Introduccin

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios

biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos
microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via
metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria
al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben
aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
De la amplia variedad de pruebas bioqumicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10,
aplicados a 5 especies de microorganisos.
Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados
experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.
Objetivos
Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar -aplicando ste mtodo-
distintos microorganismos.
Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioqumcas es o son el
(los) adecuado(s) de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.
Entender los principios bioquimicos de las pruebas.
Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas
bioqumias
Conocer el uso de las pruebas bioqumicas para la identificacin de microorganismos
Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder
reconocer en que partes del procedimiento se cometi el o los errores, para as, mediante
el desarrollo experimental conocer mas profundamente las pruebas bioqumicas.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD TECNOLOGICA
TECNOLOGA DE ALIMENTOS
Microbiologa
Pruebas Bioqumicas
Autor:
Lab N 4
Cod. 06
Bibliografa
Microbiologa / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan
2a. ed. en espaol, 1993. Mxico ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.
Microbiologa / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid
2a. ed. en espaol., 1982. Mxico : Ed. McGraw-Hill.
Tratado de microbiologa : con inclusin de inmunologa y
gentica molecular / Bernard D. Davis
2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.
Internet:
http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html
http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html
http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html
http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html
Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C
oxidasa.
Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se
detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este
compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es
incolora, pero cuando se oxida vira a prpura.
Procedimiento:
Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del
tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el
papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio
oxidativo.
Se considera positva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra.
Resultados:
(+) Pseudomonas aeruginosa
( - ) Escherichia coli
Prueba de la Catalasa
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa
El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser
ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la
enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).
Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo
previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del
microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente
debe acercrse a la muestra de la solucion liquida de perxido de hidrogeno y debemos
observar la reaccin de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno.
Resultados:
(+) Staphylococcus aureus
( - ) Streptococcus spp.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es
buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el
plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del
genero Staphylococcus.
Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma
de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas
de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidroflico y lo llevamos a bao
Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la
hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.
Resultados:
Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:
1: pequeos cogulos no oganizados
2: pequeos cogulos oganizados
3: gran cogulo organizado
4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.
Se consideran positivos los niveles 3 y 4.
(+) Staphylococcus aureus
( - ) Staphylococcus epidermis.
Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine Motilidad-Indol-Ornitina)
Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la
reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24
horas a 37 .
Interpretacin y Resultados:
Reaccin Interpretacin
Enturbiamiento del
Agar.
Hay movilidad
Agar transparente de-
sarrollo solo en picada
No hay movilidad
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloracin Amarilla (cido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( - )
Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin
de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite
la identificacin de la produccin de SH2.
Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la
familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
bacterias fermentadoras de la glucosa
bacterias fermentadoras de la lactosa
bacterias fermentadoras de sacarosa
bacterias aerognicas
bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.
Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a
5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un
movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe
medir el pH de los cultivos.
Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias
no fermentadoras comoPseudomonas sp.
Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella
spp.
Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas,
produccin de cido sulfhdrico.Salmonela spp.
Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse
SH2 o no. Escherichia coli.
A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.
Prueba LIA (Lysine Iron Agar Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o
desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms
sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella
de aislamientos primaros.
Procedimiento:
Inocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar
por 24 horas a 37 .
Interpretacin y Resultados:
Reaccin Interpretacin
Azul (alcalino) Hay movilidad
Rojo No hay movilidad
Engrecimiento Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar No descarboxila
Fondo Amarillo y
Tendido prpura
Descarboxilacin de lisina
Pruebas Bioqumicas IMViC:
Agar Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la
identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se
detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el
crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador
azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en
un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C
durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra,
acompaado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.
( - ) Escherichia Coli
Indol
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano
con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una
caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos.
La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo
de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en
triptofano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24
horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior
del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo,
segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Klebsiella pneumoniae
Rojo Metilo
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes
gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de
fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos
generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la
fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico,
adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de
cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y
CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que
se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.
Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del
microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el
tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es
positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es
suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por
la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es
considerado como positivo.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Enterobacter aerogenes
Vogues Proskauer
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol
descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto
intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno
la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un
color rojo-fucsia.
Procedimiento:
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en
estudio. Incubar a 35C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin
transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2
ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno
atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia
luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona
y por lo tanto una prueba VP positiva.
Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(-)Escherichia coli