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Bioqumica - Cromatografa

1
1
Bioqumica
Separacin de biomolculas

Mtodos cromatogrficos

Los mtodos cromatogrficos son aquellos en que los diferentes componentes de una mezcla
de biomolculas se separan al interaccionar diferencialmente con una matriz porosa inmvil
dentro de una columna. El medio mvil (solvente) puede ser lquido o gaseoso, dependiendo
de la tcnica, y puede ser de composicin constante o variable.
La nomenclatura bsica no ha cambiado desde los primeros intentos hechos ya hace casi un
siglo por Tswett: se denomina columna cromatogrfica al tubo en que se realiza la corrida,
eluente al lquido o gas usado como medio mvil y cromatograma al resultado del anlisis
cromatogrfico.
La cromatografa se emplea con fines analticos, en microescala, o preparativos, ya sea en
procesos industriales o de laboratorio, para purificar diversas sustancias: protenas, cidos
nucleicos, medicamentos, etc.
Las columnas son tubos de vidrio, metal o plstico, dependiendo de la tcnica empleada, de
dimetro constante y preferentemente de un material biocompatible, es decir que no cambie la
funcin biolgica del material en estudio ni interaccione con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la separacin se dan sobre la matriz o soporte y pueden ser
de diversa naturaleza. As se tiene la cromatografa de intercambio inico, de interaccin
hidrofbica, de filtracin o exclusin molecular, de afinidad, etc.
Dependiendo de las
necesidades de
resolucin, diferentes
tcnicas pueden ser
empleadas para la
cromatografa, tales
como HPLC (High
performance liquid
chromatography, FPLC
(fast protein liquid
chromatography), en
que varan la presin a
la que se administra la
fase mvil, la
constitucin de las
columnas, las
caractersticas de los
solventes y en general
la precisin con que se
miden los diferentes
parmetros de una
cromatografa.

Diferentes tipos de matrices
Se utilizan matrices, o soportes, muy variados. Sobre la matriz se van a dar las interacciones
que resultan en la separacin. Estas matrices entonces llevan los grupos qumicos encargados
de tal interaccin o bien su estructura ya posee alguna propiedad intrnseca que permite
separar biomolculas.
El trmino resina se reserva para las que poseen cierto grado de hidrofobicidad, como
poliestireno.
Figura 1
Bomba
Columna
Detector
Acme Corp.
Colector de fr acciones
Solvente
2
1 3
0
Figura 1. Configuracin
bsica para una
cromatografa
Bioqumica - Cromatografa

2
2
Figura 2. Partculas de Sepharosa

Un soporte muy comn es la celulosa, fcilmente hidratable pero que no permite elevados
flujos debido a su compresibilidad. Est compuesto de fibras de celulosa purificadas. Adems
de su compresibilidad, este soporte no es compatible con algunos solventes orgnicos ni
lcalis, que hidrolizan la celulosa.
De gran uso son las matrices derivadas de dextranos, de polisacridos diversos que pueden
ser mezclados con otros sustancias para dar diferentes caractersticas a la matriz. Se
presentas como microesferas porosas con diferentes tamaos de partcula y poro.
Ejemplos de stas son la Sepharose y el
Sephadex. La primera est compuesta por
agarosa, un polmero lineal de residuos alternados
de D-Gal y 3,6 anhidro-L-gal. La agarosa es un
componente del agar, junto a la agaropectina. La
agarosa forma geles debido a la multiplicidad de
puentes H y es un excelente medio debido a su
biocompatibilidad. La tcnica de fabricacin permite
que se formen partculas esfricas, cuentas de
collar, de tamao ms o menos uniforme y alta
porosidad. El Sephadex, por su parte, es un
dextrano entrecruzado. Todos los dextranos son
susceptibles a valores extremos de pH, en especial
en el lado alcalino de la escala. Esto se debe a la labilidad de los enlaces glucosdicos a la
hidrlisis alcalina.
El Sephacryl se prepara por entrecruzamiento covalente de alildextrano con
N,N'metilenbisacrilamida, dando un gel rgido con resistencia a la compresin. El BioGel es un
polmero de acrilamida que es especialmente resistente a valores extremos de pH.
Cuando se requieren velocidades de flujo y presiones elevadas se utilizan matrices ms
rgidas, constituidas por polmeros
sintticos o slica.
Especialmente en soportes para
intercambio inico se usa poliestireno
entrecruzado con divinilbenceno, que
forma una estructura tridimensional
grande de forma esfrica.
Separacin en base al tamao.
Cromatografa de exclusin molecular
(CEM)

