Cultivo de clulas y rganos y propagacin clonar como fuente de frmacos

Ciertos factores se oponen a la dependencia de la industria farmacutica respecto al

empleo de materias primas vegetales para la obtencin de frmacos, y estos factores han
sido, en cierto modo, responsables de la resistencia de la industria a investigar la
explotacin del reino vegetal. Entre estos factores se encuentran:
Disponibilidad de la materia prima. Ciertas plantas, aun poseyendo una elevada
calificacin en cuanto que fuentes de principios bioqumicos, no pueden ser producidas en
cantidad econmicamente suficiente para satisfacer la demanda. Un ejemplo lo
constituyen las semillas de Strophantus sarmentosus que, inicialmente, en la investigacin
de precursores de corticosteroides (1950), se supo que contenan un principio, la
sarmentogenina, sumamente til por su sustitucin en el anillo C esteroidico
(Vase Captulo 28). Pero estas plantas son lianas tropicales que existen como diferentes
razas qumicas (Captulo 10), no muy abundantes y de difcil cultivo.
Fluctuacin de los abastecimientos y la calidad. La produccin de drogas vegetales est
sometida a caprichos del clima, enfermedades de la plantacin, variacin de los mtodos
de recoleccin y de desecacin, que influyen en la calidad y en la variacin inherente a los
principios activos referidos a plantas de la misma especie, pero que poseen
caractersticas genticas diferentes.
Consideraciones polticas. Cuando un nuevo frmaco ha sido patentado con xito, el pas
de origen de la materia prima puede intentar explotar la situacin, embargando la
exportacin de la droga y elevando el precio de sus propias exportaciones mediante el
tratamiento de las plantas por el propio pas, con vistas a obtener los principios activos.
Esto acaeci con la Rauwolfia serpentina (India) y Dioscorea spp. (Mxico).
Histricamente, la produccin de muchas especias, de quina para la extraccin y del opio,
ha sido prerrogativa de determinados pases. En la actualidad, la localizacin del cultivo
de las adormideras en el mundo est dirigida, tanto por consideraciones polticas, como
por un sentido comn econmico.
CULTIVO DE CELULAS
Como consecuencia de lo dicho, no es sorprendente que la industria haya tomado claro
inters en las posibilidades comerciales del cultivo de determinadas especies de clulas
vegetales, bajo condiciones anlogas a las de produccin de antibiticos, que pueden dar
como resultado la obtencin de medicamentos biolgicos. Mediante este sistema, la
produccin puede ajustarse a la demanda en todo tiempo y asegurar un producto de
calidad constante. La shikonina, colorante y antibacteriano, se produce comercialmente
por cultivo de clulas de Lithospermum y est en vas de desarrollo la produccin de
ginsenosidos y de alcaloides antitumorales de Catharanthus roseus; tambin existen
patentes japonesas de fabricacin de alcaloides tropanicos mediante cultivo de tejidos
de Duboisia. Durante los ltimos cinco aos han tenido lugar una enorme cantidad de
investigaciones en este campo, pero an perduran numerosos problemas. Staba, que es
un pionero en la investigacin del cultivo de clulas de plantas medicinales, ha
establecido (J Nat. Prod., 1985, 48, 203) que razonablemente, hay tantas losas como
hitos en el camino del desarrollo de sistemas de cultivo de tejidos, para produccin de
metabolitos secundarios. Por supuesto, en todo caso, como ha puntualizado
Fowler (Chem. and Ind., 1981, 229), por, muy elegante que sea la ciencia, el criterio
fundamental ha de ser la comparacin del precio respecto a la utilidad, hecho que ha sido
obviado claramente por los acontecimientos subsiguientes.
Pese a lo dicho, las tcnicas de cultivo de plantas medicinales se han revelado como una
