SUPUESTO PRACTICO A DESARROLLAR

SOBRE MICROBIOLOGIA

PREGUNTA SUPUESTO 1.


1. Explique brevemente la caractersticas de una pared de una bacteria Gram
+ o Gram

Gram positivas son clulas con una gruesa pared celular de peptidoglicano.
Ests clulas poseen una membrana citoplasmtica con fosfolpidos y protenas. Por fuera de la
membrana citoplamtica se encuentra la pared celular que est compuesta por una ancha capa
de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolcula gigante formada por cadenas de
un dmero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico. A su vez, estas cadenas se
encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que
se entrecruzan. Estos puentes peptdicos son caractersticos de las distintas bacterias y
presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento.
El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula
estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el
movimiento de enzimas catalticas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula.
La pared celular Gram positiva tambin contien cidos teicoicos y cidos lipoteicoicos. Los cidos
teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodisteres, y estn unidos
covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodister en el oxihidrilo del C6 del N-
acetilmurmico. Los cidos lipoteicoicos son polmeros de glicerofosfato se encuentran anclados
en la membrana citoplasmtica y no estn unidos al peptidoglicano. La funcin de estos
compuestos sera estructural, pero existen evidencias que indican que tambin participaran en la
regulacin de las enzimas hidrolticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que seran
sitios de fijacin de fagos.

Gram negativas son clulas con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura
denominada membrana externa.
Las clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por una bicapa
fosfolipdica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de
peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la
membrana externa por medio de porciones lipoflicas. Entre la membrana citoplasmtica y la
membrana externa queda delimitado el espacio periplsmico. Este espacio es ocupado por el
periplasma que es una matriz isotnica respecto al citoplasma, isotonicidad que es mantenida
mediante los oligosacridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes
catalticos de suma importancia para la viabilidad celular.La membrana externa tiene una
estructura de bicapa asimtrica en donde la cara externa esta compuesta por el lipopolisacarido
(LPS) y la cara interna por fosfolpidos.

Adems, esta membrana es rica en protenas, algunas de las cuales se denominan porinas.
La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como
antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS est
formado por tres regiones: el polisacrido O (Antgeno O), el polisacrido del centro (KDO) y
el lpido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la clula
una efectiva proteccin contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a
la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la clula evadir la
fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune especfica por
alteracin de la superficie antignica y adherirse a ciertas clulas del hospedador.
Las porinas son poros o canales proteicos no especficos que pueden ser atravesados por
pequeas molculas hidroflicas. En la membrana externa se encuentran otras protenas que
funcionan como canales de difusin especficos y facilitan el paso de di, tri y oligosacridos.
2 Defina estos conceptos: Aerobios obligados, anaerobios obligados,anaerobios
facultativos, anaerobios aerotolerantes, microaerofilos.

Basados en los requerimientos de oxgeno molecular las bacterias se pueden dividir en 5 grupos:
Aerobios obligados: requieren oxgeno para el crecimiento pues dependen de este
elemento para cubrir sus necesidades energticas. El oxgeno es el aceptor final de
electrones en la cadena respiratoria.
Anaerobios obligados: crecen en ausencia total de oxgeno porque necesitan un medio
muy reductor. Utilizan respiracin anaerobia donde los aceptores finales de electrones
pueden ser generalmente SO
4
2-
, Fumarato
2-
o CO
3
2-
.


Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno. Utilizan al
oxgeno como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria cuando est
disponible, y en ausencia de oxgeno la energa la obtienen por fermentacin o respiracin
anaerobia (generalmente el NO
3-
es un aceptor final de electrones en las enterobacterias).



Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno, pero la
energa la obtienen por fermentacin.
Microaerofilos: slo pueden crecer con bajas tensiones de oxgeno porque las altas tensiones
son txicas para este tipo de microrganismos (1 a 12% de O
2
en la fase gaseosa). La energa la
obtienen por respiracin aerbica, cuando no hay aceptores electrnicos terminales alternativos,
o anaerbica.



