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03.03, 45-52 (2009)


www.sbg.org.br
ISSN 1980-3540
Palavras-chave: DNA, sequenciamento, dideo-
xidonucleotdeos, pirosequenciamento.
Sequenciamento de DNA
O sequenciamento do cido desoxiribonucleico
(DNA) foi descrito primeiramente por Sanger el al. em
1977 e considerado um dos feitos cientfcos mais im-
portantes da cincia. O DNA representa uma espcie de
central de informaes das clulas, sejam elas de ani-
mais, vegetais ou de microrganismos. como se fosse
uma torre de controle que envia as informaes para que
a clula execute suas tarefas. A unidade fundamental de
informao nos seres vivos o gene, um segmento de
DNA capaz de codifcar a informao necessria para a
sntese de um produto biologicamente ativo, como uma
protena, que pode estar envolvida em processos de desen-
volvimento e metabolismo. Tambm atribudo ao DNA
a hereditariedade e a variabilidade necessria para o pro-
cesso evolutivo. A compreenso de como a informao
armazenada e utilizada nas clulas tem representado um
caminho para a soluo de problemas relacionados es-
trutura e funo das clulas. Um avano importante para
a gentica humana foi a descoberta e isolamento do gene
relacionado com a fbrose cstica, uma doena gentica
caracterizada pelo funcionamento anormal das glndulas
produtoras do muco, lgrima, suor, saliva e suco gstri-
co. Em 1989 Francis Collins identifcou esse gene e ana-
lisando a sequncia de nucleotdeos e a de aminocidos
por ele codifcada, foi capaz de postular que se tratava
de uma protena transmembrana cuja ausncia levava
secreo anormal de ons cloro nos tratos respiratrios e
gastrointestinal.
A gerao de conhecimento em torno dos genes
que compem o genoma dos mais diversos seres vivos
possvel por meio da determinao das sequncias de
nucleotdeos do DNA. Em termos moleculares, a deter-
minao sequencial de nucleotdeos de um gene pode ser
usada para deduzir sua funo, comparando-a com as se-
quncias de genes de funo conhecida depositadas em
bancos pblicos.
Para decifrar o genoma humano, os cientistas do
Projeto Genoma tinham o enorme desafo de sequenciar
os quase 3 bilhes de pares de bases dos cromossomos
e organizar os quase 20 mil genes do DNA humano.
Com o aumento dos investimentos na rea da genmica,
o nmero de genomas sequenciados tem crescido bas-
tante nos ltimos anos. Estimativas de janeiro de 2008
indicam cerca de 700 genomas completos sequenciados
(www.genomeonline.org). Estes nmeros incluem geno-
mas de procariotos, archaea e eucariotos. Entre os geno-
mas bacterianos, cerca de 50% deles so de bactrias de
interesse mdico.
Para o sequenciamento de qualquer fragmento de
DNA pelas tcnicas tradicionais, como o sequenciamen-
to automatizado de DNA baseado no mtodo descrito por
Sanger et al (1977), este fragmento precisa ser primeira-
mente inserido (ou clonado) em um vetor de clonagem,
originando um DNA recombinante (Figura 2). O vetor
de clonagem geralmente uma molcula de DNA cir-
cular que serve como um veculo que transporta o gene
de estudo para o interior de uma clula hospedeira, que
geralmente uma bactria. O vetor de clonagem possui
elementos que permitem sua autorreplicao bem como
alguns genes marcadores (resistncia a antibiticos) que
servem para seleo das bactrias que receberam o vetor.
Dentro da clula hospedeira o vetor multiplica-se, produ-
zindo vrias cpias idnticas de si prprio e do fragmen-
to de DNA (inserto) ligado a ele. Aps vrias divises
celulares cada clula contm uma ou mais cpias da mo-
lcula de DNA recombinante. Este DNA isolado e est
pronto para ser sequenciado.
Para o sequenciamento do genoma inteiro de um
organismo, o DNA precisa ser isolado e quebrado em
pequenos fragmentos de aproximadamente 1000 pb. Es-
SEQUENCIAMENTO DE DNA: DECIFRANDO O MANUAL
DE INSTRUES DOS SERES VIVOS
Andr Luis Fachini de Souza
1
, Liziane Cristina Campos Brusamarello
2
1- Universidade do Estado de Santa Catarina UDESC, Departamento de Solos e Recursos Naturais. Av. Luiz de Cames, 2090, Lages SC, CEP 88520-000, a2alfs@cav.udesc.br
2- Universidade Estadual de Ponta Grossa UEPG, Departamento de Biologia Estrutural Molecular e Gentica. Av. General Carlos Cavalcanti, 4748, Ponta Grossa PR, CEP
84010-919, lizianebrusa@yahoo.com.br
a2alfs@cav.udesc.br; lizianebrusa@yahoo.com.br
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ses fragmentos so inseridos em vetores de clonagem,
seguido pela insero desses vetores em bactrias hos-
pedeiras, constituindo o que chamamos de bibliotecas,
onde cada vetor possui um fragmento de DNA diferente
e seu conjunto constitui o genoma inteiro. Esse passo
crucial para o sucesso do sequenciamento e feito ma-
nualmente. Aps a obteno da biblioteca, os fragmentos
inseridos em cada vetor so sequenciados.