inapreciable ayuda en otros campos de la Fotoqumica, principalmente en estudios
biogenticos y enzimticos, como fuente para el aislamiento de metabolitos secundarios,
para estudios genticos y, comercialmente, para la rpida propagacion de cepas de alto
rendimiento de plantas medicinales. Estos aspectos son abordados en este libro, bajo los
oportunos enunciados.
CULTIVO DE CELULAS VEGETALES
Aunque la posibilidad del cultivo artificial de clulas vegetales fue descubierta a principios
de siglo y White haba ya propagado races de tomate, aisladas durante periodos de ms
de treinta aos, las modernas consecuciones en el cultivo de clulas de plantas
superiores como callus o como suspensin de cultivo lquido, no comenzaron realmente
hasta hace pocas dcadas. En relacin con esto, es digna de mencin la publicacin de
P. R. White, Cultivation of Plant and Animal Cell en 1954 y el trabajo experimental de H.
E. Street.
El cultivo de clulas aisladas que crecen bajo condiciones controladas en medio liquido o
los cultivos de callus ( callo), consistentes en el desarrollo de masas, indiferenciadas de
clulas sobre un medio semi-solido, puede iniciarse a partir de tejidos parenquimatosos
de tallos, races y otras estructuras vegetales (vase Fig. 20). El mantenimiento de estos
cultivos depende de un adecuado suministro de nutrientes, as como de factores de
crecimiento y de un medio de esterilidad controlada.. Las clulas, aunque no
diferenciadas, contienen toda la informacin gentica presente en la planta normal.
Mediante una adecuada manipulacin del contenido hormonal del medio, es posible iniciar
el desarrollo de races, tallos y plantas completas a partir del cultivo celular de callus
(vase Fig. 35) y promover la divisin celular en un cultivo en suspensin.
Se utilizan comnmente diversas formas de cultivos en suspensin:
Cultivos en suspensin intermitente. En esta tcnica, las clulas se multiplican en un
medio lquido, que es agitado continuamente para romper algunos agregados celulares.
Excepto para la circulacin de aire, el sistema est cerrado en lo que respecta a adiciones
o sustracciones del, lquido de cultivo. Es tpico en este sistema que la inoculacin de
clulas al medio vaya seguida por un periodo de escasa actividad y despus, tras el
crecimiento de la masa, las clulas alcanzan un periodo de crecimiento y divisin
exponencial. Finalmente, se llega a una fase de crecimiento estacionario en el que,
probablemente, se ha agotado algn componente del medio, esencial para el crecimiento.
El crecimiento puede recomenzar cuando las clulas son transferidas a un medio reciente
o cuando se aaden nuevas cantidades del medio al cultivo original.
Cultivos semi-continuos. En este caso, el sistema es abierto y est definido por una
peridica eliminacin del cultivo y adicin del medio reciente, sistema por el cual el
crecimiento del cultivo se mantiene continuamente.
Cultivos continuos. Dos formas de este sistema abierto son la quimiostatica y la
turbostatica, en las que el volumen del cultivo permanece constante y, tanto el medio
reciente, como el propio cultivo son, respectivamente, aadidos y separados de forma
continua. El carcter esencial de estos dos sistemas es que la proliferacin celular tiene
lugar bajo condiciones constantes. En el sistema quimiostatico se consigue una situacin
constante mediante adicin del medio en el que se ha ajustado un determinado nutriente
para que sea un limitador de crecimiento. Esto contrasta con el mtodo de cultivo
intermitente en suspensin, en el que las condiciones son transitorias, con lo que las
clulas producen por si mismas continuos cambios en su propio crecimiento y
metabolismo.

