BT0003 POLIMORFISMOS DE ADN: SU APLICACIN EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENETICAS de Vernica Ferreiro (Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA) Introduccin

El genoma humano no es ms que un manual de instrucciones para construir y hacer funcionar un ser humano, en su interior se ocultan miles de genes y millones de otras secuencias que constituyen un tesoro de secretos filosficos... Matt Ridley. Genoma

En el mbito de la biologa molecular, pocos trminos son ms difciles de definir y generan tantas controversias como el de polimorfismos. En una secuencias de ADN que se distribuyen de forma ms o menos aleatoria a lo largo del aproximacin a su definicin podemos decir que los polimorfismos son genoma y presentan como caracterstica singular el hecho de ser polimrficas. Esto ltimo secuencias de ADN que, normalmente es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias la caracterstica primordial del anlisis gentico, la variabilidad. Por lo general, los polimorfismos se encuentran en regiones no codificantes del genoma lo cual garantiza que no se alterar el producto de ningn gen. Sin embargo, pueden existir secuencias polimrficas en regiones codificantes (polimorfismos exnicos) que no afectan al producto gnico (en su mayora son polimorfismos donde vara un solo nucletido) o que afectan al producto generando un fenotipo alterado. Un locus corresponde a un lugar en el genoma y las variantes de un locus es lo que se conoce como alelos. Por ejemplo, todos los genes pertenecientes a autosomas presentan 2 alelos, uno materno y otro paterno. Tambin se pueden distinguir distintos alelos para los loci implicados en enfermedades, alelos normales y mutados como el alelo F508 de la

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fibrosis qustica (Kapoor et al., 2006). Sin embargo, este tipo de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no seran tiles en los estudios de segregacin. Por el contrario las secuencias polimrficas utilizadas en estudios indirectos presentan por definicin varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la poblacin (en general superior al 1%).

Tipos de Polimorfismos

Como ya se ha dicho, la caracterstica primordial de las secuencias polimrficas es su variabilidad, veamos ahora en qu consiste dicha variabilidad. Bsicamente existen dos tipos de polimorfismos, los que derivan de la sustitucin de un nucletido por otro y los que derivan de la insercin o delecin de secuencias de ADN. En estos ltimos distinguimos dos subtipos: las inserciones o deleciones de fragmentos de ADN, como las secuencias Alu (Terreros et al., 2005) y las repeticiones de secuencias de dos o ms nucletidos. 1) Polimorfismo de nucletido nico SNP (single nucleotide polymorphism): representa una variacin en un nico nucletido. Si este cambio de nucletido afecta el sitio de restriccin de una enzima estamos en presencia de los llamados polimorfismos de restriccin RFLPs (restriction fragment length polymorphisms) (polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin). Cuando el cambio de un nucletido altera la diana para una determinada enzima de restriccin podemos detectar el polimorfismo en funcin de la variacin que ste genera en el patrn de restriccin. En este caso el nmero de variantes allicas es siempre dos (C: corta / NC: no corta) y los genotipos tres (homocigota C/C, heterocigota C/NC y homocigota NC/NC) (Figura 1.a). Es por ello que su utilizacin en el diagnstico indirecto es limitada.
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2) Polimorfismos de repeticin VNTRs (variable number of tandem repeats) (repeticiones en tandem de nmero variable). Existen dos tipos de polimorfismos de repeticin de uso en diagnstico gentico, los minisatlites y los microsatlites. - Los minisatlites son secuencias de ADN de unas pocas decenas de nucletidos repetidas en tandem. El nmero de dichas repeticiones puede variar de cromosoma a cromosoma. La singularidad ms especial de este tipo de polimorfismos radica en que para cada locus pueden observarse muchas variantes allicas, sin embargo presentan el inconveniente de que no estn distribuidos por todo el genoma y por lo tanto slo pueden ser utilizados en el diagnstico de un nmero muy reducido de enfermedades. Los minisatlites han encontrado su mxima aplicacin en la determinacin de la paternidad y en los protocolos de identificacin gentica en el marco judicial, aunque en la actualidad los microsatlites y los SNPs han cobrado tambin gran importancia en estos mbitos. - Los microsatlites STRs (short tandem repeats) (repeticiones cortas en tandem) son por excelencia los polimorfismos utilizados en el diagnstico gentico. Corresponden a la repeticin en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos. Presentan dos caractersticas que los hacen ideales para su uso. En primer lugar, estn distribuidos de forma casi homognea por todo el genoma y en segundo lugar, presentan un nmero elevado de variantes allicas con frecuencias similares entre s, de forma que la probabilidad de que un individuo sea heterocigota es muy elevada (presentan una alta heterocigosidad). Los polimorfismos ptimos para la realizacin de estudios de segregacin sern los que se localicen dentro del gen de inters (intragnicos), lo que sugiere que habr dese quilibrio de ligamiento (estarn ligados) entre la secuencia polimrfica y la enfermedad. Su deteccin se realiza normalmente mediante la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Figura 1.b).
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Figura 1: Polimorfismos empleados en el diagnstico de enfermedaes hereditarias.