O sequenciamento de DNA pode ser feito por pro-
cedimentos qumicos (originalmente desenvolvidos por
Alan Maxam e Walter Gilbert) ou procedimento enzi-
mtico desenvolvido por Frederick Sanger e frequente-
mente chamado de mtodo dos didesoxinucleotdeos. O
princpio geral desta tcnica efetuar a sntese de uma
fta de DNA marcada complementar fta da qual se
deseja determinar a sequncia.
O primeiro passo a obteno de ftas simples
do DNA que se deseja sequenciar. Essas ftas podem
ser separadas pelo aquecimento que quebra as pontes
de hidrognio entre as bases do DNA e que mantm as
ftas unidas. Com as ftas separadas, liga-se um oligo-
nucleotdeo sinttico (primer) uma regio pr-deter-
minada de uma das ftas do vetor de clonagem (pela
complementariedade das bases nitrogenadas, onde A
realiza pontes de hidrognio com T e C com G), prxi-
mo ao stio onde foi inserido o fragmento de DNA em
anlise (Figura 3A). Esse oligonucleotdeo atua como
uma sequncia iniciadora, a qual alongada de maneira
complementar fta (DNA molde) na qual o iniciador
est ligado. O alongamento do iniciador um processo
enzimtico. A enzima DNA polimerase adiciona deso-
xinucleotdeos (dNTPs) sequencialmente na extremi-
dade 3 do iniciador (primer), complementar ao DNA
molde (Figura 3A).
Todo esse processo descrito realizado in vitro
(fora de um organismo vivo), em um equipamento cha-
mado Termociclador por meio de uma reao chamada
polymerase chain reaction PCR (reao em cadeia da
polimerase) (veja o artigo Amplifcao de DNA, 01.02,
63-65; 2006; www.sbg.org.br). Na prtica, ao tubo de re-
ao, alm do DNA a ser sequenciado, adiciona-se a en-
zima DNA polimerase, o iniciador adequado e os quatro
desoxinucleotdeos (dNTPs):- ATP, TTP, CTP e GTP. A
mistura de reao tambm inclui uma pequena quantidade
de didesoxinucleotdeos (ddNTPs) - (Figura 1) - marca-
dos com um marcador forescente. A marcao fuores-
cente atribui uma cor diferente para cada um dos quatro
didesoxinucleotdeos (Figura 3A).
A DNA polimerase consegue adicionar sequen-
cialmente, de acordo com a complementaridade de ba-
ses, os dNTPs na extremidade 3 do iniciador. Quando
um anlogo didesoxinucleotdeo incorporado ao poli-
nucleotdeo crescente no lugar de um desoxinucleotdeo
normal (dNTP), o crescimento da cadeia terminada,
pois a adio do prximo nucleotdeo requer uma hidro-
xila (OH) 3 livre, que no est presente nos didesoxinu-
cleotdeos que no possuem hidoxilas nas posies 2 e
3 (Figura 1).
Os vrios fragmentos de DNA gerados contendo
em uma das extremidades um ddNTP colorido so
separados de acordo com seus tamanhos por eletrofo-
rese em gel (Figura 3B). A eletroforese uma tcnica
de separao de molculas onde partculas de vrios
tamanhos migraro diferentemente em um gel quan-
do aplicada uma diferena de potencial. Molculas de
massa menor iro migrar mais rapidamente que as de
maior massa. De acordo com a concentrao na qual
o gel preparado, possvel a separao de molculas
de DNA que diferem em apenas um nucleotdeo (veja
o artigo Eletroforese de cidos nuclicos: uma prtica
para o ensino de gentica, Gentica na Escola 03.01,
43-48, 2008).
Conforme os fragmentos de DNA migram dife-
rentemente no gel e so separados, a base terminal de
cada fragmento identifcada pela sua fuorescncia ca-
racterstica. A fuorescncia identifcada assim que o
didesoxinucleotdeo passa por um feixe de laser e esta
informao enviada diretamente para um computador
que a converte em um grfco de picos (Figura 3B). As-
sim, a cor correspondente de cada um dos quatro dide-
soxinucleotdeo identifcada, atribuindo-se a cada uma
delas uma letra (A, T, C ou G). Utilizando detectores de
fuorescncia controlados por computador, os sistemas
automticos podem identifcar aproximadamente 10.000
bases por dia.
Uma vez determinada a sequncia de nucleot-
deos de um gene, ela precisa ser analisada. Para isso
ela comparada (alinhada) com sequncias de genes j
estudadas depositadas em bancos pblicos que renem
sequncias de DNA e de aminocidos e estruturas de
protenas. Os principais bancos so o GenBank, o EBI
(European Bioinformatics Institute), o DDBJ (DNA
Data Bank of Japan) e o PDB (Protein Data Bank). O
processo de alinhamento de sequncias busca determi-
nar o grau de similaridade entre duas ou mais sequn-
cias, ou a similaridade entre fragmentos das mesmas.
