La translocacin de GLUT4 estimulado por insulina est mediada por una va de sealizacin intracelular divergente *

La insulina estimula el transporte de glucosa en gran medida por la mediacin de la translocacin del transportador de glucosa sensible a la insulina (GLUT4) de un compartimento intracelular a la membrana plasmtica. Usando una nica sola microinyeccin adipocitos 3T3-L1, junto con la deteccin de inmunofluorescencia de las protenas de GLUT4, hemos determinado que la inhibicin de p21ras endgenos o inyeccin de p21ras oncognicos no tiene ningn efecto sobre la translocacin de GLUT4 estimulado por la insulina. Por otro lado, la microinyeccin de anticuerpos anti-fosfotirosina o la inhibicin de la endgena fosfatidilinositol 3-quinasa mediante microinyeccin de una protena de fusin SH2 GST-p85 inhibe notablemente este efecto biolgico de la insulina. Estos datos sugieren que la va de la protena quinasa p21ras/mitogen-activated no est implicado en este efecto metablico de la insulina, mientras que la fosforilacin de la tirosina y la estimulacin de la actividad de fosfatidilinositol 3-quinasa son componentes crticos de esta va de sealizacin. La insulina ejerce efectos biolgicos pleiotrpicos. Uno de los principales efectos fisiolgicos de la insulina es la regulacin de los niveles de glucosa en plasma, que se logra mediante la supresin de la produccin de glucosa heptica y la estimulacin de la captacin de glucosa en los tejidos diana. Este ltimo efecto es debido principalmente a la translocacin de transportadores de glucosa sensibles a la insulina (GLUT4) de un pool vesicular intracelular a la membrana plasmtica, donde se pueden llevar a la absorcin de glucosa. Esta respuesta est mediada por una va de sealizacin metablica que es divergente de la va mitognica y puede, al menos en parte, utilizar diferentes molculas de sealizacin. El esclarecimiento de esta va de sealizacin dar informacin rica con implicaciones para muchos de estados de enfermedad humanos, tales como la diabetes mellitus no dependiente de la insulina, la obesidad y el sndrome de ovario poliqustico. Todas estas condiciones estn asociadas con la resistencia a la insulina y ladisminucin de transporte de glucosa estimulado por la insulina como una manifestacin importante. Por lo tanto, las causas de la resistencia a la insulina en estos estados fisiopatolgicos probablemente implican defectos en la va de sealizacin metablica por el cual la insulina provoca un aumento en la captacin de glucosa celular. Hemos utilizado microinyeccin celular de los adipocitos 3T3-L1 y microscopa de inmunofluorescencia de las protenas GLUT4 para evaluar la va de sealizacin transmembrana que conduce a la traslocacin de GLUT4 estimulada por insulina. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Materiales Insulina porcina fue proporcionado amablemente por Lilly. Anticuerpo anti-GLUT4 policlonales (F349) fue descrito previamente (6). Anticuerpo anti-GLUT4 monoclonal (1F8) era de Acres Biologicals Este (10). Anticuerpo anti-c-Fos policlonal era de Oncogene Science. Anticuerpo anti-p21ras monoclonal (Y13-259) era de Santa Cruz Biotechnology. Anticuerpo policlonal anti-Shc y el anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY20) eran de Transduction Laboratories. Protenas recombinantes T24 RAS1 y N17 Ras fueron generosos regalos de JR Feramisco y fueron descritas anteriormente (8). Protena de fusin GST-p85 SH2 fue proporcionado amablemente por AR Saltiel, y su preparacin y uso se han descrito previamente (9). IgG de oveja y el isotiocianato de fluorescena, isotiocianato de tetrametilrodamina-, y ek AMCA conjugado anti-conejo,-ratn, -rata y anticuerpos IgG de ovejas fueron de Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. Todos los dems reactivos fueron adquiridos de Sigma.

