Tincion 1

Los microorganismos tienen un ndice de refraccin muy parecido al del medio en
que se encuentran suspendidos. Por no existir un contraste suficiente que las haga
claramente visibles en necesario teirlas para distinguir du morfologa.
La tincin (trmino ms comn) o coloracin es una tcnica auxiliar en microscopa
para mejorar la biodiversidad actual, ya que est en un trmino muy malo gracias a
la contaminacin vista al microscopio. Los procedimientos que ponen de manifiesto
diferencias entre las clulas bacterianas o en partes una clula se conoce como
tcnica de coloracin diferencial. Son algo mas que elaboradas que la tcnica
simple en la que las clulas se someten a una sola solucin colorante o reactivo
colorante. Las tinciones se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano;
si la clula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El mtodo, por
consiguiente, es bastante drstico y puede producir artificios.
Por eso en esta practica que realizamos en el laboratorio fueron las siguientes:1)
TINCION SIMPLE que constituye una tcnica sencilla y directa que a travs del
uso de un colorante (azul de metileno), nos permite contrastar y diferenciar los
microorganismos de su contorno. 2) TINCION DIFERENCIAL GRAM que nos
permite distinguir no solo bacterias sino a diferenciar o distinguir entre dos grupos
bacterianas. 3) TINCION DIFERENCIAL ACIDO RESISTENTE que sirve para
observar endosporas de bacterias.
Estas tres formas de tincin hacen que tengamos ms conocimiento de su
morfologa de los microorganismos, por tanto al concluir la practica el alumno
estar en la capacidad de
Identificar los microorganismos previa coloracin.
INTRODUCCION
MICROBIOLOGIA GENERAL

ING. VILMA REYES DE LA CRUZ Pgina 2

Desarrollar las tcnicas de coloracin simple, diferencial y de estructuras.

TINCIN SIMPLE: En las tinciones simples se usa un nico colorante, que
siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para incrementar el contraste;
todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color.
Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Si se
utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante. Pelczar, (1995)
El estudia levaduras, en este experimento se usa un solo colorante que fue
azul de metileno, donde observamos que las levaduras tenan cocos. Estas
clulas bacterianas difieren desde el punto de vista qumico de su medio
exterior y por eso se tien contrastando con su alrededor. Geo y col, (2007)

TINCION GRAM: La tcnica de la tincin de GRAM. Fue desarrollada por el
bacterilogo dans Christian GRAM en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias
en dos grupos: GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS. Pelczar, (1995)
Tincin de Gram, mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin
especfica. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la
tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas
bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram
variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen
fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora
REVISION
BIBLIOGRAFICA


intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch
de la tuberculosis.Geo y col, (2007)

TINCION DE ESPORAS
La bacteria es una estructura muy pequea, sin embargo, por medio de esta tincin
se puede observar la estructura interna de la clula bacteriana, particularmente las
endosporas, en este experimento se utiliza una tincin simple debido a que la
misma permite que se coloree toda la clula excepto la espora que se observa de
un tamao bien aceptable.Geo y col, (2007)

Formas de resistencia producida por las bacterias de los gneros Bacillus y
Clostridium, que les permite sobrevivir en condiciones adversas. Las esporas son
estructuras densas en las que se transforman las bacterias para resistir el calor o la
desecacin, y son muy resistentes a la accin de desinfectantes.
Cuando las condiciones vuelven a ser favorables, las esporas germinan y dan lugar
de nuevo a la bacteria en forma vegetativa. El descubrimiento de que existen
esporas bacterianas, fue de gran importancia para la microbiologa. El saber que
existen tales formas notablemente termo resistente fue esencial para el desarrollo
de mtodos adecuados de esterilizacin. Lpez (2002)



MATERIALES:
Porta objeto

Pizeta

Mechero

Gotero

Microscopio

Bao maria

Rejillas

Varilla de vidrio



REACTIVOS:
Yogurt (muestra)

Clostridium
(muestra)

Azul de metileno

Cristal violeta

Lugol

Safranina

Verde malakita

Alcohol
l
Agua destilada

METODOS:
TINCION SIMPLE:
1) Pusimos una gota de yogurt en un porta objeto Y lo extendimos con una
varilla de vidrio.
2) Se puso a secar en el mechero de bunsen.