a)
Polimorfismo de restriccin

NO CORTA CORTA

PCR
b)
Polimorfismo de repeticin

Se muestran los dos tipos de polimorfismos principalmente utilizados en el diagnstico de patologas hereditarias. a) RFLP: la flecha roja indica el corte con una enzima de restriccin. Las variantes allicas posibles para el polimorfismo son corta y no corta. b) VNTR: los rectngulos verdes indican la cantidad de repeticiones en cada alelo (5 repeticiones en un alelo y 8 en el otro). Puede presentar muchas variantes allicas.

Supongamos que queremos saber si el locus a, que est implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una secuencia polimrfica de ADN. Lo primero que necesitaremos ser identificar las variantes del polimorfismo en cada uno de los miembros de una familia y estudiar su segregacin juntamente con la de la enfermedad. La aplicacin de diversos mtodos estadsticos nos permitir establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia que los separa, para luego ser utilizados como herramienta diagnstica principalmente en estudios indirectos.

El diagnstico indirecto

El diagnstico indirecto es independiente del conocimiento previo de la naturaleza molecular de la mutacin responsable de la patologa a diagnosticar y para llevarlo a cabo slo es preciso conocer la localizacin cromosmica del locus implicado. Dicha estrategia

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consiste en estudiar, en la familia del propsito, la segregacin conjunta de la enfermedad y secuencias polimrficas fsicamente prximas (ligadas) al locus de la misma. El ADN es una molcula lineal en la que las secuencias de nucletidos se hallan contiguas y distribuidas a lo largo de la doble hlice en un mundo de una dimensin. Existe por lo tanto, una relacin fsica de proximidad entre secuencias de ADN. Dicha relacin de continuidad puede alterarse en el proceso de la divisin meitica que se produce durante la formacin de las clulas germinales. En la profase de la primera divisin meitica, los cromosomas homlogos (uno proveniente de la lnea paterna y el otro de la lnea materna) intercambian material por el proceso de recombinacin o crossing over (Froenicke et al., 2002). El resultado final es tal que los cromosomas de la clula germinal madura (espermatozoide u vulo) presentan nuevas combinaciones de las secuencias existentes en la clula original. Dada la relacin fsica existente entre secuencias adyacentes en un mismo cromosoma, la frecuencia con que dos de estas secuencias se transmiten (segregan) independientemente de una generacin a la siguiente es directamente proporcional a la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es la distancia que separa a dos secuencias de ADN, menos probable es la recombinacin entre ellas y por lo tanto segregarn independientemente con una menor frecuencia. Cuando se da esta situacin decimos que ambas secuencias estn ligadas. En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en funcin de la frecuencia con que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centiMorgan (cM) (Lodish et al., 2002). Si dos loci recombinan en el 1% de las meiosis, decimos que los separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de recombinacin entre dos loci puede variar desde 0 (ntimamente ligados) hasta 50% (independientes) (Lodish et al., 2002). No siempre existe una relacin lineal entre distancia gentica (frecuencia de recombinacin
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medida en cM) y distancia fsica (nmero de nucletidos que las separan, medida en pares de bases), sino que pueden existir mecanismos moleculares, en general dependientes de la secuencia, que facilitan la recombinacin de determinados loci, como se describir ms adelante en el Captulo I de esta Tesis. El ligamiento entre secuencias de ADN se establece mediante el estudio de la segregacin de los alelos de dichas secuencias en genealogas y la realizacin posterior de clculos de distancias genticas. Es por ello que es distinto hablar de estudios de ligamiento y de segregacin. En estos ltimos no se calculan distancias genticas ni fsicas, sino que se infiere informacin acerca de una patologa en una determinada familia por medio del estudio de secuencias polimrficas que se describieron previamente como ligadas a la aparicin de la misma. Es por ello que tambin se los denomina marcadores genticos.