Las biomolculas de diferente naturaleza
y tamao pueden separarse en base a su
tamao en columnas de filtracin
molecular o filtracin en gel. Esta tcnica
se basa en las propiedades separativas
de partculas esfricas, porosas, de
dimetro pequeo y ms o menos
constante. Las biomolculas que pasan a
travs de estos geles tienen a su
disposicin caminos de diferente longitud
de acuerdo con su tamao. As, las
molculas pequeas capaces de penetrar
los poros de la matriz se vern retardadas
en comparacin con aquellas de mayor
tamao, que son excluidas del interior de
Figura 2
Fase mvil
Molculas medianas:
difusin en una fraccin limitada
del soporte
Molculas grandes:
exclusin de fase estacionaria
D
i
r
e
c
c
i

n

d
e

f
l
u
j
o
Molculas pequeas: difusin
libre en la fase estacionaria
Figura 3. Cromatografa
de exclusin molecular
Bioqumica - Cromatografa

3
3
K
av
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
M
a
s
a

m
o
l
e
c
u
l
a
r

(
k
D
a
)
900
700
600
500
400
300
200
100
0
0.5
1
Abs 280
Vo Ve1 Ve2
la partcula y por lo tanto vern su trnsito a travs de la columna acelerado. El tamao mnimo
que debe poseer una molcula para incluirse, entrar a los poros, se denomina lmite de
exclusin. P.ej. un lmite de exclusin de 10
6
significa que molculas con tamao mayor a 10
6

kDa no sern incluidas. Esta tcnica separa no solamente molculas muy grandes de
molculas muy pequeas, como en el ejemplo anterior, sino que adems permite la separacin
de molculas con tamaos parecidos. Esta ltima caracterstica hace que uno pueda calibrar
una columna con patrones de tamao (peso molecular) conocido, los cuales eluirn siempre en
la misma forma, y luego utilizar esta informacin para construir una curva de calibracin. La
cromatografa se realiza sembrando la muestra y eluyendo con un buffer de composicin
constante.
No se utiliza el volumen de elucin
directamente sino el coeficiente de
particin, que es la relacin:

Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)


Donde:
Vo es el volumen vaco o de
exclusin, el espacio que queda
por fuera de las partculas del gel,
el nico disponible para las
macromolculas que no se
incluyen en el gel.
Ve es el volumen de elucin de la macromolcula, medido en la altura mxima del pico
(ver Fig. 4)
Vt es el volumen total de la columna

Kav tendr un valor entre 0 y 1 e, idealmente,
dar una lnea recta con pendiente negativa.
Las columnas usadas en cromatografa de
exclusin molecular tienden a ser largas y
angostas, de modo de maximizar el nmero
de platos tericos, una medida de su
capacidad de resolucin. Una limitacin de
esta tcnica es que el volumen sembrado
debe ser lo ms pequeo posible para evitar
la obtencin de picos anchos, con lo que se
pierde resolucin. Para separaciones de
biomolculas o determinacin de peso
molecular se emplea un volumen de muestra
no mayor del 10% del volumen de la columna.
La tcnica puede utilizarse para desalar
macromolculas, en cuyo caso puede
sembrarse hasta un 20% del volumen.