Los problemas que conlleva el cultivo de clulas vegetales no son completamente
idnticos a los que rodean a la fermentacin de microorganismos y hongos. En los
cultivos de clulas vegetales pueden formarse grandes agregados celulares, los cuales se
encuentran entonces bajo diferentes condiciones ambientales que las de las clulas
suspendidas. La dispersin de los agregados mediante el empleo de los usuales
fermentadores con hlices o paletas es demasiado enrgica y da lugar a la ruptura de las
clulas, por lo que estn siendo continuamente estudiados distintos sistemas de
circulacin. Al aumentar las masas celulares producidas el cultivo de clulas en
suspensin puede resultar muy denso y ello presenta problemas de aireacin.
La mayora de los estudios-piloto han utilizado fermentadores de 5-15 litros de capacidad
y el incremento de las dimensiones hasta 20.000 litros en Alemania Occidental y Japn
presenta problemas de ingeniera de considerable complejidad.
PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS
La informacin gentica requerida para la manufactura de metabolitos secundarios est
tambin presente en las clulas indiferenciadas de las especies en cuestin y, cuando son
activados, darn lugar a la produccin de estos principios. Este aspecto del cultivo de
clulas ha despertado mucho inters, debido al deseo de producir el crecimiento de
determinadas clulas vegetales a escala comercial para la produccin de metabolitos
apreciados.
Pionero en el cultivo de clulas de plantas medicinales es E. J. Staba, de la Universidad
de Minnesota, siendo este grupo el primero en demostrar que muchas plantas
medicinales pueden producir sus metabolitos secundarios en cultivos de clulas, aunque,
por lo general, a bajo rendimiento. En efecto, una de las principales influencias del retraso
en la explotacin comercial de la tcnica ha sido el bajo rendimiento de los productos
teraputicamente utilizables, por medio del cultivo, en comparacin con el que se obtiene
en el cultivo normal de las plantas. Mediante el intenso estudio de los medios nutrientes y
la laboriosa seleccin de razas de alto rendimiento, a lo largo de varios aos, los
investigadores han conseguido actualmente, en algunos casos, rendimientos que,
expresados en tanto por ciento de peso seco de masa celular, son de cinco a diez veces
mayores que el rendimiento conseguido a partir de la propia planta. Resultados
prometedores, a este respecto, han sido obtenidos en la produccin de heterpsidos
radioactivos, antraquinonas, algunos esteroides como los ginsenosidos y alcaloides
diversos. Para la seleccin de cepas de elevado rendimiento (quiz contadas plantas en
varios millares), Weiler y Zenk aplicaron el empleo de radioinmunoensayo (q.v.), que est
en vas de constituir un importante medio de trabajo.
A veces aparecen, en los cultivos, compuestos no detectados en la planta original; as,
una nueva cumarina, la rutacultina, ha sido aislada de cultivos celulares en suspensin
de Ruta graveolens; se han caracterizado dos nuevas chalconas en cultivos estticos
(callus) de Glycyrrhiza echinata; nuevos alcaloides menores y antraquinonas
de Cinchona ledgeriana y C pubescens y alcaloidestropanicos en cultivos en suspensin
de clulas de raz de belladona, que no se haban obtenido anteriormente en plantas
originales. Otras plantas producen en cultivos de estos tipos un espectro de metabolitos
secundarios, distintos de los hallados en la planta intacta. Con cultivos de Catharanthus
roseus, por ejemplo, recientes investigaciones se han orientado a la produccin de los
alcaloides dimeros vinblastina y vincristina (q.v.), importantes compuestos anticancerosos.
Los alcaloides se producen al final de una compleja secuencia biogentica en la que son
producidos primeramente los monmeros. Estos ltimos, entre ellos los del tipo
corinantina, estricnina y aspidospermina, pueden ser todos producidos (0,1-1,5 %) en
cultivos que emplean el medio de Zenk para la produccin de alcaloides. Cultivos diversos
de clulas, derivados de cada especie vegetal, pueden variar enormemente en sus
capacidades de sntesis, de tal forma que, en el caso anterior, son posibles cepas
productoras de elevada proporcin de ajmalicina y de serpentina.
Con frecuencia, como se ha observado en Dioscorea deltoidea, por ejemplo, clulas de
rpida divisin, producen escasa o nula cantidad de metabolitos secundarios, siendo
necesario un paso del medio de crecimiento al medio de produccin, para que se efectu
la necesaria biosntesis. Tambin pueden afectar al metabolismo variaciones en el relativo
contenido hormonal del medio de crecimiento; as, Morris (Planta Afed., 1986, 121), da
cuenta de que, concentraciones reducidas de 2,4-D *, incrementan la formacin de
alcaloides en cultivos de Catharanthus roseus y, por su parte, Rhodes et al.
(Planta Med., 1986, 220, 226) hallaron un incremento del quntuple de contenido en
alcaloides, en un cultivo de Cinchona ledgeriana, cuando las clulas son transferidas de
un medio con 2,4-D, benziladenina a otro que contiene IAA ** y zeatin-ribosido. Para
informacin sobre hormonas vegetales, ver Capitulo 11.
Aunque mediante el cultivo de clulas en el laboratorio se ha logrado la produccin de
alcaloides con satisfactorios resultados, de un considerable nmero de plantas
medicinales, se ha experimentado, en cambio, un fracaso en cuanto a la obtencin de
quinina y quinidina de cultivos de Cinchona, as como morfina y codeina en los
de Papaver; no obstante, en ambos casos se han formado otros alcaloides. Hasta cierto
punto, los problemas anteriores van siendo superados, mediante el empleo de races
