INTRODUCCIN

Durante los ltimos aos, la exploracin bsica de la funcin de los genes ha sido
proporcionada eficientemente por experimentos transgnicos y Knock-out !un"ue el gran
beneficio de esta tecnolog#a para el a$ance de in$estigacin biomdica ha sido
comprobado y en muchos aspectos sus tcnicas se encuentran estandari%adas y bien
documentadas, estos experimentos han mostrado a su $e% serias limitaciones intr#nsecas
a la manipulacin gentica con$encional, sin embargo, las modificaciones reali%adas a
ni$el geonmico a tra$s de mutagnesis de un gen blanco son ampliamente aplicadas en
la in$estigacin cient#fica y las tcnicas utili%adas para este propsito $alen la pena ser
entendidas hasta por el cient#fico o medico ms no$ato &ara explicarlo de una manera
simple, estas tcnicas 'transgnicas y knock-out(, hacen posible el diseo de ratones
carentes de productos deri$ados de un gen seleccionado o "ue exhiben diferentes
propiedades regulatorias del mismo
El concepto
&ara poder entender como se disean y desarrollan los ratones transgnicos y Knock )
out es necesario repasar los conceptos "ue definen a los mismos*
Ratn knock-out
+n ,-ratn knock-out-- 'K.( es un organismo genticamente modificado './0( el cual
carece de la expresin de un gen en particular 1os ratones ko son producto de un ratn
transgnicos o "uimera en el cual el gen insertado no se expresa o es un gen nulo, este
es un modelo para estudiar la accin de un gen particular en la bio"u#mica y fisiolog#a de
un organismo 1os ratones knock-out son muy tiles en el estudio del cncer y otras
enfermedades comple2as
Ratn transgnico
Se refiere a un ratn en el cual material gentico clonado ha sido transferido
simplificado es a!uel !ue posee un gen e"tra#o !ue ha sido insertado
deli$eradamente dentro de su genoma%
Ratn quimera
Este es un ratn !ue consiste en dos o mas tipos celulares genticamente
diferentes & deri'ados de diferentes cigotos% Es un ratn !ue posee clulas &
te(idos con diferente informacin gentica%
GEN BLANCO
Es el gen !ue se !uiere mutar o anular%
Transgen
)en mutado !ue reempla*a al gen $lanco
Vector
Es un agente !ue lle'a un fragmento de +DN al interior de una clula husped% Es
un transportador similar a un 'irus pero !ue no posee cu$ierta proteica & no
se puede mo'er de clula a clula como lo hacen los 'irus%
Transfeccin
Introduccin de material gentico o +DN a una l,nea celular especifica a tra's de
diferentes mtodos como electroporacin & precipitacin con fosfato de calcio
entre otros%
Ratn de a!oratorio
3l ratn de la$oratorio es un roedor, usualmente de la especie Mus musculus, "ue se
utili%a para la in$estigacin cient#fica 4on frecuencia los ratones de laboratorio son
blancos, y algunos son albinos
1os ratones de laboratorio deben pertenecer a una cepa pura o endogmica 1os
indi$iduos de una misma cepa lle$an los mismos genes, por lo cual se facilita la
comparacin de los efectos de los diferentes tratamientos 'frmacos, entorno f#sico, etc(
sin "ue se produ%ca confusin debido a las diferencias genticas
C57BLACK6, abre$iada como 4567189 o black 6 es la cepa endogmica de ratn de
laboratorio ms ampliamente usada para ser manipulada genticamente en el estudio de
las enfermedades humanas 3sta cepa fue la "ue se utili% para el proyecto genoma del
ratn "ue termino en :;;:
1as caracter#sticas "ue han hecho del ratn de laboratorio el modelo biolgico y
biomdico ms utili%ado en las in$estigaciones cient#ficas son*
< =cil mane2o
: >amao apropiado para la crian%a y manipulacin
? @o re"uieren demasiados cuidados
4. >ienen un sistema inmune similar al de los seres humanos
5 >ienen un alto nmero de cr#as
6. &oseen un bre$e per#odo de gestacin '<A-:< d#as( y rpido destete
7. 1as hembras producen un gran nmero de $ulos, los cuales al ser fecundados
son muy resistentes
B !l ser mam#feros euterios, al igual "ue el hombre, tienen un genoma muy similar a
los humanos
3n la actualidad se utili%an ratones "ue se han manipulado genticamente 1os modelos
de ratn transgnico y knock-out son particularmente tiles para estudiar problemas
biolgicos comple2os, ya "ue se puede anali%ar la accin de un gen o una prote#na en
particular
Conte"to gentico # e$outi$o
1os seres humanos y los ratones de laboratorio 'ambos mam#feros euterios( compartieron