Separacin en base a la carga

Cromatografa de intercambio inico (CIO)

En este tipo de cromatografa, la matriz contiene un grupo cargado que puede interaccionar
con la macromolcula en estudio de forma de unirse a ella por interacciones electrostticas.
Figura 5
Figura 4
Bioqumica - Cromatografa

4
4
Los grupos inicos se hallan unidos en forma covalente a la matriz. Por ejemplo, una protena
con punto isoelctrico menor a 7 o un cido nucleico estarn cargados negativamente a pH 7.0.
De esa manera, si se tiene una matriz con sustituyentes cargados positivamente, por ejemplo
una amina cuaternaria, las macromolculas se unirn a los sustituyentes con una fuerza
proporcional a la carga que detenten al pH al que se realiza la corrida y al nmero y naturaleza
de los sustituyentes presentes en la matriz. Dado que las protenas son iones multivalentes, las
resinas pueden ser de intercambio aninico o catinico, de acuerdo a la carga neta que
posean. Dependiendo de la macromolcula en estudio se usar una u otra. Los ms comunes
son:

dietil aminoetil (DEAE) O-CH
2
-CH
2
-N
+
(C
2
H
5
)
2
H (dbil) pK>11
trimetil aminoetil (TMAE) O-CH
2
-CH
2
-N
+
(CH
3
)
3
(fuerte) pK>13
dimetilaminoetil (DMAE) O-CH
2
-CH
2
-N
+
(CH
3
)
2
(dbil) pK~10
sulfometil -O-CH
2
SO
3
-

pK<1 (fuerte)
sulfopropil -O-CH
2
- CH
2
- CH
2
-SO
3
-

pK<1 (fuerte)
carboximetil -O-CH
2
COO
-
pK~4.5

Una caracterstica importante de los medios de intercambio inico es su capacidad, es decir la
cantidad de macromolculas que pueden unir por unidad de volumen de fase estacionaria, La
capacidad se expresa en mg protena/ml gel o meq/ml. La capacidad es mayor cuanto ms
sustituida est la matriz, ms fuerte sea la interaccin con la macromolcula y mayor sea el
tamao de poro de la matriz.
La elucin puede realizarse de dos formas diferentes. La ms usual consiste en aumentar
progresivamente la concentracin de un contrain, de modo de desplazar el equilibrio de unin
de la macromolcula hacia la forma libre. El contrain es normalmente una sal (NaCl, KCl, etc.)
disuelta en el eluente.
0-DEAE(+) +Prot(-) 0-DEAE-Prot
0-DEAE-Prot +Cl(-) 0-DEAE-Cl +Prot(-)

Las macromolculas de una mezcla
se irn desplazando en forma
secuencial de acuerdo con la fuerza
de la unin: las que posean menor
densidad de carga eluirn antes,
mientras que para las de mayor carga
neta el tiempo de retencin ser
mayor. En la Figura 6 se esquematiza
el proceso para el caso, muy ideal por
cierto, de que slo una de las
macromolculas presente en la
muestra se una a la matriz. Esto
generalmente no es as, sobre todo al
trabajar con mezclas complejas.
La otra manera es realizar un cambio
en el pH del solvente. Esta tcnica se
emplea con intercambiadores dbiles.
La lgica es que al cambiar el pH, de
modo de acercarnos al pI de cada
protena, la carga neta de esta ir
disminuyendo y en algn punto dejar
de interaccionar con la matriz. Sin
Car gado de la columna
Lavado Elucin
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
Fuer za
inica
Interaccin
con la matr iz car gada
Cr omatogr afa de inter cambio inico
Figura 6
Bioqumica - Cromatografa