Cultivo de clulas y Microinyeccin Fibroblastos Rat1 que haban sido transfectadas de manera estable y que sobreexpresan receptor de insulina humano de tipo salvaje (clulas HIRcB ) se cultivaron como se ha descrito previamente. Clulas 3T3-L1 se cultivaron y mantuvieron en medio alto en glucosa que contiene 50 unidades / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, y 10 % de suero fetal de ternera (FCS) en un ambiente de 10 % de CO2. Las clulas se dejaron crecer hasta 2 das y luego se diferenciaron mediante la adicin del mismo medio que contiene isobutilmetilxantina (500 mM ), dexametasona (25 mM) e insulina ( 4 mg / ml) durante 3 das, y el medio que contiene insulina por 3 das ms. El medio se cambi cada 3 das hasta que las clulas fueron completamente diferenciadas, tpicamente por 10 das . Antes de la experimentacin, los adipocitos se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio lavados con cido. Las clulas se cultivaron en el mismo medio sin suero durante 2 h, y la microinyeccin de diversos reactivos se llev a cabo usando un sistema de microinyeccin de Eppendorf semiautomatizado. Todos los reactivos se disolvieron en un buffer que contiene 5mM de fosfato sdico (pH 7,2), 100 mM de KCl . N17 Ras, T24 Ras y protenas GST-p85 SH2 - p85 fueron cada una co- inyectadas con 10 mg / ml de IgG de oveja para propsitos de deteccin. Antes de la teir las clulas se les permiti recuperarse durante un periodo de 1 h. Immunostaining and Fluorescence Microscopy Tincin de la protena GLUT4 Las clulas se estimularon con insulina durante 20 min y despus se fijaron en formaldehdo al 3,7% en PBS durante 5 min en hielo y durante 5 min a temperatura ambiente. Despus del lavado, las clulas fueron permeabilizadas y bloqueadas con 0,1 % de Triton X - 100 y 1 % de FCS en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Las clulas fueron luego incubadas con anticuerpo policlonal de conejo anti- GLUT4 ( F349 ) ( 1 mg / ml ) que haba sido generado contra un pptido sinttico correspondiente a los 16 residuos C-terminales de GLUT4 o un anticuerpo anti - GLUT4 monoclonal ( 1F8 ) ( 7 ) ( 2 mg / ml ) en PBS con 1 % de FCS durante la noche a 4 C. Despus del lavado y la tincin de GLUT4, la identidad de las clulas microinyectadas se determin por incubacin con fluorescena conjugada de burro anti-IgG de conejo para F349 o anti- IgG de ratn para 1F8 - y AMCA conjugadoa de burro IgG anti-oveja. Despus los resultados fueron analizados y fotografiados por microscopa de inmunofluorescencia. Cada clula AMCA - positiva microinyectada fue evaluada por la presencia de GLUT4 asociada a la membrana de plasma teida. Como en todos los estudios de microinyeccin, las clulas de control se microinyectaron con IgG de oveja preinmune y luego se procesaron de la misma manera que las clulas inyectadas experimentales. Tincin de la protena c-Fos Despus de la tincin de GLUT4 y la inyeccin de IgG, las clulas se tieron con anticuerpo de conejo anti-c-Fos ( 1/100 ) durante 90 min a 37 C ,seguido por incubacin con rodamina conjugada anticuerpo anti-conejo IgG. RESULTADOS Y DISCUSIN Adipocitos 3T3-L1 individuales, vivos y diferenciados se microinyectaron con diversos reactivos , seguido por la estimulacin con insulina. A continuacin, la translocacin de GLUT4 a la superficie celular se visualiz por microscopa de inmunofluorescencia usando anticuerpo anti - GLUT4 seguido por un segundo anticuerpo conjugado con fluorescena. La figura.1 , A y B , muestra un campo que contiene adipocitos 3T3-L1 antes (A ) y despus (B ) de la estimulacin con insulina . En la basal, o sea en estado no estimulado, la tincin de GLUT4 es relegado casi exclusivamente al compartimiento intracelular, con tpico puntiforme difusa y tincin perinuclear discreta. Despus de la estimulacin de insulina, se produce una marcada diferencia en el patrn de tincin, con prominente tincin intensa distribuida de manera uniforme en la superficie celular, acompaado por una disminucin de la tincin intracelular de GLUT4 , indicativa de la translocacin de protenas GLUT4 del pool vesicular intracelular a la membrana plasmtica. En el estado basal, menos de 10 % de clulas presentan tincin de GLUT4 en la superficie, mientras que despus de un tratamiento con insulina entre el 60 y el 80 % la localizacin de GLUT4 en

