Promedio (°B) 59.987
Desv. estándar (°B) 0.0141
ni 30
2
SCi (°B ) 0.00579

2
VP (°B ) 0.0001995
SDP (°B) 0.0141259
Corresponde a la desviación estándar en el estudio de
SDr (°B) 0.0135
repetibilidad para el refractómetro a 60 °B (tabla 69)
SDL (°B) 0.00416
2*SDL (°B) 0.00832
Corresponde al mayor sesgo encontrado en el refractómetro
Sesgo (°B) 0.030
para rango alto (tabla 76)
Nivel de confianza de 95 % y asumiendo distribución normal
U (°B) 0.02825
de los datos.
El estimado de la incertidumbre es muy bajo y satisfactorio, menor a 0.06 °B. Se

resalta que este parámetro está asociado al Laboratorio Central, el cual dispone
de buenos equipos y se encuentra metrológicamente un rango más alto que los
laboratorios ubicados en las plantas productoras. Un hecho peculiar se reporta en
el cálculo de incertidumbre para el refractómetro en rango alto, el valor 2*SDL
(0.00832 °B) es mucho menor al sesgo reportado (0.03 °B), cuando, en teoría,
este último debería ser menor. Se atribuye este hecho a que la repetibilidad del
método es muy similar al SDP y por lo tanto su diferencia es muy pequeña, sin
embargo el sesgo queda definido y es reportado en conjunto con la incertidumbre
para evitar futuras confusiones.
139
POSTOBÓN S.A.
5.4. CONCLUSIONES
Los métodos de análisis fisicoquímico en POSTOBÓN S.A. en general poseen

pequeñas diferencias respecto a los publicados por organizaciones de referencia
nacionales e internacionales; las diferencias encontradas se documentaron y
comunicaron con el fin de realizar los ajustes pertinentes, actualmente se lleva a
cabo este proceso de forma interna en la compañía.
La validación arrojó valores que en general cumplieron los criterios de aceptación

señalados. El parámetro que menos se ajustó a lo requerido fue la linealidad; sin
embargo es bien sabido que las respuestas, índice de refracción o densidad, y los
valores dados como grados Brix se ajustan a una ecuación polinómica, que
incluso es usada internamente en los equipos para realizar la conversión
respectiva.
La precisión en general para el Laboratorio Central fue satisfactoria, los valores

encontrados se usarán como referencia para la aceptación o rechazo de lecturas
dudosas. Se verificó, además, el rango de trabajo comprendido entre 7 y 12 °B
para bebidas gaseosas y 7 a 60 °B para jarabes; se estableció el sesgo en cada
nivel de concentración y la incertidumbre asociada en cada equipo.
Otros parámetros como la especifidad confirmaron la identidad en la medición, en

otras palabras, lo que realmente se está midiendo es azúcar y que las
interferencias, aunque contribuyen en la lectura, no lo hacen de manera
significativa.
Se verificó en su totalidad la capacidad del Laboratorio Central para efectuar el

análisis de Brix en bebidas gaseosas y jarabes.
La prueba de robustez fue la que más tiempo de análisis requirió, de esta se

extrajeron conclusiones que pueden ser de interés para quienes ejecuten el
método. Se cuantificaron los efectos de los factores que contribuyen negativa o
positivamente el análisis de grados Brix en bebidas gaseosas y jarabes, se
estableció que:
- Las muestras no deben dejarse por ningún motivo más de 24 horas sin
debido almacenamiento.
- No se requiere eliminación de burbujas por ultrasonido para jarabes.
- La cantidad de HCl 2.5 normal necesario para una inversión total está entre 1
gota (0.05 ml) y 4 gotas (0.2 ml), cantidades menores o mayores pueden
afectar los resultados, aunque esto depende de la matriz analizada.
- En el rango evaluado de 20 a 30 ml el volumen a invertir no es significativo.
- La temperatura de inversión debe ser mayor a 90 °C.
140
POSTOBÓN S.A.
- La agitación de las muestras antes de la lectura es relevante para el

refractómetro mas no para el densímetro.
- El tiempo mínimo de retardo en la lectura para muestras entre 10 y 30 °C es
de 50 segundos, cuando estas estén a temperatura ambiente el análisis
puede realizarse a 3 segundos o menos.
En posteriores validaciones se tiene como referente el presente estudio. El marco

teórico y las metodologías expuestas serán la base del protocolo a seguir, esto
con miras a la acreditación del laboratorio según la NTC ISO/IEC 17025.
En la tabla 80 se presenta una síntesis de los parámetros de validación calculados

en el presente estudio.
Tabla 80. Reporte de validación para método de determinación de grados Brix por densimetría y
refractometría.
Parámetro Densimetría Refractometría Refractometría Criterio de

(rango bajo) (rango alto) aceptación
𝑆𝑝𝑒𝑐 (𝐴𝑖𝑛𝑣 ) 0.9553 * 0.9352 * N/A > 0.9
Especifidad
𝑆𝑝𝑒𝑐 (𝐴𝑑𝑡𝑜 ) 0.9367 * 0.9262 * N/A > 0.9
𝑟 0.99997 0.99996 0.99866 > 0.999

