UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE LABORATORIO CLINICO E
HISTOPATOLOGICO

NOMBRE:
ERIKA CUIJIGUALPA
TANIA QUINZO
JESSICA ROJAS
SANDRA SATAN
CURSO: SEXTO SEMESTRE
CATEDRA: ENDOCRINOLOGIA
TEMA: MEDICIONES HORMONALES
INMUNOANLISIS Y MTODOS AFINES


MEDICIONES HORMONALES INMUNOANLISIS Y MTODOS AFINES
Entre los mtodos de medicin hormonal, los de ms uso son el
radioinmunoanlisis (RIA), el enzimoinmunoanalisis (ELISA) y el anlisis
inmunoradiomtrico (IRMA). Todos ellos tienen la ventaja de poder cuantificar
pequesimas concentraciones de sustancias de la sangre, orina u otras medios
orgnicos, lo que han transformado a estas metodologas en una palanca de
desarrollo de la endocrinologa.
Todos ellos se basan en la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo. Por
esta razn, miden la actividad inmunolgica de los analitos, lo que no siempre
coincide con su actividad biolgica. Se pueden clasificar en anlisis por
competencia, y anlisis no competitivos.
Concepto de inmunoensayo
Se denominan tcnicas inmunoquimicas aquellas tcnicas de laboratorio que
utilizan la reaccin antgeno-anticuerpo o algunas de sus propiedades o
consecuencias para medir elementos, sustratos o enzimas.
Si en una situacin de exceso de anticuerpo cuantificamos la cantidad de complejo
antgeno-anticuerpo formado, esta candidad ser directamente proporcional al
antgeno presente.
La relacin antgeno-anticuerpo es indetectable por si misma in vitro; se requiere
la puesta en marcha de una segunda fase o fase indicadora: una segunda
reaccin o una consecuencia de ella para que podamos detectarla.
Anlisis por competencia
Radioinmunoanlisis (RIA)
En 1956 el RIA fue introducido en los Estados unidos por Berson y Yalow y en la
Inglaterra por Ekins. Se inici en el rea de la endocrinologa, pero actualmente es
de utilidad para medir vitaminas, drogas enzimas, neutransmisores, etc.
El anlisis radioinmunolgico se beneficia de la gran sensibilidad que otorga el uso
de istopos radiactivos y de la notable especificidad con que ocurre la unin entre
molculas afines como son un antgeno y su anticuerpo, una hormona y su
transportador, o una hormona y su receptor celular especifico.
El RIA se basa en la especificidad de la reaccin entre una hormona que
llamaremos antgeno y su anticuerpo. La hormona marcada con un isotopo
radiactiva compite con su forma no radiactiva para unirse a un anticuerpo que les
es especfico.
La reaccin hormona-anticuerpo se efecta en condiciones establecidas de pH y
temperatura del medio, es reversible y obedece a la ley de accin de masas. De
este modo se establece un equilibrio, por lo que la razn de los productos de las
concentraciones a que ambos lados de la ecuacin ser constante.
La reaccin hormona-anticuerpo puede ser expresada como sigue:
Dnde:
H* = Hormona Radiactiva Libre(No Unida Al Anticuerpo)
AB = Anticuerpo Especifico
H* AB = Hormona Radiactiva Unida Al Anticuerpo.
K1 = Constante De Velocidad De Asociacin.
K2 = Constante De Velocidad De Disociacin.
As, cuando se llega al equilibrio de la reaccin,
K eq( constante de equilibrio) = K1 [H* AB]
K2[H*][Ab]
Si a esta de agrega hormona (H) no radioactiva ya sea de una solucin o de una
muestra biolgica en estudio, esta desplazara, segn sea su concentracin, a la
hormona marcada unida al anticuerpo, produciendo una disminucin de la
cantidad del complejo antgeno radiactiva- anticuerpo.
Al mantener constante con la concentracin de anticuerpo y de H*, la cantidad del
complejo depender solo de la cantidad de H que se agrega al sistema. Asi, si la
concentracin de H es alta, la cantidad de H* Ab ser pequea y viceversa.
Disponiendo de soluciones de concentraciones conocidas y crecientes de H se
puede construir una curva de calibracin (curva estanadar) en la cual se interpolan
las muestras desconocidas para determinar su concentracin.
Una etapa esencial del mtodo RIA lo constituye la separacin de antgeno libre
(hormona) de complejo antgeno-anticuerpo (hormona-anticuerpo).
Los procedimientos ms comunes para ello son:
Adsorcin de la hormona libre por carbn cubierto con dextrn.