Aplicacin de los polimorfismos en el diagnstico de patologas genticas

1) Diagnstico indirecto de enfermedades hereditarias: El ejemplo ms sencillo de aplicacin de los polimorfismos en el diagnstico indirecto lo constituye el caso de enfermedades ligadas al cromosoma X. La familia de la Figura 2.a presenta un varn afectado (flecha) de una enfermedad hereditaria recesiva ligada al cromosoma X, como por ejemplo la Distrofia Muscular de Duchenne que se describir en el Captulo I de esta Tesis. De acuerdo con el patrn de herencia, su padre presentar el alelo normal del gen implicado en la enfermedad, mientras que su madre, que tiene un hermano afectado fallecido, ser obligatoriamente portadora del gen alterado. El varn afectado habr heredado de su madre el cromosoma con el alelo mutado responsable de la enfermedad y dada su condicin de hemicigota para el X,
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manifestar el fenotipo correspondiente a la misma. Sin embargo no podemos predecir, ms all del modelo mendeliano (Bayes, 1763), el genotipo de la hermana ni el del feto que se est desarrollando. Supongamos que existe un locus polimrfico, del tipo microsatlite, ntimamente ligado al locus de la enfermedad (frecuencia de recombinacin igual a 0). Si determinamos los alelos de dicho polimorfismo para cada uno de los miembros de la familia podremos inferir el alelo del locus de la enfermedad que porta cada individuo.

Figura 2: Genealoga de una familia en la que se hereda una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X. a.

I.1

I.2

II.1

II.2

II.3

b.
II.1 I.2 II.2 I.1 II.3

Se muestra un ejemplo de estudio indirecto. a. Genealoga de la familia estudiada. b. Resultados de la amplificacin por PCR de un STR que mapea dentro del gen de inters. Flecha roja: fragmento de 2 repeticiones, Flecha negra: 4 repeticiones y Flecha azul: 6 repeticiones.

