Cultivo microbiano: Siembra, Lectura de Siembra y Tincin en Hongos

Resumen Hongos
En el presente laboratorio se presenta la elaboracin de un cultivo fngico a partir del Medio de cultivo OGGY (Agar
oxitetraciclina-glucosa-levadura) el cual es utilizado para el aislamiento selectivo y enumeracin de levaduras y
moho. Se hace la respectiva siembra por agotamiento a partir de una muestra de agua contaminada, garantizando al
mximo condiciones de esterilidad durante el proceso. Pasadas 24 horas se realiz la respectiva lectura,
observando macroscpicamente caractersticas morfolgicas de las colonias presentes, obtenindose el
reconocimiento de la presencia tanto de mohos miceliares como de Levaduras. Con algunas de las colonias que se
lograron aislar se efectu un montaje hmedo para caracterizarlas microscpicamente, para ello se implement la
tcnica de tincin simple usando Azul de Lactofenol el cual tie directamente el micelio miclico.
Abstract Fungi
In the present laboratory developing the processing for make a Fungi growing from OGGY (Agar
oxytetracycline-glucose-yeast) which is used for the selective isolation and enumeration of yeasts and
molds in this laboratory. The respective seed depletion is made from a sample of contaminated water,
ensuring maximum sterile conditions during the process. After 24 hours, the respective test was read
macroscopically observing morphological characteristics of the colonies present, obtaining the
acknowledgment of the presence of both molds as Yeast mycelial. With some of the colonies isolated a
wet mount was made to characterize microscopically, for this simple staining technique using
lactophenol blue which stains mycolic mycelium directly implemented.
Introduccin
Los centenares de compuestos qumicos presentes
en una clula viva se forman a partir de precursores
llamados nutrientes. Los elementos que se necesitan
en grandes cantidades se denominan
macronutrientes, mientras que los metales y los
compuestos orgnicos que se requieren en pequeas
cantidades se denominan macronutrientes y factores
de crecimiento, respectivamente ( Brock 2004).
Los medios de cultivo utilizados en micologa
contienen nutrientes suficientes para asegurar el
desarrollo de los hongos (carbono, nitrgeno,
vitaminas, oligoelementos, etc). El pH ligeramente
cido tiende a facilitar el crecimiento de los hongos e
inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros
microorganismos. Es asi como actualmente se
conocen comercialmente variedad de medioa de
cultivo selesctivos para aislamiento de Hongos, el
ms reconocido para tal efecto es el Agar OGGY,
compuesto a razn de gramos / litro de extracto de
Levadura 5,0; D (+) glucosa (dextrosa) 20.0; Agar-
Agar (gelificante) 12,0 ( ROJAS 2011).
Actualmente se conoce como organismos fngicos
provocan contaminacion a un alimento por su accin
deteriorante, sobre materias primas y productos
manufacturados, de igual manera algunos hongos
tiene la cpacidad de genera micotoxinas, provocando
infecciones y reacciones alrgicas a otros
organismos. Por estos motivos se ha hecho
importante el recnonocimiento de la actividad
microbiolgica de los Hongos,por lo que es es
pertinente realizar anlisis de sus estrcuturas
fungicas y coayudante a ello efectuar anlisis de su
crecimiento en un periodo de tiempo determinado
partiendo del recuento de individuos en un rea
delimitada, para el caso a condiciones qumicas y
matemticas controladas desde los estudios a partir
de la elaboracin de medios de cultivos y su posterior
siembra de muestras a controlar y /o estudiar en
ellos.