Linealidad
ANOVA No cumple No cumple No cumple
Invertido 7 - 12 °B 7 - 12 °B N/A
Rango
Directo 7 - 15 °B 7 - 13 °B 7 – 65 °B
g/cm 3 IR
Invertido 0.004145 0.001531 N/A
°B °B
Sensibilidad
g/cm 3 IR 𝑦 = 1.472 ∗ 10−5 𝑥
Directo 0.004161 0.001547 + 1.3661 ∗ 10−3
°B °B
Desviación
Repetibilidad 0.0080 °B * 0.0070 °B * 0.0135 °B * < 0.02 °B
estándar
Precisión Desviación
0.00949 °B * 0.00802 °B * 0.0135 °B * < 0.03 °B
intermedia estándar
Sesgo
Exactitud 0.007 °B * 0.013 °B * 0.030 °B * < 0.03 °B
(Patrón)
Incertidumbre U (95 %) 0.02038 °B 0.01942 °B 0.02825 °B < 0.06 °B
* Corresponde a la concentración/solución con el valor del parámetro más cercano al criterio de
aceptación (el peor de los casos).
141
POSTOBÓN S.A.
5.5. RECOMENDACIONES Y TRABAJOS FUTUROS
Para estudios futuros en el método de análisis Brix, sea por adquisición de

equipos nuevos, cambio de tecnologías u otras modificaciones al método, se
recomienda tener en cuenta los parámetros de validación calculados como una
referencia y ayudarse de los estudios de robustez para determinar las condiciones
que pueden o no afectar significativamente el método.
En POSTOBÓN S.A. se planea realizar la validación en varios métodos que tienen

características similares; los diseños de experimentos y cálculos efectuados en el
presente trabajo junto con el marco teórico sentarán las bases para estos
estudios, sin embargo se debe tener en cuenta que no es necesario evaluar todas
las características con el detalle que se hizo en el presente proyecto; esto
dependerá del alcance que se le quiera dar al estudio.
142
POSTOBÓN S.A.
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National Academies Press, Washington, D.C. 2004.
COLOMBIANA NTC-ISO-IEC 17025: Requisitos Generales de Competencia de Laboratorios de
Ensayo y Calibración. Bogotá. 2001.
144

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INFORME DE PRÁCTICA PROFESIONAL

HOMOLOGACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS FISICOQUÍMICO EMPLEADOS

FRANKY ESTEBAN BEDOYA LORA

Tabla 1. Parámetros de rendimiento relacionados según el requerimiento analítico 23

Figura 1. Ciclo de validación 16

ANEXO A. TABLA PARA ESTADÍSTICO DE COCHRAN

La compañía POSTOBÓN S.A. lleva un largo recorrido en el desarrollo,

Una de las áreas de Postobón S.A. es la División Nacional de Gestión de Calidad

Los métodos utilizados además de estar debidamente estandarizados y validados

Inicialmente se realiza una homologación general para los métodos de análisis

Se establecen entonces los parámetros de rendimiento del método para

incertidumbre en dos instrumentos, densímetro y refractómetro, que establecerá el

En el presente trabajo se realiza una homologación de métodos fisicoquímicos en

Además, se desarrolla todo el proceso de validación del método para

A homologation of physicochemical methods was carried out respect to national

Homologar los métodos empleados para los análisis fisicoquímicos en

- Revisar y homologar los métodos de ensayo fisicoquímico descritos en las

- Validar el método para la determinación de grados Brix en bebidas por

- Establecer un protocolo de validación que incluya los aspectos mencionados

4.1.1. Definición, importancia y necesidad de validación

4.1.1.1. Definición general e importancia del proceso de validación

La validación puede definirse como: i) El establecimiento de una base de datos

La validación de un método, generalmente, está íntimamente relacionada con el

Por otro lado, acompañando el proceso de validación, está la transferencia de

En la figura 1 se esquematiza el ciclo de una validación, en teoría éste se repite

Figura 1. Ciclo de validación.

4.1.1.2. Necesidad de una validación

Eurachem, una asociación europea de laboratorios focalizada en el mejoramiento

1. Las mediciones analíticas deben hacerse para satisfacer un objetivo definido.

6. Las organizaciones encargadas de realizar estos análisis deben tener bien

En el segundo principio se pueden encontrar de forma implícita la validación y por

4.1.1.3. Cuándo realizar una validación

La validación se encuentra dentro de un proceso de mejoramiento de la calidad de

- Se desarrolla un nuevo método para un problema en particular (primera

El proceso de validación está limitado por el alcance que se requiere, es

4.1.2. Clasificación de métodos analíticos

4.1.2.1. Según la normalización y estado de desarrollo del método

Métodos estándar o normalizados

Los métodos estándar son aquellos publicados por organizaciones

Estos métodos incluyen aquellos publicados por:

- United States Pharmacopeia (USP)

Se prefiere usar los métodos estándar, sin embargo es necesaria la verificación de

Aquellos métodos especificados por fabricantes de equipos de análisis también

Métodos desarrollados por el laboratorio

Para la evaluación de la capacidad del método se sugiere realizar comparaciones

4.1.2.2. Según categoría de método [5]

Lo métodos también pueden clasificarse según el ámbito en el cual es usado,

- Categoría I: para la cuantificación de materia prima o principio activo en

4.1.3. Algoritmo de validación (aspectos logísticos)

A continuación se ilustran los pasos a seguir y preguntas que se deben auto-

4.1.3.1. Principales preguntas a realizar

¿Quién debe llevar a cabo la validación del método?

El laboratorio que usa un método es responsable de asegurar que este sea

¿Es posible una validación por estudio colaborativo o interlaboratorios?

La validación de un método de forma aislada reduce la cantidad de datos que

Es de anotar que The Association of Official Analytical Chemists (AOAC

En el caso de POSTOBÓN S.A. la validación del método concierne sólo al

4.1.3.2. Decisión del grado de validación requerido

El laboratorio de por sí debe decidir cuáles de los parámetros para la evaluación

Los factores que definen el alcance de una validación son:

- Frecuencia de uso en el laboratorio: rutina diaria, esporádica, etc.

4.1.3.3. Requerimiento analítico

Se deben tener en cuenta los requerimientos analíticos que debe afrontar el

Figura 2. Diagrama de desarrollo, validación y ajuste de un método analítico