3) Teimos con el colorante azul de metileno (una gota), y luego lo hicimos
secar en el mechero.
4) Se lavo con agua destilada y se hizo secar el exceso de agua.
5) Y por ultimo echamos una gota de aceite de inmersin en el objetivo y
miramos en el microscopio.

TINCION DIFERENCIAL GRAM:
1) Pusimos una gota de yogurt en un porta objeto y lo extendimos con una
varilla de vidrio.
2) Teimos con una gota de cristal violeta, hicimos secar y luego lavamos con
agua destilada.
3) Cubrimos la muestra con lugol, la hicimos secar en el mechero y
decoloramos con alcohol cetona.
4) Teimos con safranina, secamos y lavamos con agua destilada.
5) Secamos el exceso de agua y fuimos a observar en el microscopio con
aceite de inmersin.

TINCION DIFERENCIAL ACIDO RESISTENTE:
1.- En un porta objeto echamos una gota de muestra (Clostridium) con el asa de
kolle junto al mechero.
2.- Secamos la muestra.
3.- Hemos agregado verde de malaquita y secamos en el bao mara.
4.Lavamos con agua destilada.
5.-Hicimos cubrir la muestra con safranina en el bao maria
6.- Lavamos con agua d. y dejamos secar en el mechero
7.-Echamos una gota de aceite de inmersin y observamos en el microscopio.



RESULTADOS
PRACTICA 1: TINCION SIMPLE
Imagen de la bacteria Descripcion de la bacteria
observada

Se observo
cadenas de
estreptococcus.
Las bacterias
tomaron el color
azul.

DISCUSIN:
Segn el manual de practicas de microbiologia; el azul de metileno
reacciona con las clulas cargada negativamente a la tasa mas baja,
tomando de 20 a 30 segundos para teir apropiadamente para teir
apropiadamente una preparacin microbiana; mientras que el cristal de
violeta requiere solo 10 segundo y la carbolfucsina solo 5 segundos
Segn Jwest, Melnick y Adelberg; las tinciones bsica colorean a las celulas
bacterianas de manera uniforme a menos que antes se destruyan el RNA
del citoplasma.
RESULTADOS Y DISCUSIONES


PRACTICA 2: TINCION GRAM
Imagen de la bacteria Descripcin de la
bacteria observada

Se observ
Streptococcus y
bacilos
La coloracin de
la bacteria fue
azul violeta por lo
tanto se tratan de
bacterias gram
positiva

Discusion
Segn Jwest, Melnick y Adelberg; las clulas se tratan con alcohol por
consiguiente las gram positivas retienen el complejo cristal violeta yodo y
permanece azules mientras las clulas gram negativas se decoloran. Luego
se aplica una contra tincin de tal manera que las clulas gram negativas
adquieren un color contraste y las gram positivas de color violeta


Segn http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram:
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se
vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la
retencin o el escape del colorante.

PRACTICA 3: TINCION ACIDO RESISTENTE

Imagen de la bacteria Descripcin de la bacteria
observada

Se observ
endosporas.

DISCUSION:
Segn Jwest, Melnick y Adelberg: las bacterias acido alcohol resistente son
las que retiene la carbolfucsina incluso al ser tratadas con acido clorhdrico
en alcohol , estas bacterias se observan rojas mientras que otros tomas el
color de la contra tincin.

Segn; Las bacterias cido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados
segn la tincin de Gram, la cual es la tcnica ms comn en la
microbiologa contempornea, sin embargo puede ser teido con algunas
tinciones concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la


capacidad de resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido,
el cual es el decolorante ms comn en los protocolos de tincin de
bacterias, de donde viene el nombre Alcohol-cido resistente.

