Fabiana G. S.

Pinto
SEQ
SEQ

ENCIAMENTO
ENCIAMENTO
GENMICO
GENMICO
T
T

cnicas e Aplica
cnicas e Aplica

es
es
Fabiana G. S. Pinto
cidos Nuclicos
* 2 tipos de cidos nuclicos: DNA -cido desoxirribonuclico
RNA- cido ribonuclico
* Constituio dos Nucleotideos:
Base nitrogenada - Pentose - Grupo fosfato *
* Bases Nitrogenadas: *
Pricas: Adenina (A) ; Guanina (G) e Pirimdicas: Timina (T), Citosina (C)
Uracil (U)
DNA: A, G, C, e T e RNA: A, G, C, e U
DNA X RNA
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Seqncias no codificadoras
e
Seqncias codificadoras
(proteinas, rRNA, tRNA)
GENES
Repertrio total de genes do organismo vivo
GENOMA
Organiza Organiza o do DNA nos organismos vivos ? o do DNA nos organismos vivos ? * *
Organiza Organiza o do Genoma nos organismos vivos? o do Genoma nos organismos vivos?
Fabiana G. S. Pinto
Conceitos Bsicos
GENMICA: GENMICA:
- Elucidar o genoma de um organismo e o papel dos genes que o compem
desde o ponto de vista estrutural e funcional
1 1- - GENMICA ESTRUTURAL: GENMICA ESTRUTURAL:
- - Identificar, isolar, localizar e caracterizar o conjunto de Identificar, isolar, localizar e caracterizar o conjunto de genes genes de um de um
organismo. (GENOMA) organismo. (GENOMA)
2 2- - GENMICA FUNCIONAL: GENMICA FUNCIONAL:
- -Descrever a fun Descrever a fun o biol o biol gica dos gica dos genes genes mediante o conhecimento de mediante o conhecimento de
como eles interacionam, para definir um fen como eles interacionam, para definir um fen tipo tipo determindo determindo
2.1 2.1- - GENMICA COMPARATIVA GENMICA COMPARATIVA
- Comparao e estudos da evoluo dos genomas
GENOMA: todo DNA existente num organismo
GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional
(protenas ou RNAs)
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OS N OS N VEIS DA PESQUISA GENMICA VEIS DA PESQUISA GENMICA
Genmica Estrutural Genmica Estrutural
Mapeamento
de genes
Seqnciamento
de DNA
Anotao das
seqncias
Genmica Funcional Genmica Funcional
Expresso
Transcriptoma
Anlise de
mutantes
Proteoma
Genmica Comparativa Genmica Comparativa
Fabiana G. S. Pinto
mRNA mRNA
Pr Pr - -mRNA mRNA
DNA DNA
GENMICA GENMICA
ESTRUTURAL ESTRUTURAL
Metab Metab litos litos
Prote Prote nas nas
mRNA mRNA
GENMICA GENMICA
FUNCIONAL FUNCIONAL
TRANSCRIPTOMA TRANSCRIPTOMA
PROTEOMA PROTEOMA
METABOLOMA METABOLOMA
Fabiana G. S. Pinto
DNA
Pr-mRNA
mRNA
R
e
g
u
l
a

o
mRNA
Protena
Metablitos
c
i
t
o
p
l
a
s
m
a
ncleo
(Transcriptoma)
(Proteoma)
(Metaboloma)
(Genoma)
An An lise do fluxo da informa lise do fluxo da informa o celular pela pesquisa genmica o celular pela pesquisa genmica
Mapeamento
Seqnciamento
Anotao
Microarranjos de
DNA
Hibridizao
Eletroforese em
Gel 2D
Espectrometria
de massa
Seqnciamento
de protenas
Cromatografia
Espectrometria
Genmica
Estrutural
Genmica
Funcional
Fabiana G. S. Pinto
1866 Gregor Mendel estabelece as leis da hereditariedade
1903 Walter Sutton - Cromossomos so unidades hereditrias
1913 Thomas Morgan - Cromossomos arranjos lineares de gene
1944 Avery, McCarty, McLeaod, Griffiths - O DNA o material
gentico. Harshey, Chase (1950)
Histrico da Gentica e a Corrida pelo Projeto Genoma
1945 Beadle, Tatum - Um gene codifica uma protena
1953 Franklin, Wilkins, Watson, Crick - O DNA uma dupla hlice
1958 Meselson, Stahl - O DNA replica semicoservativamente
Fabiana G. S. Pinto
1961 Marshall Nirenberg - O cdigo gentico formado por um cdon
de trs bases RNA mensageiro
1983 Kary Mullis cria a tcnica do PCR
1995 Haemophilus influenzae 1 genoma completo sequenciado - TIGR