transformadas (vase ms adelante) y, en el caso de la biosntesis de morfina, parece
que puede ser responsable la falta de desarrollo de laticferos en el cultivo de clulas no
organizadas. En similar circunstancia, referido a cultivos de algunas plantas productoras
de esencias, el rendimiento sufre una severa limitacin, probablemente debida a la
ausencia de estructuras de almacenamiento, como glndulas, conductos y tricomas.
Banthorpe et al. (Phytochemistry,1986, 25, 2321) han demostrado que, en Rosa
damascena, los cultivos en suspensin y callus, apenas contenan monoterpenos, pese a
que, del aparentemente inactivo callus podan ser extradas enzimas de alta actividad
para la conversin de mevalonato e IPP en geraniol y nerol (ver Capitulo 22). Esto es
corroborado por Lappin et al. (Phytochemistry, 1987, 26, 995), quienes encontraron que,
cuando se aadan a cultivos de Lavandula augustifolia, los aldehidos monoterpenoides
geranial, neral y citronelal, eran reducidos a sus correspondientes alcoholes geraniol,
nerol y citronelol, los cuales, una vez formados, desaparecan de los cultivos al cabo de
unas 15 horas.
Se ha observado que el origen (tallo, raz, etc.) del callus, puede jugar un importante
papel en la determinacin de la bioqumica del subsiguiente cultivo. Es tambin un hecho
bien conocido que, en el seno de un cultivo, tienen lugar cambios en las caractersticas
genticas de las clulas, de forma que el callus seleccionado por sus especificas
propiedades bioqumicas, puede requerir una re-seleccin, transcurrido un periodo de
tiempo. En pocos casos, como es la formacin de antraquinonas, puede realizarse la
seleccin basndose en reacciones coloreadas pero, por lo general, son necesarios
ensayos como el RIE *.
Tambin pueden tener lugar grandes cambios en el nmero de las clulas cultivadas. As,
Tabata y sus colaboradores advirtieron (Phytochemistry, 1974, 13, 1671) que con un
especial cultivo en suspensin de clulas de Datura innoxia haba un nivel de 32 % de
clulas diploides y la mayor parte de remanente de nivel tetraploide, comprendidas en
cuanto a su constitucin entre 4n-5 a 4n -+- 3 (vase Capitulo 10, en lo referente a tipos
extracromosmicos). Otra cepa no contena clulas diploides, sino clulas con 46 y
44 cromosomas en las proporciones de 79 y 21 %, respectivamente. No obstante, en lo
que se refiere a produccin de alcaloides, Kibler y Neumann (Planta med, 1979, 35, 354)
encontraron que los cultivos de suspensin de clulas de D. innoxia no mostraron
diferencias en cuanto a produccin de alcaloides tropanicos (cf. hojas de plantas 1n y 2n;
Tabla 3), pero en clones de cultivos de clulas, derivados de protoplastos en Hyoscyamus
muticus, Oksman-Candentey et al. (Planta mdica, 1986, 6) encontraron que cultivos de
plantas 1 n eran ms ricos en hioscina o escopolamina, que los de plantas 2n.
Dado que son ya tantas las plantas medicinales que en la actualidad han sido sometidas a
experiencias de cultivo de tejidos, se incluirn ejemplos pertinentes en sus respectivas
monografas, en la Parte Seis.
METABOLISMO SECUNDARIO INDUCIDO EN CULTIVO DE CELULAS
Aunque las clulas no diferenciadas de un cultivo en suspensin de una planta son
generalmente totipotentes, es decir, que poseen la estructura gentica completa de la
planta total, muchos genes, incluidos los implicados en el metabolismo secundario, son
reprimidos, con la consecuencia de que los rendimientos en los principios deseados en
tales cultivos, son decepcionantemente bajos. No obstante, viene resultando cada vez
ms claro que un gran nmero de metabolitos secundarios pertenece a una clase de
sustancias denominadas fitoalexinas. Se trata de unos productos relacionados con
situaciones de estrs, elaborados normalmente por la planta como respuesta a estmulos
perniciosos producidos por factores fsicos, qumicos o microbiolgicos. Cuando los
cultivos de clulas son sometidos a tales inductores, algunos genes son, por as decir, des
reprimidos, dando como resultado, entre otras cosas, la formacin de metabolitos
secundarios que se encuentran en la planta entera. La tcnica est siendo cada vez ms
utilizada en estudios de cultivos celulares y en la Tabla 1 se renen ejemplos de una serie
de inductores.
CONVERSIONES BIOQUIMICAS MEDIANTE CULTIVOS DE CELULAS VEGETALES
Hasta cierto punto, en la misma forma que puede efectuarse la modificacin de un
sustrato determinado, mediante fermentacin microbiana (ver Capitulo 23), puede tambin
emplearse con el mismo fin los cultivos en suspensin de plantas.
La capacidad de los cultivos celulares de Digitalis lanata para efectuar glucosilaciones,
hidroxilaciones y acetilaciones es de una posible significacin comercial. Reinhard y
colaboradores demostraron que su cultivo celular, con cepa 291, cultivado en
bio-reactores con aire forzado, es particularmente eficaz en la conversin de b-
metildigitoxina en b-metildigoxina (hidroxilacion en 12 b). La explotacin comercial de este
proceso hara posible utilizar los considerables depsitos de digitoxina que se acumulan
como subproducto en la manufactura de digoxina a partir de D. lanata. Ms
recientemente, Stricker (Planta Med., 1986, 418) da cuenta de una alta eficacia en la
hidroxilacion de la propia digitoxina, utilizando suspensiones de clulas de D. lanata en un
proceso que se realiza en dos fases, la primera de ellas consistente en la proliferacin de
clulas en un medio de crecimiento y la segunda, en el trasvase a un adecuado medio de
produccin.
Tabla 1. Produccin inducida de metabolitos en cultivos de clulas, por diversos
inductores