Materiales

Asa micolgica
Hipoclorito
Laminillas
Portaobjetos
Microscopio ptico
Mecheros
Vaso de precipitado





















Metodologia
























Realizacin de
la siembra
Tomar la caja petri la cual ya tiene
el medio de cultivo previamente
preparado, para el caso el medio
usado fue OGY (Agar
oxitetraciclina-glucosa-
levadura)
Para optimizar el espacio, se marco
una divisinen la caja petri
realizando 4 cuadrantes, efecto de
garantizar una mejor tcnica de
siembra progresiva en aumento en
estos.
Se procede a preparar el espacio
para garantizar esterilidad al
momento de realizar la muestra.
Endender el
mechero
Colocar el recipiente que
contiene la muestra (agua
contaminada) cerca al
mechero.
Tomar el asa,
disponerla en el
mechero para
esterilizarla
Destapar el recipiente con la
muestra, acerca la abertura de
esta al mechero garantizando
esterilidad.
Abrir la caja Petri,
junto al mechero
Tomar la muestra con
el asa esterilizada,
hasta considerar visible
la cantidad tomada
Realizar el inoculo de la
muestra en el primer
cuadrante.
Esterilizar
nuevamente
el asa con el
mechero
La siembra a realizar es por
agotamiento, extender el inoculo
realizando estrasverticas a un
costado del cuadrante
Esterilizar
nuevamente el asa
con el mechero
Tomar las estras realizadas
anteriormente, y extenderlas
hacia la parte restante del
cuadrante.
Repetir este procedimiento
realizando en el cuadrante 1 ,
para los siguiente 3 cuadrantes
Tener cuidado de no unir las
ultimas estras realizadas
nuevamente con el inoculo
Cerrar la caja
Petri .
Abrir la caja
Petri .
Fin de la
siembra
Dejar la caja Petri a temperatura
ambiente durante 24 HORAS.

























Lectura de la
Siembra.
Tomar la caja Petri
Realizar el reporte del anlisis
macroscpico de las colonias
encontradas en el medio de cultivo.
Teniendo en cuenta:
Color
Tamao y morfologa
Apariencia, de las colonias
Esterilizar el asa colocndola en el
mechero, y dejarla enfriar
Abrir la caja Petri,
junto al mechero
Identificar colonias que
aparentemente estn
aisladas.
Con el asa micolgica
Extraer un fragmento de
la colonia
Colocar la
muestra en la
laminilla
presionar
suavemente para
dispersar la colonia
Disponer el montaje para ser
observado en el microscopio en
40 X
Identificar Hifas como
caracterstica ms significativa de
anlisis microscpico
En una laminilla
colocar una gota de
Azul de Lactofenol
Fin
Fin Anlisis
Macroscpico
Realizacin de
Tincin para anlisis
microscopico .
Encender el mechero para evitar
propagaciones de los
microorganismos al abrir la caja
petri
Cubrir con el portaobjetos
Resultados.
El medio de cultivo utilizado para la siembra de
la muestra de Agua contaminada fue el OGY
(Agar oxitetraciclina-glucosa-levadura), ya que este
es el ms usado para el aislamiento y enumeracin
de levaduras y moho. Evidentemente durante el
anlisis macroscpico se not el crecimiento de
mohos llamativos y posible presencia de algunas
colonias de Levaduras.
Se dispuso de cinco cajas Petri para la
correspondiente siembra mediante estras con
la tcnica de agotamiento de la muestra, a
continuacin en la tabla 1. Se muestran las
caractersticas macroscpicas observadas en
cada una de ellas


Caracteristicas Macroscopicas de las Colonias
Caja Petri Color Morfologia Tamao Apariencia
No. 1 Verdes Forma filamentosa,
elevacin convexa y
borde filamentoso
2.4 cm aprox Algodonosa
Blancas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero

5 mm aprox cremosa
Rosadas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero
4 mm aprox Cremosa, con
una
segmentacin
No.2 Verde Forma filamentosa,
elevacin convexa y
borde filamentoso
1 cm aprox Algodonosa
Rosada Forma circular,
elevacin plana y
borde entero
2 mm aprox cremosa
Amarillas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero.
7 mm aprox cremosa
Blancas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero