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En la Figura 2.b se presenta, de forma simplificada, el resultado obtenido al caracterizar mediante PCR el locus polimrfico. Podemos ver que el varn afectado ha heredado de su madre el alelo de 2 repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho alelo est ligado a la mutacin responsable de la enfermedad. Segn ello, la hermana habr heredado de su padre el alelo de 4 repeticiones del polimorfismo junto con el alelo normal del gen y de su madre el alelo de 6 repeticiones que tambin en este caso segregar junto al alelo normal. Siguiendo un razonamiento similar podemos inferir que el feto analizado corresponde a una nia, ya que presenta dos alelos del polimorfismo y por lo tanto dos cromosomas X, y que dicha nia es portadora de la enfermedad por haber heredado de su madre el alelo de 2 repeticiones del polimorfismo que, como se ha indicado anteriormente, est ligado al alelo mutado causante de la enfermedad. En el ejemplo anterior se ha utilizado para el anlisis un locus altamente polimrfico, los cromosomas parentales presentan alelos distintos y por lo tanto los podemos diferenciar sin ambigedad alguna, e ntimamente ligado, es decir no existe recombinacin entre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismo que en la madre se encuentra ligado al alelo de la enfermedad segregar junto a ste en la descendencia. Estas dos caractersticas son fundamentales en el momento de elegir un determinado polimorfismo en el desarrollo de una estrategia de diagnstico indirecto. Si el marcador utilizado no presenta una gran cantidad de variantes allicas entonces pueden darse situaciones de ambigedad cuando uno o ambos padres sean homocigotas para un determinado alelo del marcador. En este caso diremos que el marcador es "no informativo" para dicha familia y por lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo para el diagnstico. Por otra parte, si el marcador o polimorfismo no esta ntimamente ligado, es decir existe la probabilidad de que ocurra una recombinacin entre el locus de la
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enfermedad y el locus polimrfico, el diagnstico deber tener en cuenta dicha probabilidad, como se ver en los Captulos sucesivos. En la Figura 3 se presenta la genealoga correspondiente a una familia en la que se estudia una enfermedad con una herencia autosmica dominante, como por ejemplo la Neurofibromatosis Tipo 1 (NF1) que se describir en el Captulo II de esta Tesis. Por lo tanto, la madre afectada tiene una probabilidad del 50% de transmitir la mutacin causante de la patologa a sus descendientes. La utilizacin de un locus polimrfico ligado a la mutacin en cuestin nos permitir establecer un diagnstico para el hijo. Se observa que la madre presenta los alelos 6 y 2 y el padre los alelos 4 y 7 del polimorfismo. La hija afectada es portadora de los alelos 2 y 7, el primero procedente de la madre y el segundo del padre. Podemos considerar que el alelo 2 en la madre est ligado al alelo mutado del locus de la enfermedad ya que es el compartido por ambas afectadas. Por lo tanto, como el hijo presenta el alelo 2 materno del polimorfismo podemos inferir que tambin ha heredado el alelo mutado del locus de la enfermedad.

Figura 3: Genealoga de una familia en la que se hereda una enfermedad autosmica dominante.
4 7 6 2

? 7 2 4 2

Introduccin Se muestra el resultado del estudio de segregacin de alelos para la familia analizada. El alelo 2 del polimorfismo es el ligado a la mutacin responsable de la enfermedad ya que es compartido por ambas afectadas.

Sin embargo, si la distancia que separa a ambos loci es tal que permite la recombinacin entre ellos, es posible que el hijo haya heredado de su madre el alelo 2 del polimorfismo y no la mutacin causante de la enfermedad debido a la recombinacin de ambos loci en la meiosis de las clulas germinales de la madre. La frecuencia con la que se presentar este segundo caso ser la frecuencia de recombinacin entre los loci implicados. As, si la distancia que los separa es de 5 cM, es decir su frecuencia de recombinacin es del 5%, el diagnstico que daremos en el caso presentado en la Figura 3 ser de un 95% de probabilidad de que el hijo resulte afectado y de un 5% de que el hijo haya heredado el alelo normal. Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnstico se utilizan varios loci polimrficos localizados dentro del gen implicado en el fenotipo alterado. Con ello se consiguen disminuir las ambigedades generadas por la recombinacin.

2) Diagnstico directo de enfermedades genticas: Algunas patologas suelen ser producidas por grandes deleciones que pueden abarcar desde un exn hasta uno o ms genes completos. De esta manera, la delecin abarcar no slo a las secuencias codificantes de un gen, sino que tambin involucrar a los intrones del mismo, donde mapea la gran mayora de los polimorfismos utilizados en gentica molecular diagnstica. Por lo tanto, el hallazgo de deleciones heterocigotas, imposible mediante PCR de exones (Giliberto et al., 2003), puede realizarse por medio del anlisis de polimorfismos. Esto es as ya que, si bien la delecin de polimorfismos

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intrnicos pertenecientes al gen relacionado con la enfermedad no constituye la causa de la patologa, al mapear stos dentro de dicha delecin resultan de utilidad para ponerla en evidencia. Este tipo de estudios directos son los utilizados para el diagnstico de pacientes con el sndrome de microdelecin de NF1 o de portadoras de distrofia muscular de Duchenne y para el rastreo de las deleciones que dan origen a los sndromes de PraderWilli y Angelman (PWS/AS), como se demostrar en los sucesivos Captulos de esta Tesis. Luego de la amplificacin por PCR de los polimorfismos correspondientes y de la asignacin de los alelos para cada miembro del ncleo familiar (madre, padre, hijo afectado), la delecin se pondr de manifiesto por la ausencia de un alelo (materno o paterno) en el genotipo del afectado (Figura 4).