1978 GENENTECH, americana, produz insulina humana recombinante
1988 Incio Projeto Genoma Humano Estatal-PGH (NIH-USA)
1972 Paul Berg produz a 1 molcula de DNA recombinante, um grande
passo para experimentos entre organismos diferentes,
1998 Craig Venter CELERA GENOMICS- sequenciar genoma humano
2003 Grupo PGH finalizao sequenciamento: 3,2 bilhes pb U$ 4 bilhes
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GENOMAS NO MUNDO
www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/
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GENOMAS NO BRASIL
1997: ONSA criada pela FAPESP Rede 30 laboratrios
2000: Publicado 1 genoma patgeno vegetal: Xylela fastidiosa
(CVC) U$12 milhes
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Fabiana G. S. Pinto
2000: REDE PROJETO GENOMA BRASILEIRO 2000: REDE PROJETO GENOMA BRASILEIRO BRGENE BRGENE
- - 25 centros 25 centros em todo o pa em todo o pa s s
- - CNPq e MCT CNPq e MCT
2001 : 2001 : Chromobacterium Chromobacterium violaceum violaceum - - R R$26 $26 milhes milhes
http://www.brgene.lncc.br/ http://www.brgene.lncc.br/
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GENOMAS REGIONAIS BRASILEIROS GENOMAS REGIONAIS BRASILEIROS
Rhizobiumtropici
Crinipellis perniciosa
Gluconacetobacter
diazotrophicus
Herbaspirillumseropedicae
rea de rea de
Agricultura Agricultura
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de Genomas
Complexidade de Genomas
100000 3 3200 Mb Genoma Humano
12000 10 125 Mb Arabidopsis thaliana
13600 13 180 Mb
Drosophila
melanogster
19099 25 98 Mb
Caenorhabditis
elegans
5885 70 12 Mb
Saccharomyces
cereviciae
4432 90 4,7 Mb
Chromoacterium
violaceum
4288 90 4,6 Mb Escherichia coli
Tamanho
Seqncias
Codificantes
(%)
Nmero de
genes
Fabiana G. S. Pinto
Definio :
- Identificao da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C)
em um segmento de DNA
Seqnciamento de DNA
Importncia:
- O conhecimento da seqncia de bases de um gene fornece
importantes informaes sobre sua estrutura, funo e relao
evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de
organismos diferentes)
* No caso do Projeto Genoma Homem, foi
determinada a ordem exata dos 3 bilhes de
pares de bases que constituem o DNA dos 24
cromossomos
Fabiana G. S. Pinto
Etapas para Seqnciamento Genmico
* Isolamento DNA organismo Biblioteca Genmica
* Fragmentar DNA: mtodos qumicos ou fsicos
* Separao DNA tamanho de interesse (gel) e Reparo do DNA
* Clonagem: fragmento DNA interesse + Vetor (plasmdeo)
- Transformao: Escherichia coli
* Seleo dos transformantes em meio seletivo e crescimento colnias
* Extrao de plasmdeo+inserto : PCR seqnciamento com marcao fluorocromos
* Injeo amostras no Sequenciador Automtico: Leituras fragmentos (READS)
* Obteno grande n seqncias: BIOINFORMTICA
* Processamento e Montagem das seqncias e Anotao do Genoma
Fabiana G. S. Pinto
ESTRAT ESTRAT GIAS DE SEQ GIAS DE SEQ ENCIAMENTO DE GENOMAS ENCIAMENTO DE GENOMAS
shotgun Hierrquico
shotgun genoma inteiro
Gerao de milhes
de fragmentos a
serem seqenciados
Construo
de mapas
de clones
(BAC) e
seleo
dos clones
mapeados
Gerao de
centenas de
fragmentos
a serem
seqenciados
Montagem
Montagem
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento shotgun do genoma inteiro
DNA DNA
Genmico Genmico
Clones Clones Shotgun Shotgun
(Plasmideos ou
Cosmdeos)
Seq Seq ncia ncia
Shotgun Shotgun
Montagem Montagem
Montagem Montagem
final final
Gap Virtual Gap real
Desenho de primer
PCR
Clones para conectar Clones para conectar
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento shotgun Hierrquico
DNA DNA