Inductor
Cultivo en
suspensin
Efecto
de clulas vegetales

Luz muy intensa

Coffea arabica
Estimulacion de
produccin de

Cafena.

Colchicina Valeriana wallichi
Incremento del
sextuplo en

valepotriatos con seis
nuevos

compuestos (no
debido a mayor

Nivel de ploidaa).

Sulfato de cobre Lithospermum
Gran incremento de
produccin de

erythrorhizon

shikonina.

Tiosemicarbazida Panax ginseng
Promueve la biosintesis
de

saponinas e inhibe la
produccin

de fitosterol.

L-Triptofano
(precursor
Cinchona
pubescens
Aumento de la
produccin de
de biosntesis de

C. ledgeriana

alcaloides.
alcaloides quinolei-
nicos


Preparacin de Planta de tabaco
Acumulacin de
capsidiol.
Phythophtora

megasperma


Conidios no viables
del
Gossypium
arboreum
Incremento
centuplicado en
hongo del

gosipol, tras 120 h de
incubacin.
marchitamiento

Verticillium dahliae


Conidios no viables
del
Cephalotaxus
harringtonia
Enorme incremento del
contenido
hongo del

de alcaloides.
marchitamiento

Verticillium dahliae


Preparacin de Thalictrum rugosum
Incremento de ms del
cudruple
carbohidrato de

de berberina.
levadura


Levaduras (libres e Ruta graveolens
Incremento de
produccin de
inmovilizadas)

epoxidos de acridona,
pero no

rutacridona.

Phytophthora Cinchona ledgeriana
Incremento de
produccin de
cinnamomi y
Aspergillus

antraquinonas.
niger (micelios

esterilizados)


Con cultivos celulares, tanto de Digitalis lanata como de Thevetia neriifolia, han sido
biosintetizados nuevos cardenolidos a partir de precursores aadidos. Ciertos cultivos de
clulas en suspensin de D. purpurea y de zanahoria, pueden convertir la digitoxigenina
en periplogenina (5b -hidroxilacion); Jones y Velicky, mediante cultivos de zanahoria
lograron una bio-oxidacin de la gitoxigenina (Tabla 39) al nuevo compuesto
5b-hidroxigitoxigenina. Cultivos en suspensin de clulas de Strophanthus gratus, realizan
diversas conversiones de digitoxigenina (Furuya et al.,Phytochemistry, 1988, 27, 2147).
Se han demostrado bioconversiones de monoterpenos con lneas de clulas
de Mentha capaces de transformar la pulegona en isomentona y la (-)-mentona en
(+)-neomentol. Cultivos en suspensin de Cannabis sativa son capaces de convertir el
cannabidiol (pg. 747) en cannabielsoina y cultivos de la especie no
alcaloidica Silene alba, efectua con gran selectividad, desmetilaciones de papaverina.
La ruda (Ruta graveolens) y sus cultivos de tejidos normales contienen cierto nmero de
componentes, entre los que se incluyen furanocumarinas, derivadas de 7-hidroxicumarina
(Fig. 21, serie A). Steck y Constabel (Lloydia, 1974), mostraron que dos molculas
qumicas mimticas del precursor de la 7-hidroxicumarina, que son derivados 4-metil y
8-metil, dan lugar, cuando se siembran. en el cultivo celular de Ruta, a diversos
correspondientes anlogos no naturales (Fig. 21, series B y C).