Figura 4: Rastreo de deleciones mediante el anlisis de secuencias polimrficas.

4 6 2

Se muestra el resultado del estudio de segregacin de alelos para la familia analizada. Se observa una delecin en la afectada evidenciada por la falta del alelo materno.

Bajo el mismo concepto los polimorfismos se pueden utilizar tambin para poner en evidencia los mecanismos de inactivacin de supresores tumorales en los cnceres hereditarios, mediante la evidencia de prdida de heterocigosidad (LOH) en los tumores,

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como se ver en el Captulo II. As como tambin se podrn evidenciar disomas uniparentales (DUP), discriminando entre homo y hetero DUP, en los pacientes con PWS/AS, como se ver en el Captulo III de esta Tesis. Las secuencias polimrficas generalmente no se ven relacionadas con el desencadenamiento de fenotipos patolgicos. Sin embargo, existen algunas excepciones tales como las alteraciones producidas por la inestabilidad de microsatlites (Robertson, 2005). Entre ellas, la expansin de repeticiones de trinucletidos es la base molecular de numerosas enfermedades genticas hereditarias. Se trata de una mutacin dinmica del ADN en la cual una determinada secuencia repetitiva se expande dando origen a un fenotipo alterado. Los alelos expandidos asociados a enfermedades son inestables tanto en la lnea somtica como en la germinal, con una clara tendencia hacia las expansiones (Robertson, 2005). La tasa de expansiones est directamente relacionada con el tamao del alelo expandido y con la edad del individuo. Entre las patologas producidas por expansin de trinucletidos ms estudiadas se encuentra el Sndrome de X frgil (SXF) (Martin y Bell, 1943), la causa ms frecuente de retardo mental hereditario. El SXF se produce por una expansin del trinucletido (CGG)n que mapea en el exn 1 no codificante (se transcribe pero no se traduce) del gen FMR-1 (Xq27.3) (Verkerk, 1991). Como consecuencia de la expansin se produce una hipermetilacin en la isla CpG de la zona promotora del gen, lo que inhibe su transcripcin y, por lo tanto, produce la falta de la protena FMRP (Kremer et al., 1991). La expansin es progresiva y el proceso puede abarcar varias generaciones, observndose tres posibles estados cromosmicos: normal, premutacin y mutacin completa (Figura 5) (Sherman et al., 1985). El alelo normal suele presentar entre 5 y 50 repeticiones del triplete (CGG)n en el locus en cuestin. En el alelo premutado las repeticiones oscilan entre las 50 y 200,
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permitiendo al gen ser an funcional y sintetizar la protena. En este caso se habla de mujeres portadoras y de hombres transmisores normales. Por ltimo, en la mutacin completa los tripletes exceden las 200 repeticiones, pudiendo llegar a varios miles, lo que inactiva al gen FMR-1 (Sherman et al., 1985).

Figura 5: Mecanismo Molecular de inactivacin del gen FMR-1 en el SXF.

sitio hipometilado

gen FMR-1
CpG Normal Zona promotora regin inestable sitio hipometilado n =5 a 50 ARN m 4,8 Kb

(CGG)n

(CGG)n
Premutacin (estado intermedio) Zona promotora n = 50-200 ARN m 4,8 Kb sitio hipermetilado meiosis por va materna

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 mutacin completa Zona promotora

(CGG)n
n >200 RNA m = 0 = silenciamiento del gen

Nuestro grupo de trabajo realiz la puesta a punto e implementacin de un diagnstico directo de la mutacin dinmica causante de la patologa mediante las tcnicas de PCR y Southern blot. Durante el perodo en el que hemos desarrollado la tarea diagnstica se analizaron 240 individuos no relacionados, hallndose premutaciones, y