El yogurt en su composicin poseen bacilos microaerfilos, gram positivos y
catalasa negativos.

En la tincin simple solo se trabajo con el azul de metileno y pudimos
observar Streptococcus.

En la tincin Gram realizada en la prctica se observaron a las bacterias
azul violeta por lo que concluimos que se trata de las bacterias Gram
positiva.
Y en la Tincin cido resistente, gracias al verde malaquita y la safranina,
pudimos observar algunas bacteria que haban desarrollado la endosporas.
Gracias a las tinciones, podemos ahora estar preparados para elaborar
muestras, que va a ser de mucha utilidad en el anlisis de alimentos y
estudios de microorganismos.



TINCIN SIMPLE
1. Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?
- El mutualismo es una interaccin biolgica entre individuos de diferentes
especies, en donde ambos se benefician y mejoran su aptitud biolgica. Las
acciones similares que ocurren entre miembros de la misma especie se
llaman cooperacin. El mutualismo se diferencia de otras interacciones en
las que una especie se beneficia a costas de otra; stos son los casos de
explotacin, tales como parasitismo, depredacin, etc.
- Las asociaciones mas frecuentes en bacterias son los diplococccus,
estreptococcus, sarcinas, donde presentan una forma redondeada,
bastoncitos y esporaceas.

2. en qu rango de tamaos se define las bacterias?



3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
Tincin directa simple: el Mo se tie con un solo colorante.
Tincin negativa: El Mo permanece sin teir y resalta sobre el fondo coloreado.
5. Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los
colorantes empleados?
La coloracin o tinciones en microbiologa, consiste en cubrir las
preparaciones con uno o varios colorantes de forma secuencial durante un
tiempo determinado. Existen las tinciones simples que se usan para observar la
morfologa y el agrupamiento bacteriano, entre los colorantes tenemos el azul
de metileno, cristal violeta y fucsina.

Las tinciones dobles o diferidos; se usan para poner de manifiesto diferencias


entre microorganismos o parte de ellos, la tincin de gram, es la ms utilizada
en Microbiologa, ya que diferencia a las bacterias en gram positivas y gram
negativas, segn retengan el cristal violeta utilizado en la tincin, las gram
negativas no retienen el cristal violeta cuando son decoloradas por una mezcla
de alcohol y acetona. las gram positivas (+) si retienen el colorante inicial, las
gram negativas (-) se cogern el segundo colorante; la safranina y presentan
color rojo

TINCIN DIFERENCIAL GRAM
1. bajo que circunstancias la tincin diferencial gran podra resultar errada?
- Cuando no se sigue el protocolo correcto; y es:
Protocolo
Recoger muestras
Hacer el extendido en espiral
Dejar secar a temperatura ambiente
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3
veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1
min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de
color azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar
1-2 min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram
negativas.
Enjuagar con agua.


Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con
aceite de inmersin
2. Qu efecto traera reemplazar el lugol con otro agente oxidante?
No ejercera la accin misma que tiene este ante la tincin gran, por lo mismo el
lugol es empleado en la tincin de Gram para retener el colorante cristal violeta. El
I
2
entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el
cristal violeta.

3.- Podra usted variar el colorante primario (cristal violeta) y el contraste
(safranina) obteniendo los mismos resultados?
Las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la
mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado
delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta que se form
previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta, y
manteniendo la coloracin azul-violcea.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas
(decoloradas por el agua).
Si cambiamos el orden del colorante con del contraste de la muestra de yogurt se
obtendran resultado la coloracin del contraste ya que las bacterias del yogurt son
gran positivas y retendran la primera decoloracin porque poseer una pared celular
ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse la primera decoloracin , y
manteniendo la coloracin primaria.
4. Qu es la influencia del pH en la reaccin de gram?
Los microorganismos Gram positivos pueden hacerse Gram negativos al aumentar la
acidez, de la misma forma los microorganismos Gram negativos pueden hacerse Gram
positivos al aumentar la alcalinidad. Adems los microorganismos de reaccin positiva a
los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad y los
microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gram
negativos por aumentar la acidez.