Precipitacin de la hormona unidad al anticuerpo por medio de un segundo
anticuerpo dirigido contra el primer anticuerpo.
Separacin en la fase solida: cuando el anticuerpo especfico para la
hormona a medir est que se realiza la reaccin.
Elementos necesarios para el radioinmunoanlisis
Hormona marcada con un istopo radiactivo: los istopos ms unidos son
125
I
(hormonas tiroideas, proteicas, y algunas esteroidales);
3
H y
14
C (esteroides y
drogas)
Hormona pura no reactivas: es necesario para construir la curva de calibracin.
Anticuerpo especfico: se obtiene de animales inyectndoles riteractivamente la
hormona pura. Las hormonas peptdicas inducen una buena respuesta
inmunolgica, pero las esteroidales y tiroideas debido a su pequeo tamao,
deben ser conjugadas con albmina antes de ser inyectadas.
Mtodo de separacin
Muestra problema: las determinaciones hormonales puede3n realizarse en suero,
plasma, orina, saliva, lquidos cefalorraqudeos, etc.
Equipos para medir radiactividad. Cuando el istopo empleado es;
3
H y
14
C se usa
un contador de centelleo lquido que cuantifica radiaciones beta; mientras que
para medir
125
I se requioere un contador de centello gamma.
Radioinmunoensayo
Si marcamos el inmunoensayo con un compuesto radiactivo, hablamos de
radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores usados en RIA son de dos tipos, segn
la reaccin que produzca:
Radiacin beta: tritio (
3
H), carbono 14 (
14
C) y fosforo 32(
32
C)
Radiacin gamma: iodo 125 (
125
I) iodo131 (
131
I) y cobalto (
58
C).
Los RIA son esencialmente ensayos competivos. Existen dos tipos: de equilibrio o
secuenciales.
En el ensayo de equilibrio (el usado habitualmente en RIA), ambos, el antgeno
marcado yl antgeno no marcado de la muestra, se enfrentan simultneamente
para competir por los lugares de ligazn del anticuerpo hasta llegar a una fase de
equilibrio (la ley de accin de masa). Se presume que tanto el marcado como el
no marcado tienen la misma afinidad por anticuerpo. En este punto, el antgeno
(marcado y no marcado) ligado al anticuerpo es separado del antgeno (marcado y
no marcado): la proporcin ligado/libre (B/F) del antigenbo es inversamente
proporcional a la concentracin de antgenos (no marcado) presente en la
muestra.
Un antisuero ideal debera tener una alta concentracin de afinidad, dado que la
recproca de la constante afinidad (1/K) es una medidad de la sensibilidad del
ensayo.
As, antisueros con una K de 10
12
I/mol puede medir 10
-12
mol/l.
Existen dos aproximaciones grficas para para presentar los resultados del
ensayo y calcular los valores:
Diagrama de Scatchard. Se presenta la proporcin B/F frente a la
concentracin de antgeno marcado. Si la grfica es lineal, ello implica que
que todos los sitios de ligazn tiene la misma afinidad por el antgeno
marcado. La pendiente de la recta no dara el valor de K(constante de
afinidad)
Graficva de Odell. Se representa la cantidad de complejo (antgeno-
anticuerpo) marcado frente a la concentracin total de ligando marcado
aadido a una concentracin fija de anticuerpo. La grfica que resulta es
una hiprbole. La concentracin de afinidad coincidira con la recproca de
la concentracin de ligando libre marcado a una concentracin de
anticuerpo del 50 por 100 de saturacin.
En la saturacin secuencial, el antgeno no marcado se expone al anticuerpo para
su saturacin. Posteriormente, se aade el antgeno, que reaccionara con los
lugares que han quedado libre, separndose despus del antgeno marcado no
unido.
El postulado bsico de este sistema es que la reaccin antgeno anticuerpo en las
condiciones del ensayo sea virtualmente irreversible.
Separacin del antgeno anticuerpo marcado del no marcado.- Existe una
variedad de sistemas para conseguir esa separacin: el carbn activado cubierto
de dextrano captura el antgeno libre marcado. Una centrifugacin posterior deja el
antgeno marcado ligado en el sobrenadante.
Tcnica de doble anticuerpo.- Se trata de un segundo anticuerpo dirigido contra
el anticuerpo al que se ha ligado el antgeno y que, unido por ejemplo una fase
slida, permite retenerlo.
BIBLIOGRAFIA
Libro de Laboratorio clnico de Prieto