un ltimo antepasado comn hace 9; millones de aos aproximadamente 1a e$olucin
del genoma de los mam#feros es relati$amente conser$adora Ci bien los humanos
poseen antepasados comunes con todos los seres $i$os, el hecho "ue los humanos y los
ratones sean mam#feros euterios hace "ue tengan ms genes en comn "ue los "ue se
podr#an encontrar entre los humanos y animales no-euterios
1os ratones tienen su genoma agrupado en :; pares de cromosomas, mientras "ue los
seres humanos tienen :? 1os genomas de los humanos y los ratones de laboratorio son
muy similares, el genoma de los humanos posee :A;; millones de pares de bases
mientras "ue el del ratn contiene alrededor de :9;; millones
3l mapeo gentico ha puesto en e$idencia "ue algunos genes "ue se encuentran en un
mismo cromosoma humano estn ubicados en diferentes cromosomas en los ratones &or
e2emplo, en el cromosoma <: humano se encuentran agrupados los genes /!D&, >&D,
1DE7, KF!C:, D@><, /1< y 1!17, mientras "ue en el ratn estos genes se encuentran
repartidos en los cromosomas 9, <5, <; y G 3stos mismos genes se encuentran en un
mismo cromosoma en los gatos 'cromosoma 7G( y en las $acas 'cromosoma 5(, lo "ue
indica "ue los antepasados de los ratones di$ergieron del lina2e "ue desembocar#a en el
hombre antes "ue los lina2es de los artiodctilos 'grupo al "ue pertenece la $aca( y el de
los carn#$oros 'grupo al "ue pertenece el gato( 3l cromosoma 6 humano posee
homolog#as en siete cromosomas diferentes de 0us musculus 3l cromosoma << del
ratn tiene homolog#as en, al menos, seis cromosomas humanos
:
3l parecido gentico entre las dos especies permite comparar los genes casi
directamente, y permite a los cient#ficos encontrar los mismos genes en humanos para
decodificar las rutas y mecanismos de las enfermedades humanas, por"ue los ratones
tambin pueden desarrollarlas &or e2emplo, la mutacin murina relacionada con la
obesidad ',0agohany-( es homloga al gen attractrin, el cual guarda informacin para
hacer una glicoprote#na y "ue se relaciona con la obesidad en los seres humanos
>ambin es posible inducirles a los ratones un gran nmero de enfermedades humanas
manipulando sus genes por medio de tcnicas de ingenier#a gentica Colo de esta
manera se pueden hacer in$estigaciones ms fiables, puesto "ue la in$estigacin con
humanos estar#a por fuera de las normas bioticas
Estrategia
&ara poder crear un ratn knock-out y para poder apuntar a un gen de inters particular
',blanco-( se pueden reali%ar dos procesos diferentes* 3n una de los procesos de la
creacin de ratones knock-out o transgnicos, es necesaria la construccin de un $ector
'transportador( "ue lle$e en si un marcador con secuencias flan"ueadoras homologas al
!D@ genmico del gran blanco &osteriormente este $ector se introduce a una l#nea
celular embrionaria mediante el mtodo de transfeccion 1a secuencia homologa "ue lle$a
el $ector facilita su insercin dirigida al genoma del husped y es as# como el gen
introducido reempla%a al gen con la secuencia original en un proceso denominado
recombinacin homologa 1as clulas embrionarias "ue hayan sido exitosamente
mutadas en el gen blanco sern luego inyectadas a embriones en etapa blastocistica 'tres
y medio d#as de madure%( o sern co-culti$adas con embriones en etapa de mrula 'dos y
medio d#as de madure%( para luego ser implantados en el animalasi, estas clulas
contribuirn a la formacin de te2idos del animal en desarrollo, as# como tambin entraran
a hacer partes de la clulas de la l#nea germinal 3ste proceso dar como resultado
ratones "uimricos "ue, a tra$s de cruces selecti$os con ratones sanos, darn como
resultado ratones heterocigticos para el gen deseado y el cruce de estos a su $e%,
producirn finalmente ratones knock-out homocigticos
3n otro proceso para la creacin de ratones transgnicos, se reali%an la inyeccin del gen
elegido en el pro-ncleo masculino de un o$ulo fertili%ado pero "ue no ha iniciado su
proceso de di$isin 3ste embrin 'o$ulo fecundado despus de su primera di$isin
mittica( "ue ya lle$a el transgen en su interior, es implantado en el tero de una ratona
pre$iamente preparada para poder anidar el hue$o fecundado De esta manera se
obtienen cr#as de las cuales el 5 ) G;H sern portadoras del gen inyectado y "ue sern
identificadas a tra$s del anlisis de su D@!