Genmico Genmico
Clones Clones
Shotgun Shotgun
Seq Seq ncia ncia
Shotgun Shotgun
Montagem Montagem
Montagem Montagem
final final
Clones para conectar Clones para conectar
Seq Seq nciamento nciamento
dos BAC dos BAC
Biblioteca BAC Biblioteca BAC
Contigs Contigs dos dos
clones clones
organizados e organizados e
mapeados mapeados
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento shotgun do genoma inteiro
Cobertura rpida do genoma
Dificuldades para finalizar e fechar o genoma
Seqnciamento shotgun hierrquico
Construo de clones de fragmentos maiores e
mapas genticos e fsicos permite verificao da
montagem das seqncias.
Ambos casos, o nmero de seqncias
geradas dever ter uma cobertura de
> 8 vezes o tamanho do genoma total
Fabiana G. S. Pinto
Mapa gentico marcadores
morfolgicos clssicos, bioqumicos,
genticos, moleculares.
Mapa fsico clonagem de grandes
regies genmicas:
1000 Kb
YACs: Cromossomo Artificial
Levedura
100 300 Kb
BACs: Cromossomos Artificial
Bacterias
PACs: Cromossomo Artificial Fago
45 Kb
Cosmdios: Hbridos fagos e
plasmidios
Seqnciamento plasmdios ou fagos
4 kb
Seqnciamento shotgun Hierrquico
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Seqnciamento final dos clones para ambas estratgias
Eletroferograma
Fabiana G. S. Pinto
Clonagem de DNA em vetores para seqnciamento
* Clonagem de fragmentos
randmicos de DNA de um
genoma completo.
* Clonagem de DNA de um gene
de interesse.
* Diversos tipos de Vetores
PCU18/19 para insertos
4 kb
Inserto DNA no plasmdio
vetor
* Diversos tipos de Vetores
PCU18/19 para insertos
4 kb
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Inserto de DNA e
Vetor cortados com a
mesma endonuclease de
restrio
EcoRI
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Seleo de clones recombinantes, contendo inserto DNA
X-Gal = Substrato cromognico.
Galactosidase funcional usa X-Gal colnias azuis
Galactosidase inativa colnias brancas
Inserto de fragementos DNA
que queremos sequenciar
interrompe a expresso do
gene LacZ. Portanto, o
fentipo resultante de uma
clula de E. coli
transformada com um
plasmideo recombinate com
DNA exgeno uma enzima
Galactosidase inativa
Fabiana G. S. Pinto
Construo de Bibliotecas Genmicas para seqnciamento
DNA genmico total: 500 ug.
DNA fragmentado:
Mtodo fsico, Nebulizao. Sonicao.
Enzimtico, Sau3AI, DNaseI.
1- Fragmentos randmicos de DNA
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2- Reparo das pontas dos fragmentos DNA
GTACTTTACG
CATGAAATGCAAT
GTACTTTACG
** TGAAATGC
GGTA CTTTACG***
* CATGAAATGCAAT
GTACTTTACG blunt
CATGAAATGC
SmaI 1 nico stio de
clonagem no polylinker
Blunt *
Fragmento klenow da
DNA Polimerase I
DNA Polimerase I Fago
T4
Fabiana G. S. Pinto
2- Reparo das pontas dos fragmentos: fosforilao
5 pGTACTTTACG blunt
CATGAAATGCp 5
5 monofosfato
Polinucleotdeo
quinase do fago T4
PNK
Funo do vetor usado para clonagem:
- Kit utilizam sistema TOPO topoisomerase II
( desfosforilar os fragmentos em funo do vetor
fosforilado)
- Vetor pUC 18 (inverso do Kit TOPO)
Fabiana G. S. Pinto
3-Seleo dos fragmentos de DNA do tamanho desejado
Low Melting Agarose
Cortar fragmentos entre
1 3 Kb
KB
3 KB
1 KB
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4-Ligao dos fragmentos no vetor pUC18 e transformao
Seleo Ampicilina
e colnias brancas
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Seleo de clones: Ampicilina (250 g/mL) e colnias brancas
Colnias
azuis sem
inserto
Colnias brancas
contm inserto
sero picadas para
placas
Fabiana G. S. Pinto
Crescimento de clones para extrao do DNA plasmidial: mini-prep.