3 Qu significan las fases 1 2 3 4 y sealadas en el
siguiente esquema?



Un cultivo bacteriano simple y homogneo tiene un ciclo de crecimiento como el que se
representa anteriormente.Este ciclo tiene una morfologa y una divisin de clulas
asincrnica. Se divide en cuatro fases:
Fase de Latencia: Es la fase de adaptacin al medio, existe aumento de la masa
celular pero no hay aumento en el nmero de clulas.
Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento
exponencial del nmero de microorganismos.
Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de
energa.
Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminucin exponencial del
nmero de microorganismos.
La fase de latencia puede ser inducida por un rpido cambio en las condiciones del cultivo.
En un medio fresco, el largo de la fase de latencia va a depender del tamao del inculo, de
la edad del inculo, y de los cambios en la composicin y concentracin de los nutrientes
que experimenten las clulas.
Un pequeo volumen de inculo transferido a un gran volumen de medio fresco va a
producir una salida por difusin de iones, vitaminas y cofactores que son indispensables
para la actividad de muchas enzimas intracelulares. Si las clulas provenientes de un medio
rico son inoculadas en un medio mnimo, el tiempo de latencia puede estar afectado por el
tamao del inculo como un resultado de los nutrientes remanentes del medio original.
La edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la
acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la clula
durante el crecimiento anterior.En general, inculos viejos alargan la fase de latencia.
Cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre el cultivo del inculo y el
medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin de la actividad enzimtica
dentro de las clulas o la diferenciacin morfolgica, como la formacin de esporas. Si las
clulas son transferidas de un medio simple a un medio rico, se van a necesitar ms tiempo
y nutrientes para incrementar la concentracin de enzimas necesarias para el metabolismo.
Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento
de la biomasa.

4. Comente las fases de una tincin GIEMSA = igual que 4 segundo
supuesto

PREGUNTA SUPUESTO 2.

1 Por qu se dice que una micobacteria es un bacilo alcohol acido
resistente?
Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener
una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las
Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes
hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los
reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram
positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de
Ziehl-Neelsen (Tincin Acido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin
decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Estos microorganismos una vez
coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan
Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

2 Defina estos cuatro conceptos: Fotoautotrofos ,
Fotoheterotrofos, Quimioautotrofos, Quimioheterotrofos

Fotoautotrofos: dependen de la luz como fuente de energa y utilizan CO
2
como
principal fuente de carbono. Vegetales superiores, bacterias fotosintticas, algas
eucariticas, etc.
Fotoheterotrofos: utilizan luz como fuente de energa y emplean compuestos
orgnicos como fuente de carbono. Algunas bacterias fotosintticas y algas
eucariticas.
Quimioautotrofos: utilizan CO
2
como fuente de carbono y emplean fuentes de
energa qumica proveniente generalmente de compuestos inorgnicos reducidos
(H
2
, S
2-
, NH
4
+
, etc).
Quimioheterotrofos: utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono y
energa. Los compuestos orgnicos tambin se comportan como fuente de
electrones. Este grupo est integrado por animales superiores, hongos, protozoos y
la mayora de las bacterias.

3. Qu es una cmara de Petroff Hausser?


El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes
perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologas.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas
individuales, sto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a
los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un
aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el
nmero total de microorganismos en una muestra:
Recuento microscpico de partculas
Recuento electrnico de partculas
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar
colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto
es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:
Recuento de colonias
Mtodo del nmero ms probable
Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del
crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara
vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema
enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.
Determinacin de peso hmedo
Determinacin de peso seco
Determinacin de nitrgeno total
Determinacin qumica de un cido nucleico
Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los
microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento
de la biomasa.

Recuentos Directos
Recuento microscopico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un
equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos
se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir
de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la
cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio,
incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se
minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o
medios mnimos sin fuente de carbono).



Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene
la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los
recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento
microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos
contados.


Camara de recuento de Petroff-Hausser


Tipo de cuadro
Area
[cm
2
]
Volumen
[ml]
Factor
[1/Volumen]
Cuadrado total 1.00 x 10
-2
2.00 x 10
-5
5.00 x 10
4

Cuadrado grande 4.00 x 10
-4
8.00 x 10
-7
1.25 x 10
6

Cuadrado pequeo 2.50 x 10
-5
5.00 x 10
-8
2.00 x 10
7




1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento.
Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se
utilizaron para contar un el nmero de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo
de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo
tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m =5 x 104 m
3
=5 x 10-8
ml)

Recuento electronico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de
bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos
filamentosos o miceliares.
Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de
un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia
elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es
muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente.





