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Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Misses
Qumica Industrial
Qumica Analtica Instrumental A
Juliane Froncheti de Moura
Santo ngelo, 13 de Maio de 2014.
Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (HPLC)
HPLC
Toxicologia
Cosmticos
Frmacos
Pesticidas
Alimentos
Corantes
Aminocidos
Protenas
Pr requisito: a amostra deve ser solvel
na fase mvel
Vantagens:
FE utilizada vrias vezes.
Versatilidade: nico requisito a solubilidade da
amostra na FM.
Tempo reduzido de anlise.
Alta resoluo.
Boa para anlise qualitativa.
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Parmetros para identificao: t
R
, espectro de
absoro no UV (detector de arranjo de diodos),
espectro de massas.
Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.
Boa detectabilidade.
Automao
Vantagens: Desvantagens:
Alto custo do equipamento.
Alto custo de manuteno do equipamento
No existe um detector universal com boa
detectabilidade e baixo custo:
ndice de refrao: baixa detectabilidade (10
-6
g),
pouco estvel,
Espectrofotmetro de massas: ~US$ 150.000
Sistema de HPLC Sistema de HPLC - comercial
Filtro do Reservatrio:
Captar a FM e evitar que partculas suspensas
na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba.
Filtros de 10 a 40 um.

Fase Mvel Fase Mvel - Solventes
DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA
As impurezas da FM podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector.
TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS.
NO DEGRADAR A FASE ESTACIONRIA
No utilizar fases mveis agressivas.
SER COMPATVEL COM O DETECTOR UTILIZADO
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Fase Mvel - Solventes
FILTRAO DA FASE MVEL
Essencial
DESGASEIFICAO DA FASE MVEL
Indispensvel para o bom funcionamento do sistema


Garante:
Reprodutibilidade da vazo: retira ar dissolvido na fase
mvel e evita bolhas na bomba;
Estabilidade na linha de base: bolhas no detector
causam instabilidade na linha de base.
Mtodos de desgaseificao
ULTRA - SOM
Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em
geral o pior mtodo quando usado sozinho.
VCUO + ULTRA - SOM
Rpido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.
PURGA COM HLIO
Contnuo, hlio relativamente caro, leva a aumento
de vazamentos, maior custo operacional.
DESGASEIFICADOR ON-LINE
Contnuo, remove o ara logo antes da entrada da
bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo
prazo).
Eluio
o desenvolvimento da amostra no sistema cromatogrfico.
ISOCRTICA
Mesma composio da fase mvel durante a eluio.
Ex: Hexano ou metanol/gua 80:20 (v/v)
GRADIENTE
A composio da fase mvel varia durante a eluio.
Utilizado na separao das misturas complexas com diferentes
funes qumicas.
Exemplo:
Sistemas de Injeo de amostras - Injetores
Amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de
uma banda estreita.
Vlvula de introduo de amostra mais comum: vlvula de 6
prticos (orifcios).
Ala de amostragem ou loop: comprimento e dimetro do loop
para escala analtica interno definem seu volume
Loop para escala
analtica (uL)
Loop para escala
preparativa (uL)
Sistemas de Injeo de amostras - Injetores Colunas Cromatogrficas
Tubo de ao inoxidvel tratado; contm FE.
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Colunas Cromatogrficas
Condicionamento da Coluna
Necessrio para que haja um perfeito equilbrio entre a FM e a FE.
Coluna nova: 4 8 horas
Coluna parada a alguns dias: 2 horas
Coluna de uso dirio: 15 minutos
Coluna deve ser
guardada em solvente
orgnico ou fase mvel!
Cuidados com a Coluna
Manter a coluna sempre tampada.
Evitar choques de presso, trmicos e mecnicos.
Usar pr-coluna (guard columm)
Usar solventes ultrafiltrados
Pr-tratamento das amostras deve considerar eliminao de
partculas e de impurezas que possam ficar adsorvidas.
Obedecer faixa de pH em que a FE estvel (2 < pH < 8)
Eliminar sais, tampes e aditivas de FM antes de armazenar a
coluna.

Cuidados com a Pr-Coluna
Remover partculas;
Remover substncias que teriam forte interao com a coluna;
Remover substncias que posam precipitar quando em contato
com a FM e FE.
Resumindo, aumentar o tempo de vida das colunas.