Placas deep well para crescimento
dos clones de E. coli.
Meio LB Ampicilina. 12 a 16 h.
37C. 150 rpm.
Mini-prep Lise alcalina
Placa de fundo U
Placa Millipore filtro para
purificar DNA plasmidial na
ultima etapa da mini-prep
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Crescimento de clones para extrao do DNA plasmidial: mini-prep.
Ressuspenso.
Tampo Tris-HCl. EDTA. Glicose.
RNAse.
Lise
NaOH/SDS. Solubilizar componentes de
membranas celulares e lise celular.DNA
cromossomal e plasmidial e proteinas
desnaturados. RNA degradado.
Neutralizao.
Acetato de potssio. Precipitao
protena, restos celulares e DNA
cromossomal em complexo sal-
detergente insolvel. DNA plasmidial
re-natura corretamente em
sobrenadante.
Purificao DNA plasmidial.
Centrifugao. Filtrao (millipore).
Sobrenadante DNA plasmidial
precipita Isopropanol/Etanol.
Fabiana G. S. Pinto
Eletroforese em gel de agarose
Gel de Mini-prep em placa de 96 poos
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA
1977. Duas tcnicas de seqnciamento.
MAXAM-GILBERT Mtodo Qumico.
FREDERICK SANGER Mtodo Enzimtico.
Fred Sanger
Gilbert
Fabiana G. S. Pinto
MAXAM-GILBERT:
alterao qumica das bases
Walter Gilbert
Fabiana G. S. Pinto
Mtodo de Maxam-Gilbert
Preparaes de DNA.
Marcao com fosforo
radiativo (
32
P) no extremo 5.
Alterao qumica das
bases. Remoo e clivagem.
Separao dos fragmentos
por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Fabiana G. S. Pinto
Frederick Sanger
Mtodo Didesxi/ Enzimtico
ou
Terminadores de Cadeia
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA
4 dNTPs
desoxinucleotdeos
trifosfatos
ddNTPs Terminadores marcados
ddG, ddA, ddT, ddC
( fluorescncia)
4 ddNTPs
di-desoxinucleotdeos
trifosfatos
Mtodo de Sanger
Fabiana G. S. Pinto
Mtodo de Sanger
Qumica de terminao da cadeia com di-desoxinucleotdeos. ddNTP.
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA Manual : Mtodo de Sanger
DNA molde
A T T G G C G A A
A T T G G
A
A T T G G C
C A C A C T A T T C G T T T A T C
3 5
T A A
5
T A A
5
T A A
5
T A A
5
A
3
C
3
C C A C T A A T T C G T T T A T C
5
3
T C A C T A A T T C G T T A T C C
5
3
T
3
C A C T A A T T C G T T T A T C C
5 3
G
3
Video: Sequenciamento Manual
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA
Auto-radiografia de Gel de
seqnciamento clssico para
ambos mtodos Maxam-
Gilbert e Sanger.
Gel desnaturante. Formamida
ou Uria.
ddNTPs marcados com
32
P
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA Automatizado
Seqnciamento automatizado ABI 377
ABI 377
Sistema de eletroforese
gel de poliacrilamida.
Capacidade para 48
leituras
em 5 a 6 horas.
Seqncias de boa
qualidade > 400 pb.
Fabiana G. S. Pinto
MegaBace 1000.
Sistema de eletroforese
capilar.
Capacidade para 96
leituras
em 1 a 3 horas.
Seqncias de boa
qualidade > 400 pb.