4 Comente las fases de una tincin GIEMSA



El descubrimiento emprico y fortuito hecho por Gram de que la secuencia Violeta de
Genciana-Lugol-Alcohol- Safranina, intercalando breves lavados con agua entre
reactivos, daba como resultado un mtodo de coloracin altamente diferencial para
grmenes constituy y constituye actualmente- uno de los pilares fundamentales de la
Bacteriologa en varios aspectos adems del taxonmico.
La coloracin de Gram tienefundamental importancia en la diferenciacin morfolgica y
taxonomica de las bacterias. Las bacterias se clasifican segn retengan o no el
colorante de base usado en la tincin que es el violeta de genciana o el cristal
violeta.Las bacterias gram+aparecen con el citoplasma teido uniformemente de color
azul o violeta. Las bacterias gram- se tien de rojo por el colorante usado como
contrastador que es la fuchina o la safranina. La diferencia entre unas y otras radica en
la composicin qumica de la pared celular y su permeabilidad. La pared de las gram-
es ms delgada y presenta un contenido lipido diez veces mayor que el de gram+lo
cual dificulta la tincin y la retencin de colorante en el citoplasma.

USO

Coloracin diferencial para bacterias. Para tincin de rickettsias, chlamydias,
protozoos (Plasmodium, Pneumocystis) y ciertos Hongos (Histoplasma), aparte de ser
muy efizaz para diferenciar clulas. Con este mismo fin puede utilizarse la tincin de
WRIGHT (EOSINA). La fijacin del frotis se realiza con metanol durante 5 minutos
para no deteriorar las clulas, una variante de la tcnia de Giemsa emplea como
fijador el reactivo de mAY-GRNWALD_GIEMSA que adems de fijar facilita la
coloracin . Existen muchas moduladidades diferentes de realizar la tcnia. Cmo
dejar colorante 8 minutos lavar con agua destilada y dejar secar al aire.

CARACTERSTICAS

Combinacin estandarizada de colorantes y decolorante
- Violeta Cristal - Solucin de Iodo
- Decolorante - Safranina

Optima definicin: Gram-positivos y Gram-negativos perfectamente diferenciados a
travs de una tcnica estandarizada mediante el empleo de cepas tpicas.






















MODO DE EMPLEO

Usar portaobjetos limpios, desengrasados y secos. Se recomienda lavarlos con
Detergente , enjuagarlos con abundante agua y mantenerlos en alcohol. No usar
portaobjetos hmedos pues alteran notablemente los resultados. Desechar los
portaobjetos rayados y percudidos pues dificultan la observacin.


1- Dejar secar el extendido sobre superficie de la estufa de cultivo o lugar adecuado
2- Fijar al calor, pasando sobre la llama azulada del mechero, rpidamente, por tres
veces, la cara opuesta a la que se extendi el material. Dejar enfriar.
3- Cubrir con Violeta Cristal: dejar actuar 1 minuto. Escurrir.
Lavar con pequeo chorro de agua (3-5 segundos). Escurrir.
4- Cubrir con Solucin de Iodo: dejar actuar 1 minuto. Escurrir.
Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir.
5- Cubrir con Decolorante: dejar actuar entre 30 segundos y 1 minuto. Escurrir.
Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir.
6- Cubrir con Safranina: dejar actuar entre 1 minuto y 1 minuto y medio. Escurrir.
Lavar con pequeo chorro de agua. Escurrir.
7- Secar. Observar con objetivo de inmersin.

(*) Cada vez que se indique la maniobra escurrir, debe interpretarse: derramar el
lquido inclinando el portaobjetos.

IMPORTANTE

- Si se fijan directamente a la llama preparados que no han sido secados previamente,
pueden estallar las clulas y cuerpos bacterianos.
- Lavados excesivos con agua pueden afectar significativamente los resultados.
- No debe interrumpirse la secuencia de pasos en ningn momento.
- A fin de cumplir con el paso anterior, debe asegurarse que los frascos goteros
contengan suficiente cantidad de reactivo antes de iniciar el proceso de tincin