5. liste 5 ejemplos de bacterias gran positivas y 5 de gran negativas,
sealando su importancia.
Muchas de estas especies causan enfermedades como:
Gram negativas:
Neisseria gonorrhoeae: causa la gonorrea.
Neisseria meningitidis: causa meningitis.
Moraxella catarrhalis. Sntomas respiratorios.
Hemophilus influenzae. Enfermedades respiratorias.
Helicobacter pylori: enfermedades gastrointestinales.
Gram positivas:
Los estafilococos: pueden causar neumona.
Estreptococos: pueden ser responsables de infeccin en la sangre.
Bacillus. ntrax.
Clostridium: ttano.
Corinebacterias: difteria.

TINCIN DIFERENCIAL ACIDO RESISTENTE
1. Cul de los mtodos utilizados le permiti observar mejor las endosporas
bacterianas? a qu atribuye la diferencia?
La tincin diferencial ,fue el mtodo ms eficaz pues es el ms usado ya que las
bacterias con endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a
los factores ambientales adversos .Este mtodo es el ideal para este tipo de bacterias. La
diferencia est en el tipo de colorantes usados los cuales, como ya dijimos son capaces de
distinguirse en las endosporas.
2. Qu efecto producira al reemplazar el alcohol acido por otro decolorante
como el alcohol cetona?


Permite la clasificacin de las bacterias en gram positivas y gram negativas segn
su composicin de su pared celular.
En cambio en las gram negativas deja el color rosado de la safranina.

3. Qu otro gnero de bacterias pueden formar endosporas?
Las bacterias que forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo y
pertenecen principalmente a los gneros Streptomyces, Clostridium y Bacillus.
1. Otras formas de tincin:
Tincin Simple: utiliza un solo colorante.
Tincin de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina
30 seg)
Tincin cido Resistente:
Una vez teidos, conservan su color resistiendo al lavado con cido mineral
reducido. En esta tincin las bacterias cido resistentes conservan el colorante
primario color rosa o rojo, los dems microorganismos son decolorados por el cido
y toman el color azul.
Tincin de Giensa:
El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de
protozoos en la sangre para observar materias ncleos de la clula.
Tincin de Esporas:
Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.
Tincin de Cpsula:
Colorante negrosuna, aqu se observa microorganismos encapsulados creando
resistencias.


Tincin de Flagelos:
Se usa mordiente el cual aumenta el tamao del microorganismo
4.- Revise otras tcnicas de tincin de esporas y comprelas con las usadas
en este ejercicio:
Tincin con verde malaquita
Procedimiento
1. Cubrir el portaobjetos con verde malaquita.
2. Calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 3 minutos.
3. Lavar con agua.
4. Cubrir del portaobjetos con safranina para contrastar. Dejar actuar 1 minuto.
5. Lavar con agua y secar con papel de filtro.
En la observacin microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las
clulas vegetativas de rosa.

Todos los procedimientos para ver bacterias esporuladas son casi el mismo con la
prctica realizado en el laboratorio con pequeas variaciones como en la prctica
mostrada porque microscpica las esporas aparecen teidas de verde y las clulas
vegetativas de rosa, por lo dems son casi iguales
Observamos que cuanto ms preciso sea la tincin mejor ser la observacin en el
microscopio



Michael J. Pelczar y Roger D. Reid, E.D.S. Chan (1995) microbiologa.
Cuarta edicin. Editorial Mc.Graw-Hill de Mexico S.A. de C.V.
Lpez. A. Enciclopedia Interactiva Estudiantil Siglo XXI Edicin 2002
Editorial Cultural S.A Madrid- Espaa 2002
Jwest, Melnick y AdelbergMicrobiologia Medica 24va edicion
Geo F. Brooks, Karen C. Carroll, Janet S. Butel yStephen A. Morse
(2008). Microbiologia MedicaEditorial. Manual Moderno. 19a. Edicin



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