3 mm aprox cremosa
No. 3 Verde Forma filamentosa,
elevacin convexa y
borde filamentoso
1 cm aprox Algodonosa
Blancas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero
3 mm aprox cremosa
Rosadas Forma circular,
elevacin plana y
3 mm aprox cremosa
borde entero

No.4 Naranja Forma filamentosa,
elevacin convexa y
borde filamentoso
3 cm aprox Algodonosa
Blancas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero
1 mm aprox cremosa
No. 5 Verdes

Forma filamentosa,
elevacin convexa y
borde filamentoso
1.5 cm aprox Algodonosa
Amarillas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero.
2 mm aprox. cremosa
Blancas Forma circular,
elevacin plana y
borde entero
1 mm aprox cremosa
Tabla 1. Caracterizacin macroscpica de las colonias encontradas en el medio de cultivo OGY, en cada
uno de las cajas Petri.
De esta manera se evidencia como este medio
de cultivo efectivamente solo permite el
crecimiento y desarrollo de Hongos ( mohos y
levaduras) ya que a partir de las caractersticas
anteriormente mencionadas se podra
considerar la presencia de juntas clasificaciones,
ya que existen formaciones ms fcilmente
reconocibles de mohos y algunas otras
aparentemente pertenecientes al grupo de las
levaduras, esto es tentativo y se hace necesario
la observacin microscpica para ratificar o no
el grupo al que pertenecen.
En las figuras 1, 2, 3, 4 y 5 se grafican la
ubicacin aproximada de las colonias presentes
en el medio de cultivo y la velocidad de
crecimiento poblacional de estas en
comparacin a las dems identificadas,
destacando as una posible mayor afinidad con
los nutrientes otorgados por el medio de cultivo
.









Figura 1. Visualizacion
Macroscopica de la caja Petri 1

Figura 2. Visualizacion
Macroscopica de la caja Petri 2

















As se pone en manifiesto como las colonias
blancas caracterizadas como apariencia
cremosa crecieron masivamente en todas las
cajas Petri, aunque en menor tamao que las
dems; de igual manera se destacan las colonias
verdes de apariencia algodonosa que a simple
vista destacan mucho ms que las dems
colonias presentes. En la caja No cuatro creci
una colonia algodonosa de caractersticas
similares a las verdes, pero hubo variacin en
ella en la tonalidad de color, esta present un
color naranja.
A nivel de anlisis microscopico por medio del
montaje hmedo que se le realizo a una de las
colonias algodonosas filamentosas
disponindolo en el microscopio en el objetivo
de 40x, se pudo observar y reconocer que
presenta hifas tabicadas o septadas, ya que se
evidencio la subdivisin de esa en septos como
se presenta en la figura 6.

Figura 6. Montaje Humedo de una colonia de hongos algodonosa. Presencia de Hifas Tabicadas