VAR%ABLE&
&ara lle$ar a cabo alguno de este procedimiento comple2o, se deben tener en cuenta
numerosas $ariables como se explica a continuacin*
&eeccin de 'neas ceuares (cuas madre em!rionarias)
1as clulas madres embrionarias, son deri$adas de clulas totipotenciales de la mesa
celular interna de blastocitos en etapa de pre-implantacin 3stas clulas madres son
capaces de reali%ar proliferacin ilimitada e indiferenciadas in $itro y de mantener su
capacidad para diferenciarse en todos los di$ersos tipos de clulas tisulares &ara poder
conser$ar la pluripotencialidad y $iabilidad de estas clulas ex $i$o es necesario
mantenerlas en un medio de culti$o apto y en presencia de factores inhibidores de
diferenciacin 3l medio de culti$o apto se basa en la presencia de fibroblastos primarios
mitticamente inacti$os y extra#dos de te2ido embrionario de ratones entre los d#as <? ) <G
de gestacin, "ue sir$e principalmente como matri% para fa$orecer la adherencia celular y
para alimentar a las clulas madre 3n cuanto a los factores inhibidores de diferenciacin,
el ms utili%ado es el factor inhibidor de leucemia '1D=( "ue es una glicoprote#na
multifuncional de la familia interleu"uina 9 de la cito"uinas y "ue tienen mltiples efectos
en diferentes rganos y sistemas
1D= regula el crecimiento y la diferenciacin de las clulas madre embrionarias, al tiempo
"ue aumenta su proliferacin 3sto asegura la preser$acin de la pluripotencialidad de las
clulas embrionarias "ue las hace aptas para las transfeccion de materia genticos
durante el proceso de creacin de un ratn knock-out
Dise#o del 'ector mutacin del gen & seleccin celular%
3l $ector o transportador, debe ser construido con un clon genmico "ue contenga
secuencias flan"ueadoras homologas a la secuencias flan"ueadoras del gen blanco
3stos $ectores son pie%as de !D@ genmico de tamao mediano, de aproximadamente
9;;; a B;;; pares de bases de largos "ue son replicas cercanas de genes endgenos y
"ue contienen tanto exones 'secuencia de codificacin( como intrones 'secuencias de
inter$encin( para apuntar el gen blanco, el $ector es construido con secuencias
flan"ueadoras ho;mologas a las del gen blanco mas las secuencias usadas para
desacti$ar este mismo, as# como tambin es construido con un ,cassette gentico "ue
contiene el neo un gen de resistencia a la neomicina "ue codifica la en%ima bacterial
aminoglicosido-transferasa '!&E(, "ue se expresa en clulas mam#feras y "ue producen
resistencia a los antibiticos aminoglicosidos cuando el $ector entra a la clulas madres
por el mtodo de tranfeccion ocurre una recombinacin homologa transportado por el
$ector con el gen blanco, esto es, recombinacin de las secuencias flan"ueadoras
homologas de ambos genes y bel intercambio del gen blanco por el cassette "ue contiene
el neo 3s as# como el gen de inters es reempla%ado anulado 'knock-out( '=ig<( sin
embargo, en algunas ocasiones se pueden presentar el fenmeno de recombinacin no-
homologa en la "ue el gen husped se combina con otro gen y como resultado el gen
blanco no sufre mutacin alguna
3l neo gen acta como un marcador positi$o para seleccionar a todas las clulas "ue
contienen un gen mutado o transgen 'homologo y no-homologo( por su resistencia a la
neomicina Cin embargo, el mercado de resistencia a la neomicina no diferencia las
clulas cuyo gen mutado es el gen blanco u otro gen diferente &ara esto, el $ector
tambin se puede insertar otros cassettes genticos "ue contengan transgenes "ue
permitan la seleccin negati$a de clulas en las "ue la recombinacin sucedi en lugares
incorrectos 3n este cassette gentico se inserta un gen de susceptibilidad a algn