Seqnciamento de DNA Automatizado
Seqnciamento automatizado MegaBace 1000
Vdeo Sequenciamento Automtico
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Reao Seqnciamento:
Primer: Universal ou Reverso para
plasmdeos ou cosmdeos.
* DNA: 200 400ng plasmdeo (+/-4 kb)
> 800ng cosmdeo (+/-40 kb)
* Dye ET Mix
Termociclador: Ciclos de PCR
Kit de seqnciamento: DyeET Mix. Mistura contendo enzima de
seqnciamento, Thermo Sequenase (DNA Polimerase com alta
processividade e afinidade para dNTP). ddNTP, Dye terminators com duas
marcas de fluorescncia.
Seqnciamento de insertos em vetores (plasmdeos ou cosmdeos)
Placa de 96 well
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Preparao para injeo
das amostras
Matriz Poliacrilamida
Placa com Tampo
Placa com amostras
* Ajustar parmetros de
injeo.
* Eletro-injeo.
Voltagem (Kv) e
tempo de injeo (s).
Aps Reao de seqnciamento:
* Precipitao dos produtos de
PCR. Eliminar os dNTP, ddNTP
no incorporados, enzimas
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Compartimentos internos de ctodo e anodo
ctodo anodo
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Interior da cmara contendo 6 conjunto de 16 Capilares c/u (96)
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Sistema de deteco e identificao de terminators ddNTP
Cada um dos quatros dideoxy terminators ddG, ddA, ddC, ddT esto
marcados com dois tipos de dye fluorescena e rodomina.
A fluorescena alto coeficiente de extino (488nm) no laser de argon.
Atua como um dye doador absorve a energia da luz do laser incidente e a
transfere para o dye aceptor (rodomina)
A rodomina emite a luz em um comprimento de onda caracterstico para a
identificao dos 4 nucleotdeos que terminam a fita de DNA.
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Deteco de fluorescncia no sequenciador automtico
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento em MegaBace 1000
Eletroferograma e seqncia em nucleotdeos
A = verde G= preto
C= azul T= vermelho
Tamanho da seqncia= 400 700 bp
Fabiana G. S. Pinto
Eletroferograma completo
Fabiana G. S. Pinto
Seqnciamento de DNA em MegaBace 1000
Score Card
Vdeo Sequenciamento Automtico 2
Fabiana G. S. Pinto
Obteno de Seqncias geradas pelo MegaBace 1000
* PHRED:
- Transforma os dados brutos em seqncias de bases, atribu valores
de qualidade a cada base na seqncia e gera arquivos de sada FASTA
e PHD
* PHRAP:
- Leitura Montagem dos pequenos fragmentos de DNA seqenciados em
seqncias maiores: CONTIG
* CONSED:
- Visualizao e edio das montagens das seqncias de alta qualidade
Dados brutos (medidas analgicas) de sada do seqnciamento Base calling
BIOINFORMTICA
Fabiana G. S. Pinto
Valores de qualidade gerados pelo PHRED
Quando arquivos de seqncias de DNA so analisados pelo phred
a cada base assinada um valor de qualidade, o qual uma
estimativa da probabilidade de erro para essa base.
Bases com um valor de qualidade de 20 so consideradas com um
alto valor de qualidade.
q = -10 log
10
(pe) onde pe= erro estimado
q20 = 1/100 probabilidade de erro
q30= 1/1000 probabilidade de erro
q40= 1/10000 probabilidade de erro
Fabiana G. S. Pinto
Regies genmicas que podem ser melhoradas re-seqnciamento.
Fabiana G. S. Pinto
Anlise e Montagem das Seqncias
Seqncias shotgun analisadas Phred, Phrap e Consed
Resultado
Seqncias ordenadas com consenso formam um CONTIG
Fabiana G. S. Pinto
Evolu Evolu o do seq o do seq nciamento nciamento shotgun shotgun
Projeto genoma depositar as seqncias para a central de Bioinformtica
Evoluo dos contigs
com a submisso
das seqncias
shotgun.
Finalizao
40% a 50%
do tempo total do
projeto
Fabiana G. S. Pinto
PCR
Animaes
http://www.dnalc.org/Sockwave/pcranwhole.html
MUITO
OBRIGADA!!!!!!!