Se ha demostrado la existencia de muchas otras transformaciones bioqumicas mediante
cultivos de clulas, entre ellas epoxidaciones, esterificacion y saponificacin,
glucosilacion, hidroxilacion, isomerizacin, metilacin y desmetilacion y oxidacin.
Para que esta tcnica sea viable comercialmente, el producto a obtener ha de ser lo
suficientemente importante, el sustrato de fcil disposicin en las cantidades convenientes
y la reaccin no ha de ser de las que se realizan ms fcilmente mediante
microorganismos o por medios qumicos.
CELULAS VEGETALES INMOVILIZADAS
Una reciente innovacin es el empleo de clulas vegetales inmovilizadas, del mismo
modo que los enzimas inmovilizados, para efectuar reacciones qumicamente difciles.
Reinhard y colaboradores (Planta Med., 1980, 40, 218) han dado cuenta de la
inmovilizacin de clulas de Digitalis lanata, suspendindolas en una disolucin de
alginato sdico, precipitacin del alginato y las clulas retenidas, con solucin de cloruro
clcico, divisin del producto en forma de pldoras, dejndolo despus endurecer. Los
grnulos catalizaron la conversin de digitoxina a purpurea-glucsido A (formula en
pg. 522) e hidroxilaron la b-metildigitoxina dando b-metildigoxina. Aunque la actividad
hidroxilante de las clulas atrapadas fue, aproximadamente, la mitad de las clulas en
suspensin, las pldoras poseen la ventaja de que la biocatalisis es reutilizable durante
periodos que se extienden a ms de sesenta das. Otros investigadores dan cuenta de la
transformacin de codeinona a codena mediante clulas inmovilizadas
de Papaver somniferum. Se ha utilizado glioxal de enlaces cruzados
poliacrilamida-hidrazida, como agente inmovilizante para clulas de Mentha que efectua
las reducciones mencionadas de monoterpenos; la tcnica ha sido posteriormente
desarrollada por detencin de la divisin celular no deseada de las clulas retenidas
mediante irradiacin gamma.
CULTIVO DE ORGANOS
De la misma forma que es posible cultivar clulas vegetales indiferenciadas pueden
tambin mantenerse cultivos aspticos en suspensin, de hojas y races. Los rganos
pueden obtenerse mediante cultivos, bien por diferenciacin de tejidos de callus mediante
adecuada manipulacin hormonal (Fig. 35) o bien por el uso de races esterilizadas o de
zonas de crecimiento de las plantas enteras o por semillas. Es frecuente que estos
rganos cultivados sean capaces de sintetizar metabolitos secundarios que o no existen o
existen en bajo rendimiento en las clulas de cultivo normal. As, la produccin de
cardenolidos en cultivos de Digitalis lanata y D. purpurea se incrementa a medida que
aumenta la diferenciacin tisular. Referente al cultivo de callus de Solanceas productoras
de alcaloides tropanicos, cabe decir que tiene lugar un incremento de los alcaloides al
desarrollarse las races de dichos cultivos de callus. En contraste con lo anterior, en que
la diferenciacin de la hoja solo produce pequea cantidad de alcaloides, los cultivos de
rgano, de hoja de Catharanthus roseus y de Rauwofia serpentina sintetizan una
diversidad de alcaloides. Recientemente, se han detectado alcaloides dimeros en cultivos
de rganos de C. roseus, lo que sugiere la posibilidad de un eficaz sistema de produccin
para estos apreciados alcaloides. Los dimeros se encuentran tan solo en los cultivos que
tambin contienen vindolina y catarantina (Endo et al, Planta. Med., 1987, 54, 479). Zito y
Staba (Planta Med., 1982, 45, 53) encontraron que, mientras que los cultivos en
suspensin de clulas de Papaver bracteatum producian orientalidina y sanguinarina, los
cultivos de raz y tallo producen tebaina. Anderson et al., (Planta Med., 1982,46, 25;
J. Pharm. Pharmacol., 1982, 34, 45P) han observado la produccin de los cuatro
alcaloides quinoleinicos mayores en la hoja, en la raz y en cultivos en suspensin de raz
de Cinchona ledgeriana; adems, los cultivos de raz contenan quinina y quinidina como
alcaloides predominantes, que no haban sido encontrados en cultivos de clulas
indiferenciadas.
Cultivo de Raz Pelosa. Recientemente, se ha demostrado que ciertas bacterias del
suelo, del genero Agrobacterium dan lugar a una transformacin de las clulas vegetales
por introduccin en su genoma t-DNA de un plasmidio bacteriano. Estas races
transformadas, producidas por inoculacin a la planta hospedadora, cuando crecen en un
medio desprovisto de hormonas, dan lugar a un copioso nmero de races que se
denominan races pelosas. Cuando se elimina el Agrobacterium, las races continan
desarrollndose profusamente (Fig. 22). Para algunas plantas que normalmente producen
metabolitos secundarios, se ha observado que las races pelosas acumulan estos
metabolitos en cantidades comparables a las halladas en la planta normal intacta. As
Robins, Rhodes y colaboradores (Plant Cell Rep., 1986, 5; 111; Planta Med., 1987, 53,
474) han encontrado que este es el caso respecto a los pigmentos betalainicos, alcaloides
nicotinicos e hiosciamina en las races pelosas de Beta vulgaris, Nicotiana
rustica y Datura stramonium, respectivamente. En cada caso las races fueron
transformadas con Agrobacterium rhizogenes y cultivadassin fitohormonas. Para
D. stramonium la masa de clulas se incrementa 55 veces durante 28 das de incubacin,
lo que representa un incremento en la velocidad de desarrollo 15 veces mayor que el que
tiene lugar en cultivos celulares normales. Kamada et al. (Plant. Cell Rep., 1986, 5, 239)
refieren resultados similares en Atropa belladonna. En el caso de las races pelosas
de Cinchonaledgeriana, transformadas con Agrobacterium tumefaciens la produccin de
alcaloides quinoleinicos fue comparable a la que tiene lugar en la planta intacta.