Figura 3. Visualizacion
Macroscopica de la caja Petri 3

Figura 4. Visualizacion
Macroscopica de la caja Petri 4

Figura 5. Visualizacion
Macroscopica de la caja Petri 5

Kathiiii asi ms o menos se veia..
entoncs la dibujas no con tantas
folrecias x ah 2 yque se note bn lo de
los septos
Discusin
Los hongos constituyen un grupo de seres vivos que
incluye desde organismos unicelulares a
pluricelulares macroscpicos.
Los Hongos unicelulares son microscpicos, poseen
forma redondeada y se denominan LEVADURAS. La
mayora de los hongos, sin embargo, son
pluricelulares, estn formados por clulas cilndricas
alargadas, que se disponen linealmente para
constituir largos filamentos, a los que se le denomina
hifas, estas al crecer llegan a formar micelios visibles
macroscpicamente como los MOHOS y las setas
(ARGENIS 2008). Es as como se ratifican los
resultados obtenidos, las colonias redondeadas
efectivamente pertenecen al grupo de las levaduras y
las algodonosas claramente filamentosas efecto de la
presencia de micelios pertenecientes al grupo de los
mohos, y observacin delas hifas septadas que
forman dichos micelios. Este reconocimiento
microscpico se efectu con una tincin simple en
montaje hmedo usando el colorante Azul de
Lactofenol; este Es til para realizar el examen
directo de cultivos, ya que es una tcnica rpida que
permite visualizar perfectamente las estructuras
fngicas. A la hora de observar hongos del tipo
mohos obtenidos por aislamiento este colorantes
cumple con el objetivo ya que El fenol destruye la
flora acompaante, El cido lctico conserva las
estructuras fngicas al provocar un cambio de
gradiente osmtico con relacin al interior del fngico
generando una capa protectora; estas dos
condiciones sumado a la alta acidez del colorante
que permite teir directamente de micelio miclico, el
cual toma un delicado color azul claro (PRATS 2006).
Las Semejanzas macroscpicas como la forma de la
colonia, el color de la superficie, la textura y la
produccin de pigmentos son muy tiles para la
identificacin de organismos fngicos. En los medios
de cultivo las levaduras forman colonias hmedas,
cremosas, opacas o pastosas, y los hongos
filamentosos producen colonias algodonosas,
lanosas o pulverulentas.
En general, la morfologa microscpica de los hongos
es estable y presenta pocas variaciones. La
identificacin definitiva se basa en la forma
caracterstica, mtodo de produccin y ordenamiento
de las esporas, siendo tambin importante conocer el
tamao y la disposicin de las hifas en el caso de los
hongos filamentosos, en los levaduriformes se
observa la presencia de blastoconidias, seudohifas,
clamidosporas ( Cabezas 2007). En contexto a esta
prctica nicamente fue posible realizar
reconocimiento microscpico para una colonia de
mohos.
Por lo general las colonias de levaduras no
desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones
pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la
periferia de las colonias (Linares 2008), caracterstica
presentada en unas de las colonias observadas en el
medio de cultivo, especficamente la de color rosado.
Los hongos filamentosos dan lugar a colonias de
mayor tamao que crecen radialmente de modo
progresivo de aspecto inconfundible de vistosos y
variados colores, su crecimiento suele ser ms lento
que el de las levaduras, pero pueden llegar a invadir
toda la superficie del medio de cultivo ( PRATS
2006), es de esta forma que se reconoce la masiva
densidad poblacional de las levaduras blancas
cremosas en todas las cajas Petri y al contrario las
colonias de los mohos filamentosos cubren menor
espacio y cuentan con menor densidad poblacional,
hasta el da de la lectura es posible que al dejarlos
ms tiempo dichas proporcin cambie a razn de lo
anteriormente mencionado.

Conclusiones

Las tcnicas de trabajo asptico en el
laboratorio, es necesaria para evitar la
contaminacin durante la manipulacin de
los microorganismos y de los medios de
cultivos estriles. Su aprendizaje es esencial
para tener xito en el laboratorio de
microbiologa
La morfologa de una colonia de bacterias
en crecimiento en un medio nutritivo
determinado es importante para
caracterizarlo macroscpicamente y facilitar
su posterior y ms detallada identificacin.
Mediante la tcnica de siembra por
agotamiento se obtienen colonias aisladas
de una muestra.
La velocidad de crecimiento de Levaduras
es mayor a la de los mohos pero contrario a
esto los mohos luego de cierto tiempo tiene
mayor capacidad de invasin ya que el
tamao de sus colonias es mucho ms
grande.
El Azul de Lactofenol gracias a sus
condiciones qumicas permite identificar
estructuras fngicas.

Bibliografia

Broock Biologa de los Microorganismos,
10 dcima edicin, pgina 162, capitulo 6 -
Crecimiento Microbiano.
PRATS Guillen. Microbiologia Clinica.
Pagina 94. 2006. En
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alse
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp12
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http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitu
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http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/mali
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