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mutaciones completas en 14 de los individuos analizados (6%). Tambin se estudiaron 17 casos familiares encontrndose alteraciones en 8 de las familias analizadas (47%). La diferencia en los porcentajes de deteccin puede deberse al criterio de diagnstico de los diferentes especialistas y a que debido a la gran variabilidad fenotpica de la patologa se recomienda la prueba diagnstica a toda persona con retraso mental de origen desconocido. Los protocolos utilizados en el diagnstico y los resultados obtenidos fueron presentados y discutidos en la Tesis doctoral de la Dra Florencia Giliberto, directora adjunta del presente trabajo de Tesis. En ella se realiza una comparacin entre los mtodos utilizados, demostrndose como la tcnica de Southern blot resulta ms informativa que la de PCR en el diagnstico de SXF, y se discute la gran importancia del diagnstico precoz en los individuos nacidos con el sndrome, con el objeto de ofrecer un correcto asesoramiento gentico a las familias.

No todo polimorfismo en regiones codificantes trae aparejado un fenotipo alterado. Existen polimorfismos exnicos, generalmente SNPs, que no producen alteracin alguna del producto del gen en el que mapean. Un ejemplo de ello lo constituye el polimorfismo de restriccin APA I del gen IGF2. Este tipo de polimorfismos resultan tiles para la determinacin de prdida de imprinting (LOI) de genes imprinteados. El imprinting genmico (o impronta gentica) implica una expresin monoallica parental especfica. Se conocen numerosos genes que sufren el fenmeno de imprinting genmico, entre los cuales figuran algunos que codifican para factores de crecimiento como el gen IGF2, inactivo en el cromosoma heredado de la madre en la mayora de los tejidos normales. La LOI de estos genes produce una sobreexpresin de los factores de crecimiento con la consecuente aparicin de tumores.
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El gen IGF2 (11p15) codifica para una protena mitognica para muchos tipos celulares (Morton et al., 1986; Brissenden et al., 1984). La expresin monoallica de IGF2 se conserva en casi todos los tejidos adultos normales, mientras que la expresin biallica de IGF2, producida por LOI o duplicacin del alelo activo, fue descripta en numerosas patologas, entre ellas el Sndrome de Beckwith-Widemann (BWS) (Constancia et al., 2000) y el Tumor de Wilms (Rainieri et al., 1993). En un estudio piloto para investigar la utilidad de la LOI como un marcador de riesgo de cncer colorectal, se evaluaron pacientes en una clnica colonoscpica y se concluy que la LOI podra ser un marcador predictivo valioso para individuos en riesgo de cncer colorectal (Cui et al., 2003). El cncer de mama es genticamente heterogneo y durante el progreso de la enfermedad una variedad de alteraciones genticas tienden a acumularse. Para evaluar si existe LOI en el locus IGF2 se han realizado numerosos trabajos a lo largo de los aos pero los resultados obtenidos por los distintos grupos son muy controversiales (McCann et al., 1996; Yballe et al., 1996; Wu et al., 1997). Es por ello que nuestro grupo desarroll una estrategia para detectar la LOI de IGF2 en pacientes con cncer de mama, mediante el estudio del RFLP APA I perteneciente a la zona codificante del gen IGF2 (Figura 6).

Figura 6: Estrategia de rastreo de LOI en el gen IGF2 en pacientes con cncer de mama.

Tejido Normal ARN ADN NC C

Tejido Tumoral ARN ADN NC C LOI !

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Introduccin Se observa claramente la expresin monoallica del gen IGF2 en el tejido normal extrado de la zona adyacente al tumor, debido a la falta del alelo corta (C) luego de la RT -PCR / RFLP. Luego se observa una expresin biallica del gen en el tejido tumoral. Estos resultados demuestran la ocurrencia de LOI en el tumor. (C): corta. (NC): no corta. LOI: prdida de imprinting.

Si bien se ha observado LOI en unos pocos tumores analizados utilizando la estrategia descripta en la Figura 6, an debemos estudiar un nmero mayor de pacientes para obtener resultados concluyentes.