5
5
Figura 7. Cromatograma obtenido en una CIO de una mezcla de protenas. Luego de la siembra se observa
un pico de Absorbancia (la tcnica de deteccin puede ser otra) que corresponde a la fraccin de protenas
que no se unen a la matriz. Luego de lavar con el mismo buffer de siembra hasta eliminar aquello que no se
une a la matriz, se comienza a elevar la fuerza inica en el buffer y se observa la aparicin de picos que
corresponden a macromolculas unidas. El primero es un pico doble que contiene al menos dos protenas que
eluyen a fuerzas inicas parecidas.
embargo, esta tcnica posee sus desventajas. Dado que en este caso las protenas eluirn a
un pH igual a su pI, su solubilidad estar disminuida y pueden precipitar. Adems, la protena
puede perder su actividad biolgica a los valores de pH usados para establecer el gradiente. Es
de uso muy restringido.
El volumen que se puede cargar la columna no est restringido en la CIO. Por el contrario,
usualmente esta es una etapa de concentracin, al sembrarse grandes volmenes y recuperar
la muestra en volmenes reducidos.
Las matrices usadas para la CIO son diversas: Sepharosa (dextranos), acrilamida, celulosa,
Sephadex, etc. Ms recientemente se han agregado las matrices con tentculos,
prolongaciones de 15 a 20 monmeros a los cuales se une el grupo inico. Estas matrices
evitan el impedimento estrico que puede ofrecer el soporte para la unin de protenas grandes
y evitan otros fenmenos como los cambios locales de pH que ocurren en el interior de las
partculas en otras matrices. Al respecto, las resinas macroporosas, que poseen poros 10 a
100 veces mayores que los microporos de 10-30 presentes en intercambiadores basados en
geles de dextrano, facilitan el movimiento de los iones y macromolculas, poseen mayor
capacidad de unin de ligandos y velocidades de flujo elevadas.


.
Bioqumica - Cromatografa

6
6
Siembra y lavado Elucin
A
b
s

2
8
0

n
m
%

b
u
f
f
e
r

B
F
u
e
r
z
a

i

n
i
c
a
Interaccin hidrofbica (CIH)

Es una poderosa tcnica separativa para el aislamiento de protenas tanto en escala
preparativa como analtica.
Est tcnica se basa en la interaccin de
biomolculas con grupos hidrofbicos,
ligandos, unidos a una matriz inerte. Los
grupos unidos pueden ser fenil (fuerte), butil,
propil (dbiles), etc., que interaccionan
favorablemente con res. de Leu, Ile, Val, Phe y
otros que pueden estar presentes en la
superficie de una proteina. Aunque la norma
es que los res. hidrofbicos se encuentren en
el interior de la proteina, recientemente
estudios de cristalografa han localizado
parches hidrofbicos superficiales, a menudo
relacionados con la funcin biolgica de la
protena. En general, esta tcnica consiste en
unir la biomolcula de inters a la matriz en un
entorno altamente hidroflico y con fuerza
inica elevada, por ejemplo en presencia de
concentraciones molares de NaCl, (NH
4
)
2
SO
4
,
KCl, etc., realizando la elucin con una
solucin que contiene concentraciones
progresivamente menores de la sal pero
crecientes de algn cosolvente con cierto
grado de hidrofobicidad, tal como glicerol, etilenglicol, etanol, etc. La unin entre la biomolcula
y la resina se da a travs de regiones hidrofbicas expuestas. Estas regiones, al estar en
contacto con un medio altamente polar como lo es una solucin salina, producen una
separacin de fases con el medio, aumentando su energa libre y disminuyendo la entropa en
ese entorno. As, una forma de disminuir el contenido de energa libre del sistema es unir esas
regiones a los centros hidrofbicos de la resina.
Las matrices usadas son diversas, Superose, Sepharose, Sephadex. Permite separaciones
rpidas con buenos rendimientos en general, pero los medios cromatogrficos usados deben
tener caractersticas especiales. As, una densidad demasiado elevada de grupos hidrofbicos
producir rendimientos pobres debido a desnaturalizacin y a las condiciones extremas
Figura 8
Car gado de la columna
(alta fuerza inica)
Lavado Elucin
Inter accin
con la matr iz
Cromatogr afa de inter accin hidr ofbica
Baja fuer za inica,
solvente apolar
Figura 9
Bioqumica - Cromatografa