PROPAGACION CLONAL
Hemos indicado antes (Fig. 20) que, mediante ajuste de los reguladores del crecimiento
de la planta en el medio de cultivo de clulas, es posible promover la diferenciacin de
rganos a partir de tejidos de callo y orientar este hecho hacia la produccin de plantas
enteras (Fig. 35). Como todas las clulas del callo derivan de un mismo meristemo, todas
las plantas regeneradas habrn de ser genticamente idnticas. Este hecho tiene obvias
implicaciones comerciales respecto a la produccin, en un corto periodo de tiempo, de
cosechas uniformes, derivadas de un pequeo nmero (o eventualmente un solo
individuo) de las plantas deseadas.
En la prctica pueden ocurrir cambios genticos en las clulas durante su cultivo artificial,
siendo necesaria una cuidadosa regulacin del medio. Sin embargo, se ha demostrado, al
menos para la Datura innoxia que, por diferenciacin, son las plantas normales 2n,
distintas de los tipos cromosmicos anormales, las que son favorecidas.
Las aplicaciones prcticas del proceso a gran escala se presentaron en el Simposio de
Knoxville, Tennessee, 1980, donde, en relacin al inters farmacutico, L. W. Levy (Env.
Expl. Bot., 1981,21, 389) informo de que, en Ecuador, se ha aplicado a gran escala
comercial el cultivo in vitro de la propagacion de clones de plantas de pelitre. La escala
del problema es evidente en cuanto a su objetivo original, que era el de producir, a partir
de 57 clones superiores seleccionados, aislados durante un periodo de investigacin de
diez aos, hasta 1976, doce millones de plantas por ao, para alcanzar un nivel de
plantacin suficiente para cubrir 10.000 Ha de campo durante cuatro aos. Ello requiere
cuatro periodos; 1, iniciacin del cultivo; 2, subcultivo para la multiplicacin de los brotes
(Fig. 23, A); 3, enraizado de las plntulas (Fig. 23, B); 4, endurecimiento (Fig. 23, C), para
el trasplante al campo. Mediante el .empleo de un sistema de turnos de 24 h, para la
manipulacin de los cultivos, al cabo de unos ocho meses la operacin alcanzo el nivel de
produccin previsto de 62.000 plantas por mes. Cada tanda de 62.000 plantas se llevaba
a una granja de propagacion, a una altitud considerablemente inferior a la de las granjas
comerciales finales, permaneciendo en riego de cuatro a seis meses. Durante este
tiempo, las plantas jvenes alcanzan un rpido desarrollo vegetativo y son adecuadas
para una propagacion vegetativa final, que incrementa su nmero en 15 veces, para dar
las 930.000 plantas requeridas por mes.
El ritmo de desarrollo del nmero de plantas jvenes para el trasplante a la granja
comercial es crucial, debido a que en los Andes ecuatorianos la estacin de siembra est
restringida a los noventa das comprendidos entre octubre y diciembre, durante los cuales
las condiciones atmosfricas son adecuadas. En consecuencia, los resultados
beneficiosos globales de la propagacion en cultivo de tejidos para la industria del pelitre
en el Ecuador son: a) posibilidad de introducir cepas seleccionadas de alto rendimiento a
escala comercial en corto tiempo; b) creacin de caractersticas de crecimiento
mejoradas; c) mayor facilidad del planeamiento de la plantacin. Una tcnica similar fue
puesta a punto para la produccin comercial de Datura sangunea, la mayor fuente de
hioscina (escopolamina).
La propagacion clonar es un mtodo de valor potencial para produccin de razas de alto
rendimiento, en especies que tienden a ser variables cuando se reproducen a partir de
semillas. As el hinojo (Foeniculum vulgare), por ejemplo, es genticamente heterocigotico
y produce amplias variaciones, tanto en el rendimiento de esencia, como en su
composicin. Miura, et al. (Planta Med., 1987, 53, 92) han realizado un ensayo de dos
aos, respecto a la produccin de plantas de uniformidad clonar, derivadas de embrides
somticos de progenitores adecuados.