las clulas son positivas para la superficie. Usando esta tcnica, la translocacin se produce con un curso de tiempo ( C ) y la curva de dosis-respuesta ( D ) tpico para la estimulacin de insulina del transporte de glucosa , lo que indica que este ensayo visual de la translocacin de GLUT4 es representativo del proceso estimulada por la insulina fisiolgica . A continuacin, se utiliza este sistema junto con estudios de microinyeccin en un intento de elucidar la cascada de sealizacin que media el efecto de la insulina sobre la translocacin de GLUT4 . Despus de que la insulina se une a su receptor, se inicia una serie de eventos, incluyendo la autofosforilacin del receptor y la fosforilacin de tirosina de sustratos endgenos tales como el IRS- 1 y Shc. A travs de sus mltiples sitios de fosforilacin de tirosina, el IRS- 1 puede servir como una protena de acoplamiento formando complejos con protenas que contienen el dominio SH2 tales como la IP3 quinasa. Phospho- Shc forma complejos con Grb2zSOS y conducen a la activacin de p21ras, que posteriormente estimula la va de la MAP quinasa. Mientras que una gran cantidad se conoce acerca de las acciones mitognicas de la insulina, se sabe relativamente poco acerca de los procesos de sealizacin que median la translocacin de GLUT4. Por ejemplo, numerosos estudios han demostrado que la formacin de p21ras - GTP y la estimulacin de la va de la MAP quinasa son pasos esenciales en la va de sealizacin mitognica de la insulina. Sin embargo, si estas molculas estn involucradas en acciones metablicas de la insulina sigue siendo poco claro. Por ejemplo, se ha demostrado que el metabolismo y las vas de sealizacin mitognicas divergen, y es posible que el punto de divergencia es proximal a la formacin de p21ras - GTP . Varios estudios, utilizando diferentes enfoques experimentales , se han encontrado resultados con un papel para p21ras en la estimulacin del transporte de glucosa, mientras que otros estudios han encontrado evidencia a favor . Nuestra tcnica actual permite la oportunidad de probar directamente la importancia de las molculas intracelulares en una va de sealizacin dado. Por lo tanto, adipocitos 3T3-L1 microinyectados con una serie de reactivos relacionados con Ras. Como se ve en la figura.2, la microinyeccin de inhibidor dominante de Ras N17 no tuvo efecto sobre la localizacin basal de GLUT4 o estimulado por la insulina en concentraciones mximas de insulina (10ng/ml). Microinyecciones idnticas de protena Ras N17 se llevaron a cabo en clulas que fueron posteriormente estimuladas con varias concentraciones submximas de insulina. Cuando la translocacin de GLUT4 se cuantific en estas clulas inyectadas, se observ una curva de dosis-respuesta idntica a la obtenida con las clulas no inyectadas (Fig. 1D), lo que indica que la protena RasN17 no cambia esta respuesta a la dosis . Por lo tanto, dentro de los lmites de deteccin del ensayo de inmunofluorescencia, no parece que la inhibicin de la actividad de Ras endgeno afecta a la medida en que se transloca GLUT4 o translocacin en respuesta a la insulina. Se observ una similar falta de efecto sobre la microinyeccin de anticuerpo anti-p21ras. En contraste, tanto de estos reactivos inhibidores Ras impide la sntesis de ADN estimulada por la insulina cuando se inyectaron simultneamente en Rata 1 fibroblastos (clulas HIRC ) que sobreexpresan los receptores de insulina humanos. Los porcentajes de clulas positivas para la tincin de BrdU fueron 76, 22 , 21 , y 28 % despus de las inyecciones de control de IgG, N17 Ras , anticuerpo anti - p21ras , y el anticuerpo anti - Shc , respectivamente . Oncognicas de Ras T24 es una protena constitutivamente activa que estimular efectos aguas abajo de p21ras -GTP . Protena Ras T24 se microinyect en adipocitos 3T3-L1 , y sus efectos sobre c-Fos expresin de la protena y la translocacin de GLUT4 se evaluaron simultneamente . Como se demuestra en la figura . 3 , la protena Ras T24 era biolgicamente activo dentro de las clulas y caus una marcada induccin de la protena c-Fos como se visualiza mediante tincin con rodamina nuclear con anticuerpo anti - c-Fos . En contraste , T24 de Ras no pudieron influir en la localizacin de GLUT4 en la presencia o ausencia de insulina ( Figs. 2 y 3 , D y H ) . Adems , las inyecciones simultneas de esta preparacin de T24 de Ras estimularon la sntesis de ADN en las clulas quiescentes HIRC en la misma medida como la insulina . Los porcentajes de clulas BrdU - positivas siguientes IgG de control y las inyecciones de T24 de Ras , sin estimulacin por la insulina , eran 19 y 72 % , respectivamente . Por lo tanto , la va de sealizacin que conduce a la expresin de c - Fos fue activado por las Ras T24 microinyectados , mientras que la estimulacin de esta va no influy en la translocacin de GLUT4 . Adems , hemos encontrado que la microinyeccin de anticuerpo anti - Shc ( fig. 2 ) , as como una

