1. Switzer, R. y L. Garrity.

Experimental Biochemistry
2. TAMAO ONO AND ROCKY S. TUAN.
PURIFICACIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE
POLLO
Equipo 7. Avila Vzquez Rodrigo, Avila Snchez Talia Fernanda, Leon moreno Liz Berenice, Rodrguez Jurez
Abraham
Resumen
Se lograr extraer la protena LDH del
musculo de pollo y por medio de la
precipitacin por salado se eliminar gran
cantidad de contaminantes del
homogenizado resultante, as mismo dicha
protena se obtendr purificada despus
de utilizar las tcnica cromatograficas:
exclusin molecular donde la protena ser
separada de partculas de menor tamao
debido a la unin de estas a los poros de la
matriz y eluir primero al agregar la solucin
de elucin; en afinidad se basa en la
interaccin especifica y reversible entre la
protena y un ligando especifico unido a la
matriz cromatografca y se elura con una
solucin de NADH.. Se determinar la
concentracin de la protena en los
diferentes fracciones separadas en cada
etapa de la purificacin haciendo uso de las
tcnicas de A 280nm y el mtodo de
Bradford, donde el segundo mtodo ser
ms sensible. A travs de la electroforesis
SDS-PAGE se verificar el progreso y el xito
de la purificacin de la protena LDH, se
obtendr el peso molecular de la misma al
interpolar con los datos de marcadores
moleculares conocidos y se observar una
mejor purificacin en la fraccin de
cromatografa por intercambio inico o por
afinidad.

Introduccin
La lactato deshidrogenasa (LDH) es
una enzima que ayuda a producir energa. Es
una enzima catalizadora que se encuentra en
muchos tejidos del cuerpo, pero su presencia
es mayor en
el corazn, hgado, riones, msculos, glbul
os rojos, cerebro y pulmones.
Corresponde a la categora de
las oxidorreductasas, dado que cataliza una
reaccin redox, en la que el piruvato es
reducido a lactato gracias a la oxidacin
de NADH a NAD
+ 1
. Dado que la enzima
tambin puede catalizar la oxidacin
del hidroxibutirato, ocasionalmente es
conocida como Hidroxibutirato
Deshidrogenasa (HBD). Participa en
el metabolismo energtico anaerobio,
reduciendo el piruvato (procedente de
la gluclisis) para regenerar el NAD
+
, que en
presencia de glucosa es el sustrato limitante
de la va glucoltica.
La Purificacin es el proceso que cuenta con
varias etapas cuyo objetivo es lograr la
concentracin diferencial de la protena o
molcula de inters. El primer paso en el
aislamiento de una protena es la rotura
celular, para posteriormente poder extraer la
protena con un tampn adecuado.
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El
mtodo de rotura a elegir depende de las
caractersticas mecnicas del tejido o clulas
de donde se va a aislar la protena, as como
de su localizacin. Entre los distintos
mtodos ellos estn:
* Lisis celular. Vlido para clulas sin pared
celular (ej. clulas de tejidos animales),
consiste en suspender las clulas en una
solucin hipotnica.
* Destruccin mecnica. Entre estos
mtodos se encuentran la homogenizacin
(hacer pasar las clulas entre un tubo y un
pistn de vidrio que ajustan casi totalmente).
* Congelacin-descongelacin. La rotura se
produce al someter las clulas a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero
a -196 C y a temperatura ambiente 25 C.
* Protena de asociacin subcelular:
Separacin del resto del material celular a
travs de centrifugacin diferencial
Una vez que la protena se ha extrado de su
entorno natural est expuesta a muchos
agentes que pueden daarla como: Cambios
bruscos de pH, cidos y bases fuertes,
Temperaturas extremas, Accin de las
proteasas.
3. Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry
4. http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf
La cromatografa es una tcnica utilizada
para separar y purificar protenas segn sus
propiedades.
En la Cromatografa de exclusin molecular
(filtracin en gel), en esta tcnica las
molculas se separan segn su forma y
tamao. La fase estacionaria est compuesta
por microesferas de material hidratado
esponjoso que contiene poros con un rango
relativamente estrecho de dimetros. Si en
una columna esos tamices moleculares se
pasa una solucin acuosa con molculas de
distintos tamaos, las que son demasiado
grandes para ingresar en los poros se
excluyen del volumen de solvente ubicado
en el interior de las microesferas.
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Por lo
tanto, estas molculas grandes atraviesan la
columna con ms rapidez, esto es, un
volumen menor de eluyente, que las
molculas que logran ingresar en los poros.

En la Cromatografa de afinidad se basa en la
interaccin especifica y reversible entre la
protena y un ligando especifico unido a la
matriz cromatografca. Se utiliza un
colorante Cibacron Blue, la protena se une a
la columna y se elua con una solucin de
NADH.
Electroforesis, es una tcnica para la
separacin de molculas segn la movilidad
de estas en un campo elctrico a travs de
una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaos moleculares y carga
elctrica.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecil sulfato de sodio (SDS), la separacin
electrofortica de protenas con relacin
carga: masa casi idntica se suele efectuar en
geles de poliacrilamida. Cuando la mezcla de
protenas se aplica a un gel y se le pasa una
corriente elctrica, las protenas ms
pequeas migran ms rpido a travs del gel
que las protenas ms grandes. La velocidad
a la cual una protena se mueve a travs del
gel depende del tamao del poro del gel y de
la fuerza del campo elctrico. El SDS
desnaturaliza las protenas, haciendo que las
protenas multimericas se disocien en
subunidades y todas las cadenas
polipeptdicas adquieran una carga negativa,
por lo cual su migracin solo depende de la
masa.
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Bibliografa:
* Switzer, R. y L. Garrity. Experimental
Biochemistry: Theory and exercises in
fundamental methods. 3rd edition, Freeman
and Company, New York 1999
*http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electro
foresis.pdf
* TAMAO ONO AND ROCKY S. TUAN. Effect
of experimentally induced calcium deficiency
on development, metabolism and liver
morphogenesis of the chick embryo. /.
Embryol. exp. Morph. 92, 207-222 pp.