7
7
requeridas para la elucin. Ac tambin se usa la cromatografa de tentculo.
La Fig. 9 muestra el perfil de elucin de una columna de interaccin hidrofbica en la que se
incrementa el porcentaje del buffer B, conteniendo 20% de glicerol, lo que da como resultado la
aparicin de picos de protena. Los ltimos en aparecer corresponden a aquellas protenas ms
hidrofbicas. Ntese que el gradiente se inicia luego de un cierto perodo de lavado con el
buffer inicial, con lo que se desprenden molculas que no se unen a la matriz, y que en este
caso la fuerza inica disminuye.


Cromatografa de afinidad

La cromatografa de afinidad es
muy usada en el laboratorio como
herramienta analtica y preparativa.
Se basa en la interaccin de
protenas con ligandos unidos a la
matriz de forma muy especfica. En
general se trata de anlogos
(sustancias estructuralmente muy
parecidas) a ligandos que
naturalmente interaccionan con la
protena, p.ej. el sustrato, inhibidor
o cofactor de una enzima; el
mensajero (hormona, neuro-
transmisor, toxina) en el caso de
un receptor, aminocidos
(proteasas; ligandos pseudo-
especficos como pigmentos
(Cibacron blue, dextran blue, etc.)
que se parecen a nucletidos
usados como cofactores, o
secuencias complementarias de
un cido nucleico que se desee
aislar de una mezcla compleja.
Se utilizan matrices diversas:
agarosa, dextranos, acrilamidas, etc., prefirindose aquellas con poros grandes de modo que
posean un lmite de exclusin elevado.
La seleccin del ligando depende de dos factores. En primer lugar, el ligando debe poseer una
elevada afinidad por la sustancia a ser purificada, pero la interaccin debe ser reversible. En
segundo trmino, debe ser posible unir el ligando a la matriz por algn medio sin que esto
modifique sustancialmente su interaccin con la macromolcula. La afinidad del ligando
debera situarse entre 10
-4
y 10
-8
M en solucin. Afinidades pobres (Ki > 10
-4
M) son
usualmente demasiado dbiles para proveer una especificidad adecuada. Si la afinidad es
grande (Ki < 10
-8
M), va a ser muy difcil remover la macromolcula una vez unida sin
desnaturalizar la muestra. El ligando interacciona mejor si est situado en el extremo de un
brazo espaciador que lo aleje de la matriz, lo que evita impedimentos estricos o de otro tipo
relacionados con el tamao o las propiedades de unin inespecficas de la matriz.
Los mtodos de unin del ligando a la matriz son variados, e incluyen:
Activacin por CNBr: permite la unin de ligandos que contengan grupos amino
primarios (Fig. 10).
Activacin epoxi: une a travs de grupos hidroxilo
Car gado de la columna
Lavado Elucin
Inter accin
con el ligando
Cr omatogr afa de afinidad
Figura 10
Bioqumica - Cromatografa

8
8
Activacin por tioles: tiene un espaciador de glutatin que permite unir a travs de
grupos tioles


La elucin se puede realizar incrementando
la concentracin de sal en el medio de
lavado, por la adicin del ligando en forma
soluble (ms frecuente) o por cambios en el
pH de la solucin.


Cromatografia de quelado de metales.

Esta tcnica explota la
propiedad de muchas protenas
de unirse a metales
fuertemente. P. ej. en el caso
de enzimas que requieren un
cofactor metlico para su unin.

Se usan matrices que
contienen grupos que pueden
unir en forma no covalente pero
muy fuertemente iones
metlicos, como Zn o Co, a
travs de grupos
especializados como molculas
de c. iminodiactico
(-CH
2
N(CH
2
COOH)
2
). A
menudo la interaccin se
produce a travs de residuos
de His presentes en la
superficie de la macromolcula.
Estos residuos pueden estar
presentes naturalmente en la
protena o haber sido
artificialmente introducidos por
tcnicas biologa molecular en
el caso de protenas que han
sido clonadas y expresadas en
un sistema heterlogo.