El consejo gentico

Es importante que las familias que padecen cualquier enfermedad hereditaria, reciban consejo gentico. Segn la publicacin de la Sociedad Americana de Gentica (Fraser, 1974) el consejo gentico es: Un proceso de comunicacin para tratar los problemas humanos asociados al padecimiento y al riesgo de padecer una enfermedad hereditaria en la familia. Un profesional o grupo de profesionales deben ayudar al individuo y a la familia a: 1. Comprender los actos mdicos, incluyendo el diagnstico, el pronstico de la enfermedad y los tratamientos disponibles. 2. Entender cmo la herencia determina la enfermedad y el riesgo de recurrencia de cada familiar. 3. Comprender las opciones disponibles para afrontar el riesgo de recurrencia (el riesgo de transmitir la enfermedad). 4. Elegir la actuacin que parece ms apropiada para ellos teniendo en cuenta el riesgo y los intereses de la familia, y actuar de acuerdo a la decisin.

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5. Conseguir la mejor aceptacin posible de la enfermedad y/o del riesgo de recurrencia por parte de la familia afectada. El consejo gentico es un proceso de comunicacin entre los especialistas, los pacientes y sus familiares, que abarca mltiples facetas, no es slo el estudio molecular y el informe del estudio molecular. El consejo gentico debe informar de los aspectos clnicos y genticos de la enfermedad, orientar a las personas para que decidan aquello que ms les conviene y ofrecerles ayuda psicolgica para aceptar su enfermedad, si la necesitan. Para impartir un consejo gentico se debe contar con un rbol genealgico de la familia, con la informacin relativa a la enfermedad y con un diagnstico cierto de la misma en algn integrante de la familia. Luego se ha de establecer el riesgo relativo de cada individuo de padecerla o transmitirla y, una vez conocidos todos estos datos, se podr informar al paciente y a su familia sobre la enfermedad en s, su pronstico, su posible tratamiento y el riesgo de recurrencia de la misma en las sucesivas generaciones. Es por ello que el consejo gentico constituye la ltima etapa del diagnstico molecular y debe ser realizado por profesionales entrenados para tal fin, (constituyendo el grupo ptimo: un especialista en la patologa en cuestin, un mdico genetista, el mdico de cabecera de la familia y un psiclogo), con el objeto de brindar una adecuada informacin a las familias que lo soliciten.

En resumen, los polimorfismos de ADN juegan un papel fundamental en el diagnstico de patologas genticas, lo que constituye uno de los eslabones imprescindibles para el establecimiento de un buen consejo gentico en las familias que las padecen, como se demostrar a continuacin...

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Objetivos Generales

Existen aproximadamente 100.000 repeticiones del dinucletido (CA)n dispersas ms o menos uniformemente en el genoma humano. Estos loci, adems de hipervariables, se heredan en forma mendeliana, de manera que, en cada autosoma, los hijos heredan una copia de su padre habitualmente distinta a la que heredan de su madre para cada STR en particular. Estas caractersticas son las responsables de la eleccin de estas secuencias para la puesta a punto de las estrategias diagnsticas que se plantean en esta Tesis. El objetivo central del trabajo es aportar y reunir informacin que enriquezca el conocimiento bsico de la aplicacin de los polimorfismos en gentica molecular diagnstica, utilizando como modelos a la Distrofia Muscular de Duchenne / Becker (DMD/DMB), la Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) y los sndromes de Prader-Willi y Angelman (PWS/AS), con el objeto de establecer un centro de diagnstico molecular en el que todos los individuos puedan acceder a un diagnstico de alta complejidad y reciban el asesoramiento gentico adecuado.

En particular, se utiliz un sistema de diagnstico basado en la segregacin de alelos polimrficos, con el objeto de: - En una primera parte, resolver casos diagnsticos habituales y complejos de DMD/DMB.

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- En una segunda parte, implementar un diagnstico molecular indirecto y establecer la estrategia para rastrear las microdeleciones de NF1. - En una tercera parte, analizar la utilidad de los microsatlites en la deteccin de deleciones y disomas uniparentales en los pacientes con PWS y AS.

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