anti$iral o antibitico de una manera "ue al existir recombinacin homologa este gen o
cassette se ha eliminado y no se exprese, el gen morir en presencia de esta droga
'susceptibilidad( es por esto "ue se le denomina seleccin negati$a

-igura .%Recom$inacin /omologa% 3l $ector incluye las secuencias flan"ueadoras
homologas al gen de inters 'en color purpura( y el cassette gentico "ue contiene el neo
gen 'color ro2o( 3l gen blanco, es decir el gen "ue se "uiere anular 'color amarillo( ser
reempla%ado por el cassette gentico durante la recombinacin homologa cuando las
secuencias homologas 'purpura( se combinen y permitan el intercambio de ambos genes
1as clulas inyectadas con el transgen resultante no poseern el gen original y
presentaran resistencia a la neomicina, lo "ue facilitara su seleccin en culti$o
0roduccin de ratones !uimricos & 1noc12out
1as clulas madre embrionarias transfetadas y exitosamente seleccionadas, son
inyectadas en los embriones del ratn 3stos son posteriormente implantados en hembras
pseudopreadas, esto es, hembras hormonalmente preparadas para recibir e implantar un
embrin despus de ser cru%adas con ratones esterilesasi algunos de los ratones "ue
nacen son "uimricos, estos presentaran dos tipos diferentes de clulas !"uellas "ue
corresponden al genoma del ratn original 'embriones( !s# tambin como las clulas
deri$adas de las clulas madre embrionarias manipuladas, "ue lle$an el gen modificado
integrado en su genoma 3l esperma u o$ulo presente en los ratones "uimericos,si
pro$ienen de las clulas introducidas en el blastocito &ortara los genes alterados cuando
estos animales se cru%an con animales sanos, las cr#as resultantes heredaran una copia
del cromosoma "ue lle$a la mutacin y "ue pro$iene de la clula madre embrionaria
transfectada, as# estos sern animales mutados heterocigotos &osteriormente, es
necesario "ue estos animales heterocigotos se crucen entre si para obtener ratones "ue
tengan dos copias del gen mutado 'una de cada progenitor(, es decir, animales
homocigotos knock-out estos animales presentan una ausencia completa del gen normal
'fig:(
IN3ECCIN EN E4 0RO2N5C4EO 0+R+ 4+ -OR6+CIN DE R+TONES
TR7NS)ENICOS
&ara poder obtener ratones transgnicos a tra$s de inyeccin pro-nuclear, es necesario
reali%ar primero la identificacin y el aislamiento del fragmento de !D@ o transgen
deseado y "ue $a hacer transferido 3ste transgen debe aislarse de la misma cepa animal
a la cual $a hacer inyectado y tambin debe obtenerse en una cantidad suficiente para
reali%ar una micro inyeccin exitosa !l mismo tiempo se deben extraer los embriones de
menos de B horas 'antes de la fusin pronuclear( de una ratona a la cual se le indu2o
sper o$ulacin 'suministro hormonal para gran produccin de $ulos( y "ue se cru% con
un macho de la misma ra%a &osteriormente, ba2o un microscopio de micro-manipulacin
se reali%a la micro inyeccin del !D@ forneo en el pro-ncleo masculino 'de mayor
tamao "ue el femenino( y se espera a "ue se produ%ca la fusin pro-nuclear y la
proliferacin celular
3stos embriones en etapa de blastocito son entonces implantados en una hembra
pseudopreada para la obtencin de los ratones transgnicos Ci la integracin del !D@
forneo en el genoma celular sucede despus de la fusin pronuclear, se obtendrn
ratones "uimricos en los "ue unos te2idos y clulas contarn con el transgen y otros no
+na $e% obtenida las cr#as se procede a la identificacin de la progenie transgnica
mediante anlisis del !D@ 3l porcenta2e de ratones transgnicos puros obtenidos
usualmente a tra$s de esta tcnica no excede el :;Hy con el cruce consecuti$o de estos