Esta etapa realizada atravs de programas computa-
cionais, especfcos para esse tipo de anlise, como por
exemplo o programa BLAST, disponvel em stios da
internet.
Pirosequenciamento
O pirosequenciamento uma tcnica de sequen-
ciamento baseada na deteco de pirofostafo (PPi) libe-
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rado durante a sntese de DNA. Este PPi liberado con-
vertido em uma molcula de Adenosina Trifosfato (ATP)
pela enzima ATP Sulfurilase, e a enzima Luciferase
utiliza essa molcula de ATP para oxidar Luciferina e
produzir fton de luz (Figura 4). Os ftons de luz produ-
zidos so detectados por aparelhos e a quantidade de luz
transmitida proporcional ao nmero de nucleotdeos
incorporados. Durante a reao de sequenciamento, os
nucleotdeos (A, T, C ou G) so adicionados cadeia de
DNA crescente. Se nenhum fton de luz for produzido,
signifca que a base adicionada no corresponde base
complementar da fta de DNA molde a ser sequencia-
da. Mas, quando o fton produzido, sabe-se qual base
foi adicionada na reao e a quantidade de luz emitida
corresponde ao nmero de vezes que a base se repete
(Ronaghi, 2001; Mardis, 2008). Assim, obtida a seq-
ncia de bases de nucleotdeos do DNA. Uma operao
de sequenciamento com durao de 7 horas, utilizando
equipamentos especfcos, pode produzir um total de 100
milhes de pares de bases utilizando a tcnica do piro-
sequenciamento. Enquanto que, no mesmo intervalo de
tempo, o mtodo de didesoxinucleotdeos produz apenas
440 mil pares de bases (Mardis, 2007).
Consideraes fnais
Novas tecnologias tm sido desenvolvidas para
racionalizar e, sobretudo, diminuir o tempo de sequen-
ciamento de genomas. Dentre estas tcnicas destaca-se
o pirosequenciamento, capaz de sequenciar milhes de
pares de bases (inclusive de genomas inteiros) em ques-
to de horas, realizado por apenas uma pessoa e com o
auxlio de equipamento especfco.
Apesar do domnio das tcnicas de sequenciamen-
to de DNA terem revolucionado o estudo da biologia e
da medicina, o conhecimento da informao contida no
gene no o bastante para solucionar muitos dos proble-
mas que permeiam essas reas do conhecimento. Surge
ento a necessidade da genmica funcional, uma nova
fase na era ps-genmica que, a partir do conhecimento
da sequncia de um genoma, tem-se a necessidade de in-
terpretar a funo desta sequncia. Neste sentido, novos
conhecimentos esto sendo gerados e novas tcnicas tm
sido desenvolvidas com o intuito de atender a demanda
que a pesquisa cientfca exige.
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H
Base
(A, T, C ou G)
(B)

(A)

Base
(A, T, C ou G)
Figura 1. Estrutura dos desoxinucleotdeos e didesoxinucleotdeos. (A) desoxinucleotdeos-dNTPs, no apre-
sentam a hidroxila (OH) no carbono 2 da ribose. (B) didesoxinucleotdeos-ddNTPs, no apresentam as hidroxilas
nos carbonos 2 e 3 da ribose.
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Figura 2. Esquema de insero do gene a ser sequenciado em um vetor de clonagem. Esse processo ocorre
com o auxlio de enzimas de restrio. Essas enzimas reconhecem regies especfcas no DNA e cortam essas regies
que, posteriormente, so ligadas ao vetor de clonagem tambm cortado com enzimas de restrio.
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Figura 3. Mtodo de sequenciamento usando didesoxinucleotdeos coloridos (ddNTPs). (A) Reao de se-
quenciamento. Primeiramente as ftas de DNA so separadas pelo aquecimento. Com as ftas separadas, o oligo-
nucleotdeo iniciador (primer) se liga a uma regio especfca em uma das ftas. A enzima DNA polimerase alonga
o iniciador inserindo bases complementares fta na qual o iniciador est ligado. Sempre que a DNA polimerase
inserir um didesoxinucleotdeo (ddNTP) colorido, a reao para porque a enzima incapaz de adicionar um outro
nucleotdeo na sequncia. (B) Sequenciamento utilizando aparelho que realiza eletroforese e deteco de dideso-
xinucleotdeos marcados. Uma vez formadas vrias ftas de DNA com diferena de um nucleotdeo de uma para a
outra, essas ftas so separadas por eletroforese. As ftas menores migram mais rapidamente (de cima para baixo) e,
assim que as ftas contendo em uma das extremidades um didesoxinucleotdeo colorido, a cor identifcada e cada
cor corresponde a uma das quatro bases nitrogenadas que caracterizam o DNA.
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Figura 4. Princpio geral das reaes do pirosequenciamento. A enzima Polimerase catalisa a reao de
adio de um nucleotdeo a uma cadeia de cido ribonuclico (RNA). Uma molcula de pirofosfato (PPi) liberada
como produto dessa reao e, logo em seguida, convertida em ATP pela unio com adenosina fosfossulfato (APS)
atravs da atividade de ATP sulfurilase. A oxidao de luciferina pela Luciferase produz fton de luz.