protena de fusin GST - SH2 Shc ( datos no mostrados ) no inhibi la insulina estimula la translocacin de GLUT4 en adipocitos 3T3-L1 , mientras que anti- Shc anticuerpo inhibe la sntesis de ADN estimulada por la insulina en ms de un 80 % en las clulas HIRC , y la protena SH2 - GST Shc inhibi el crecimiento de la sntesis de ADN estimulada por factor de epidrmica . Tomados en conjunto , estos resultados sostienen que la activacin de p21ras es ni necesaria ni suficiente para la translocacin de GLUT4 e indican que la va metablica de la mediacin de este efecto biolgico diverge de la va de sealizacin mitognica proximalto p21ras activados . Hay pruebas que sugieren que la PI3 - quinasa puede ser una molcula intermediaria facilitar la translocacin de GLUT4 estimulada por la insulina ( 29-32 ) . Cuando las clulas son tratadas con el inhibidor de la PI3 - quinasa wortmanina , la estimulacin de insulina del transporte de glucosa se inhibe ( 31 , 32 ) . Aunque este es sugerente de un papel para la PI3 - quinasa en este efecto de la insulina , la especificidad de wortmanina como un inhibidor ha sido cuestionada recientemente ( 33 ) . Para evaluar directamente la relevancia de la PI3 - quinasa en los efectos metablicos de la insulina , se utiliz una protena de fusin GST que comprende el dominio SH2 Nterminal de la subunidad p85 de la PI3 - quinasa . En estudios anteriores , hemos demostrado que la microinyeccin de esta protena de fusin SH2 - GST en clulas HIRC insulina inhibi completamente , similar a la insulina factor de crecimiento I , y de crecimiento epidrmico sntesis de ADN inducida por el factor ( 9 ) . Como se ve en la figura . 4 , la microinyeccin de la protena SH2 - GST p85 inhibe la insulina estimula la translocacin de GLUT4 por 75 % . La especificidad de este efecto es verificada por el hecho de que una protena de fusin GST que contiene el dominio SH2 Shc fue sin efecto sobre la translocacin de GLUT4 ( datos no mostrados ) . En apoyo de esto, tambin encontramos que la preincubacin de las clulas con Wortmannin ( 1 mM) translocacin GLUT4 inhibi completamente (datos no presentados). La insulina conduce a la autofosforilacin del receptor de insulina con la fosforilacin de tirosina del IRS 1 , que luego se une a los dominios SH2 de la PI3 - quinasa conducen a la activacin de esta enzima ( 17 ) . Para evaluar el papel de la fosforilacin de tirosina en esta va , tambin microinjected anticuerpos anti - fosfotirosina en clulas 3T3-L1 . El anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina marcadamente inhibida la translocacin de GLUT4 que indica la necesidad de fosforilacin de la tirosina as como la actividad de PI3 - quinasa en la translocacin de GLUT4 ( fig. 4 ) . Estudios previos que examinaron si las molculas en la va p21ras / MAP quinasa estn implicadas en la estimulacin de insulina del transporte de glucosa han arrojado resultados contradictorios ( 19-25 ) . Algunos de estos estudios no han medido especficamente la translocacin de GLUT4 o han utilizado lneas celulares que no expresan GLUT4 . Otros han utilizado transfeccin para generar lneas celulares que sobreexpresan molculas relacionadas con Ras . Con este ltimo enfoque , siempre existe la posibilidad de que las lneas celulares seleccionadas se han adaptado a la transgn expresado de una manera tal como para que los resultados no representativa del contexto celular fisiolgica . Microinyeccin de clulas individuales evita muchos de estos problemas , ya que nuestros estudios se pueden realizar en las clulas diana de insulina pertinentes (adipocitos) , con la evaluacin directa de la evento biolgico en cuestin ( translocacin de GLUT4 ) . Adems , la introduccin aguda de molculas de ensayo en el interior de la clula seguido de un ensayo rpido de accin de la insulina no permite las clulas tiempo suficiente para someterse a cambios de adaptacin a la perturbacin . Individual microinyeccin clula viva ha sido una poderosa tcnica que ha demostrado ser til en la identificacin de los componentes de la va de sealizacin para la mitognesis de crecimiento mediada por el factor ( 8 , 9 , 11 , 34-37 ) . El sistema actual proporciona los medios para identificar los componentes moleculares intracelulares que transducen importante efecto metablico de la insulina , es decir, la estimulacin de la translocacin de GLUT4 . En el informe actual de los datos han demostrado que la va Ras , que es un componente crtico de la sealizacin mitognica , es necesario para la estimulacin de la insulina de la translocacin de GLUT4 . Como tal , esto proporciona una clara evidencia de la divergencia de los eventos de sealizacin metablicas y mitgenos . Tambin encontramos que la PI3 - quinasa es una molcula necesario acoplar la seal de fosforilacin de la tirosina generada por el receptor de la insulina a la glucosa estimulacin del transporte . Aunque nuestros estudios no dilucidar el mecanismo por el cual la PI3 - quinasa facilita la translocacin de GLUT4 , nuestros resultados son consistentes con estudios recientes ( 38 ) muestra que

despus de la estimulacin de insulina , la PI3 - quinasa puede estar localizada en las vesculas que contienen GLUT4 - intracelulares , consistentes con un papel para esta enzima en el trfico de GLUT4 a la superficie celular . Utilizando los mtodos que figuran en el presente informe , anticipamos que ms molculas de esta va de sealizacin clave sern identificados en el momento oportuno . Como los detalles de esta va de sealizacin se desarrollan, nuevos conocimientos sobre los mecanismos de insulinresistant estimulacin del transporte de glucosa en estados de enfermedad humanos es probable que surjan