En las plantas normales, propagadas sexualmente, el contenido en anetol de sus frutos
vario de 0 a 12,9(media 2,82 %), mientras que en las plantas clnales la distribucin
fluctu entre lmites ms cercanos: 0,7-3,0 (media 1,92 %).
El mtodo ha sido tambin sugerido para aplicarlo a una larga conservacin de genotipos
valiosos de Digitalis lanata (Schner y Reinhard, Planta Med., 1986, 478) y para la
propagacion de Vanilla planifolia (J. Plant Physiol., 1986, 122, 211).
BIBLIOGRAFIA
Anderson, L. A., Phillipson, J. D., y Roberts, M. F. (1985). Biosynthesis of secondary products by cell
cultures of higher plants. In Advances in Biochemical Engineering, ed. A. Fiechter. Vol. 31. Berlin:
Springer-Verlag.
Fowler, M. W. (1980). New approaches to plants as sources of medicinal compounds. Pharm.
J., pg. 39.
Morris, P., Scragg, A. H., Stafford, A. y Fowler, M. W. (Eds.)
(1986). Secondary Metabolism in Plan Cell Cultures. Cambridge: Cambridge University Press.
Staba, E. J. (Ed.) (1980). Plant Tissue Culture as a Surce of Biochemicals. Boca Raton, Flo.: CRC
Press.
Vasil, I. K. (Ed.) (1984). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol.
1, Laboratory Procedures and Their Applications. New York, London: Academic Press.
Webb, C., y Mavituna, F. (1987). Plant and Animal Cells.- Process Possibilities. Chichester: Ellis
Horwood.





* Se refiere a la presencia de un -OH en el C-11 del anillo C. Recurdese que los corticosteroide
activos estn oxigenados en dicha posicin.(N. del t.)
* 2,4-Dicloro-fenoxiactico. (N. del t.)
** Acido Indol Actico. (N. del t.).
* Radio-Inmuno-Ensayo. RIA en el original, de Radio-Inmuno-Assay. (N. del t.)