Instalada entre o injetor e a coluna, com cerca de 2
cm de comprimento, tem a funo de :
Cromatografia : Classificao pela polaridade da
fase estacionria
Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar
Exemplo: slica gel

Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa
polaridade
Exemplo: slica de fase ligada C18

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Cromatografia de Fase Reversa (FR)
COLUNA DE FASE REVERSA C18
Aplicao quase universal (~ 70% das aplicaes da
literatura).
Permite analise desde substancias hidrossolveis e/ou
inicas at substncias lipoflicas
VANTAGENS
FE menos polar que a FM
- Equilbrio mais rpido
- Menor adsoro irreversvel
- gua no influencia na reprodutibilidade
- Stios de adsoro mais homogneos
- Eluio em gradiente facilitada
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
FE menos polar que a FM
Aplicao: Anlise de tocoferis
Fase reversa (C18)
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Vantagens
Desvantagens
FASE REVERSA
Otimizao dos parmetros envolvidos na separao
cromatogrfica
PRATOS TERICOS
Conceito baseado na analogia entre CROMATOGRAFIA,
DESTILAO e EXTRAO COM SOLVENTES.
COLUNA CROMATOGRFICA
Vrios estgios de extrao lq.-
lq ou de pratos tericos
(destilao).
Prato Terico: Segmento da coluna onde se atinge um equilbrio
termodinmico entre FM, FE e analito.
Nmero de pratos tericos e altura equivalente a
um prato terico
Tempo de reteno e tempo de reteno ajustado
t
M
(t
0
) tempo morto: tempo em que elui 1 componente que no
interage com a fase mvel.
t
R
tempo de reteno: tempo necessrio para eluir uma substncia de
um determinado sistema cromatogrfico (mximo do pico
cromatogrfico).
t
R
tempo de reteno ajustado:


Fluxo (F
c
ou F): vazo da fase mvel, geralmente em mL/min.
Volume morto (V
M
): volume de FM necessrio para preencher todos os
interstcios e poros da FE, ou volume de FM necessrio para eluir uma
substncia que no interage com a FE.
Volume de reteno (V
R
): volume de FM necessrio para eluir uma
substncia de um determinado sistema cromatogrfico.
Fator de reteno (k)
Relao de partio/Relao de reteno/Fator de capacidade (k)
Razo de distribuio do analito entre FE e FM.
> k > afinidade pela fase estacionria.
Posio de um pico no cromatograma depende do fluxo e do fator de
reteno.
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Clculo do Fator de reteno (k) Eficincia da Coluna (N)
Relao entre tempo de permanncia do analito na coluna e
alargamento das bandas .
Determinada pelo nmero de pratos tericos
Nmero de pratos tericos efetivos (N
ef
): substitui-se t
R
por t
R
Clculo da Eficincia (N)
Reteno Relativa ou Fator de Separao ()
Seletividade
Razo entre fatores de reteno de 2
analitos.
> , melhor a separao
Clculo do Fator de Reteno () Resoluo (R
s
)
Indica a qualidade da separao entre duas bandas cromatogrficas .
Resoluo completa: Rs > 1,25 (ou 1,50)
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Otimizao Cromatogrfica
ISOCRTICA
Modos de eluio em cromatografia lquida
GRADIENTE
Ajuste da fora cromatogrfica
Ajuste da fora cromatogrfica Ajuste da fora cromatogrfica
Ajuste da fora cromatogrfica -
Gradiente
Bombas de Alta Presso
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Detectores Detectores - Classificao
Detector no UV/Vis de comprimento de onda fixo

Mede s um comprimento de onda.
Mudana de comprimento de onda s com troca de filtro.
Lmpada de vapor de mercrio (253,7 nm banda mais
intensa)
Filtro mais comum (254 nm) onde maioria das
substncias orgnicas tem absoro.
Exige maior conhecimento prvio da amostra.
Baratos.

Detector no UV/Vis de comprimento de onda varivel

Permite selecionar um comprimento de onda. (190
600 nm)
Possvel de mudar o comprimento de onda durante a
anlise Otimizao da sensibilidade.
Possvel optar por maior ou menor sensibilidade e
seletividade
Operao muito fcil.

Detectores baseados no fenmeno de fluorescncia

Mais sensvel 10 a 1000 vezes mais sensvel que UV.
Cerca de 15% das substncias orgnicas so fluorescentes.
Especfico e seletivo.

Substncias
Fluorescentes
Molculas com
ligaes duplas conjugadas
e grupos aromticos
Absorvem radiao
de comp. de onda mais
curto e emitem radiao de
comp. de onda maior.
O que NO se deve fazer em HPLC
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