ratones se obtendr un ratn transgnico homocigoto, el cual es apto para el estudio de
los efectos de diferentes genes en la expresin proteica de los organismos
Animaes transgnicos como sistemas modeo de enfermedades *umanas
1a creacin de animales transgnicos con mutaciones especificas en genes "ue pro$ocan
enfermedades en el hombre, nos permiten estudiar su relacin causal en el desarrollo de
la patolog#a, as# como probar posibles terapias para su tratamiento
1os ratones scid 's#ndrome de la inmunodeficiencia combinada se$era( son transgnicos
a los "ue se les han incluido amplias delecciones en los genes implicados en la respuesta
inmune o una sola mutacin en el gen "ue codifica la en%ima adenosin deaminasa
3n el ultimo caso, la ausencia de la en%ima pro$oca un acumulo de adenosina y :I
desoxiadeno sin trifosfato en la sangre, ocasionando la destruccin de los linfoncitos para
lo "ue estos compuestos son particularmente toxicos Cin linfoncitos no hay respuesta
inmune y los animales se morirn de cual"uier infeccin tri$ial a no ser "ue se les
mantengan en cabinas estriles 3s un modelo excelente para la enfermedad homologa
humana "ue afecta a los denominados JJnios burbu2aKKpor"ue han de mantenidos en
esterilidad casi absoluta
3l cncer es una enfermedad gentica causada por alteraciones en los genes "ue, de una
manera directa o indirecta, inter$iene en los procesos de proliferacin celular,
comunicacin entre las clulas y apoptosis 3stos genes alterados constituyen los
oncogenes y oncosupresores "ue, por exceso de funcin 'oncogenes( o por defecto
'oncosupresores(, constituyen transgnicos en las dos copias de algn oncosupresores
'por e2emplo( estn alteradas 'knock -out( o "ue se expresan grades cantidades de dos o
tres oncogenes 3stos transgnicos desarrollan tumores con una gran frecuencia muy alta
sir$iendo de modelos para terapias tumorales >ambin se han obtenidos ratones
transgnicos portadores de un potente oncogn como es el ant#geno > del $irus CLG;,
ba2o el control del promotor del gen de la insulina de la rata, "ue confiere la especificidad
del te2ido 1os transgnicos resultantes desarrollan insulinomas pancreticos pudiendo
estudiarse el desarrollo, angiogenesis y progecion de este tipo de tumores
CONC4USIONES
1os ratones knock-out son una herramienta mara$illosa usada para estudiar la funcin de
genes espec#ficos en algn sistema del organismo ! pesar de todas sus limitaciones y
desatinos, esta tcnica proporciona un gran medio exploratorio del genoma y de la
fisiopatolog#a marina "ue de alguna manera se puede extrapolar a la fisiopatolog#a
humana 3l desarrollo de los ratones knock-out representa un a$ance de incalculable
$alor para los campos biomdicos y farmacuticos en tanto "ue ellos proporcionan
informacin muy $aliosa acerca de la construccin gentica de los organismos y de los
efectos de los diferentes genes en el desarrollo de los mismos >al parece "ue con el
constante a$ance de la biotecnolog#a, el futuro de la tecnolog#a knock-out parece aun mas
brillante
8I84IO)R+-I+
< 0era% F#os 0arco !ntonio y Cnche% >orres 4armen, Animales Modificados
Genticamente. La Herramienta del uturo
: 7ockamp 3, 0aringer 0, Cpangenberg, fees s, =raser s, 3shkind 1, oesch, %abel 7.f
mice and models Dmpro$ed animal models for biomedical research &hysiological
genomics ::;:
? 3$olucin comparada de genomas animales y su relacin con el genoma humano
'cap#tulo 9( en 3l /enoma Eumano &anamericana editorial, !ui" Garc#a$ Manuel %
&l'are" (iana. )* +dici,n. Bo-ot. /00/.
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