La tcnica consiste en cargar la columna con el in metlico, p.ej. una solucin 1 M de Cl
2
Zn,
luego equilibrar con el buffer, cargar la muestra, y luego eluir con una solucin (o establecer un
gradiente) de EDTA, un quelante que secuestra el Zn y despega por tanto a la protena.

OH
OH
O C NHR
OH
NH
CNBr
RNH
2
Derivado de
tiourea
Activacin de la columna

Lavado Elucin
Car ga de la columna
Cr omatogr afa de quelado
Quelante de Me
++
en el solvente
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Me
++
Figura 12
Figura 11
Bioqumica - Cromatografa

9
9
Otros

En general uno puede generar
columnas de prcticamente lo
que desee debido a que se
dispone de matrices activadas,
p.ej. con grupos epoxi, a los que
puede unirse una gran gama de
ligandos.
Un caso especial de
cromatografa de alta
especificidad lo constituye la
unin de anticuerpos a matrices.
Los anticuerpos se pueden
inmovilizar mediante una
variedad de tcnicas, pero una
de las ms usadas es la unin a
travs de protena A agarosa. La
protena A es una protena
bacteriana que se une con
elevada afinidad al dominio Fc
de la molcula de IgG. De esa
manera, al pasar una solucin
de anticuerpos especficos
contra una determinada
macromolcula a travs de una
columna de protena A-agarosa,
estos quedarn inmovilizados y
formarn un soporte con una
muy elevada especificidad por la macromolcula en cuestin. De esta manera se pueden
purificar protenas con elevados rendimientos. En la Figura 12 se observa un esquema de este
tipo de cromatografa. En el paso 1, se carga la columna con la solucin de anticuerpos. Se
hace pasar luego la mezcla de protenas a separar, quedando unidas slo las que son
reconocidas por el anticuerpo (Paso 2). La elucin se realiza de diversas maneras, por ejemplo
sustituyendo el buffer en que se trabaj hasta el momento (por lo comn cercano a pH 7), por
100 mM glicina pH 3.0.
Por supuesto, la tcnica puede ser usada para la purificacin de anticuerpos de otras
protenas, por ejemplo para la purificacin de IgG total de suero.

La cromatografa de adsorcin es muy usada. En esta las macromolculas se unen por
interacciones no necesariamente de alta especificidad pero con distinta fuerza de acuerdo con
las propiedades particulares de la macromolcula. Ejemplos de matrices de este tipo son la
fosfocelulosa (fosfato de celulosa) o la hidroxiapatita.


Deteccin

Las macromolculas eluidas pueden detectarse por varios mtodos: absorcin en el UV o a la
longitud de onda de absorcin mxima si fueran coloreadas, por variaciones en el ndice de
refraccin, la conductividad, etc. La Fig. 4 muestra un perfil de elucin de una cromatografa de
exclusin molecular en el cual la deteccin se realiza a 280 nm. Obviamente, este recurso
puede utilizarse para protenas que contengan residuos aromticos. Los cidos nucleicos
Purificacin de protenas
mediante protena A Agarosa
A
A
IgG
1
2
3
A
Fc
A
Fc
A
Fc
A
Fc
+
A
Fc
A
Fc
Figura 13
Bioqumica - Cromatografa

10
10
pueden detectarse por absorcin a 260 nm y las protenas tambin a 254 nm (enlace
peptdico). Los hidratos de carbono pueden detectarse haciendo uso de cambios en el ndice
de refraccin. Tambin pueden tomarse alcuotas de los tubos recogidos y hacer all la
determinacin de la concentracin de la macromolcula en cuestin ya sea por sus
propiedades pticas, por su actividad biolgica (actividad enzimtica) o por alguna reaccin
especfica (p.ej. por Coomassie en caso de protenas).

Flujo del solvente

Con respecto a este parmetro, la administracin del solvente se puede realizar por gravedad
o con bombas. El primer caso es posible slo cuando el soporte es suficientemente laxo como
para permitir el flujo sin necesidad de presin adicional. En este caso entran la mayora de
medios cromatogrficos basados en Sephadex. En el segundo caso, pueden usarse equipos
totalmente automatizados que permiten variar el flujo en forma muy controlada y realizar
automticamente los gradientes. La velocidad de flujo est en estrecha relacin con la
resolucin de la tcnica, de modo que este punto se ampla en el siguiente apartado.

Tcnicas cromatogrficas de alta resolucin. HPLC y FPLC.

En general, se pretende que las corridas duren el menor tiempo posible para minimizar la
prdida de actividad biolgica, pero sin sacrificar la resolucin del mtodo.
La distribucin de las macromolculas en una columna durante la elucin hace que se detecten
a su salida de la columna como picos,
caracterizados por su altura y su anchura. Lo
ideal es que cada pico sea tan angosto como
sea posible, para separarlo de sustancias
que eluyan en la vecindad. En la Fig. 14 se
observa una separacin completa de los
picos 1 y 2. Sin embargo, existe un
solapamiento de los picos 3 y 4 , por lo que
las fracciones intermedias entre ambos
contendrn ambos componentes, y
obviamente la purificacin no es en este
caso perfecta.
Dos procesos causan el ensanchamiento del
pico: la difusin y la turbulencia. La difusin
es el proceso por el cual la macromolcula, que se concentra en una banda a medida que se
separa de los otros componentes, tiende a difundir hacia atrs y adelante hacia zonas en que
su concentracin es menor. La difusin depende del tiempo, por lo tanto puede controlarse con
corridas cortas, aumentando la velocidad de flujo. Sin embargo, esto causar que el flujo
alrededor de las partculas no sea laminar, formndose turbulencias en el lado de la partcula
cercano a la salida que ensancharn el pico. Por otra parte, muchos soportes no aceptan
velocidades muy altas debido a que al aumentar el flujo aumenta la resistencia al avance y en
consecuencia la presin. Con ello la fase inmvil tiende a comprimirse, dificultando an ms el
flujo y aumentando mas la presin.
La turbulencia puede controlarse haciendo la partcula cada vez ms chica. A su vez, al achicar
la partcula se aumenta la superficie, aumenta el rozamiento con el solvente y esto hace que se
requiera ms presin para poder lograr un flujo determinado. Para esto se usa un equipo
especializado llamado HPLC (High performance liquid chromatography). En HPLC se utiliza un
sistema de bombas de alta precisin, capaz de entregar flujos muy precisos y constantes a
diferentes velocidades y a elevada presin. Este factor determina que se utilicen caeras y
columnas de acero u otros materiales capaces de soportar hasta 6000 psi (400 atm). Los
0
0.5
1
Abs 280

Volumen
1 2 3 4
Figura 14
Bioqumica - Cromatografa

11
11
soportes utilizados en HPLC tambin poseen caractersticas especiales para permitirles
soportar presiones elevadas. Uno de los materiales ms comunes es la slica, aunque tambin
se encuentran polmeros sintticos de alta resistencia.
El HPLC tiene usos como herramienta analtica pero tambin se puede trabajar en escala
preparativa.
La tcnica de FPLC es un intermedio entre los sistemas de baja presin y el HPLC. En este
caso tambin es posible controlar muy exactamente el flujo mediante un sistema de bombas de
precisin, pero el sistema est limitado a presiones medias, hasta un mximo de 5 MPa. Se
pueden acoplar columnas de diverso tamao y con una variedad de soportes ms amplia que
en el caso del HPLC, aunque no se alcanza la misma resolucin. Su uso se inclina ms a la
parte preparativa (purificacin de protenas, pptidos y ac. nucleicos) que a la analtica.

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