UNVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
ENZIMOLOGA



Practica N: 4
Nombres: Freddy Moposita Fecha: 2013-09-18 NRC: 3364
David Ramrez


1. Tema: Actividad enzimtica de la deshidrogenasa del cido succnico en el hgado de res.


2. Objetivos

2.1 Objetivo General

Determinar la actividad de la deshidrogenasa del cido succnico en hgado de res
fresco, midindose a diferentes tiempos.

2.2 Objetivos Especficos

Determinar el tipo de inhibicin que produce el tricloroactico en la deshidrogenasa del
cido succnico.
Calcular los parmetros cinticos aplicando los mtodos de linealizacin de Michaelis y
Menten.
Analizar la actividad de la succinato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de
inhibidor.


3. Introduccin
El hgado es un rgano importante que juega un papel en varios procesos fisiolgicos, ayuda en
la digestin, metabolismo, la sntesis de protenas y la desintoxicacin general. Tambin produce
la bilis, que se utiliza en la digestin para emulsionar las grasas. Las enzimas
predominantemente encontradas en el hgado son la aspartato amino transferasa (AST) y la
alanina aminotransferasa (ALT), adems encontramos otras enzimas ligadas a la membrana
mitocondrial en el hgado como son la succinato deshidrogenasa (Brandan N., 2008).
La succinato deshidrogenasa es una oxidorreductasa que cataliza la oxidacin del succinato para
formar fumarato siendo la coenzima el FAD que slo se encuentra en mitocondrias, y por lo
tanto la medicin de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en
una fraccin subcelular. La actividad de la enzima succinato deshidrogenasa se determinar
indirectamente, midiendo la reduccin de un aceptor artificial de electrones por parte del
FADH2, que se genera a consecuencia de la oxidacin de succinato catalizada por la enzima
(Mendez J., 2005).
El H
2
cedido por el succinato puede ser transferido del FADH
2
a un colorante susceptible como
el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
Puesto que estamos trabajando con una fraccin enriquecida en mitocondrias, y no con la
enzima purificada, hay que tener en cuenta lo siguiente: los electrones del FADH
2
pueden, o
bien entrar a la cadena respiratoria, o bien reducir al azul de metileno. Si deseamos medir la
actividad de la succinato deshidrogenasa mediante la reduccin del azul de metileno, debemos
asegurarnos que el FADH
2
solamente ceda sus electrones al azul de metileno. Por lo tanto, es
necesario inhibir la cadena respiratoria, y para ello usaremos tricloroactico que inhibe el
funcionamiento del complejo citocromo c oxidasa (Mendez 2005).


4. Procedimiento
Triturar cuidadosamente en el mortero con arena de vidrio aproximadamente 6 g de tejido de
musculo desmenuzado, aadiendo de 18 a 20 ml de disolucin de cido succnico.

Los tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4 (experimental) la enzima es activa. En todos los tubos se aade 1
2 gotas de disolucin de azul de metileno, se mezcla. Los tubos de ensayo se incuban en bao
Mara (50C) durante 1, 3, 5, 10 y 15 min. Medir la absorbancia a 660 nm para cada una de las
muestras en cada uno de los tiempos, se deber medir y reingresar al bao de Mara
inmediatamente.


5. Clculos

Hidroxido sdico al 10%

Acido succnico al 3%

Azul de metileno 0.001 %

Azul de metileno 0.05 %

Azul de metileno 0.1 %

Azul de metileno 0.5 %

cido tricloroactico 20 %

cido tricloroactico 10 %

cido tricloroactico 5 %

cido tricloroactico 1 %

6. Resultados


ABSORBANCIA
INHIBIDOR
CONCENTRACIN
DEL SUSTRATO
(%)
0[min] 1[min] 3[min] 5[min]
SIN
INHIBIDOR
0.001 1.332 1.315 1.310 1.298
0.05 2.357 2.324 2.322 2.316
0.1 2.425 2.286 1.590 1.270
0.5 2.542 2.534 2.057 1.272
1%
0.001 1.338 1.330 1.319 1.315
0.05 1.345 1.325 1.321 1.305
0.1 1.309 1.279 1.262 1.125
0.5 1.469 1.432 1.170 1.160
10%
0.001 2.338 2.330 2.319 2.318
0.05 2.546 2.521 2.508 2.514
0.1 1.985 1.862 1.652 1.279
0.5 2.511 2.506 1.904 1.277
15%
0.001 2.678 2.341 2.334 2.328
0.05 2.554 2.551 2.529 2.527
0.1 2.298 2.154 0.992 1.267
0.5 2.479 2.459 2.361 1.314
20%
0.001 1.341 1.334 1.327 1.330
0.05 1.348 1.335 1.319 1.316
0.1 1.317 3.158 1.108 1.111
0.5 1,333 2.927 0.650 0.508
Tabla 1: Resultados de concentracin y absorbancia de Ac succnico.


Grficos Absorbancia vs tiempo
Sin Inhibidor












Con Inhibidor al 1%



y = -0.006x + 1.3273
R = 0.8949
1.29
1.3
1.31
1.32
1.33
1.34
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.001%
y = -0.0066x + 2.3447
R = 0.6322
2.3
2.32
2.34
2.36
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.05%
y = -0.246x + 2.4463
R = 0.9731
0
1
2
3
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrarto
0.1%
y = -0.2608x + 2.688
R = 0.9363
0
1
2
3
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.5%
y = -0.0046x + 1.3358
R = 0.9389
1.31
1.315
1.32
1.325
1.33
1.335
1.34
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de sustrato
del 0.001%
y = -0.007x + 1.3397
R = 0.8858
1.3
1.31
1.32
1.33
1.34
1.35
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
del 0.05%
Imagen 1. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.001%
M
Imagen 2. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.05%
M
Imagen 3. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.1%
Imagen 4. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.5%
Imagen 5. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.001%
Imagen 6. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.05%
M









Con inhibidor al 10%

















y = -0.0342x + 1.3206
R = 0.863
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
1.35
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.1%
y = -0.0697x + 1.4645
R = 0.8707
0
0.5
1
1.5
2
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a


Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.5%
y = -0.004x + 2.3353
R = 0.8726
2.31
2.315
2.32
2.325
2.33
2.335
2.34
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.001%
y = -0.0058x + 2.5353
R = 0.5888
2.5
2.51
2.52
2.53
2.54
2.55
0 2 4 6
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.05%
Imagen 7. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.1%

Imagen 8. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.5%
Imagen 9. Grfico Absorbancia vs. Tiempo para
una concentracin de sustrato 0.001% M
Imagen 10. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.05% M













Con Inhibidor al 15%







y = -0.1381x + 2.0053
R = 0.981
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.1%
y = -0.2605x + 2.6356
R = 0.9632
0
1
2
3
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.5%
y = -0.0033x + 2.3441
R = 0.998
2.325
2.33
2.335
2.34
2.345
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.001% *
y = -0.0061x + 2.5539
R = 0.8901
2.52
2.53
2.54
2.55
2.56
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.05%
Imagen 11. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.1%
Imagen 12. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.5%
Imagen 13. Grfico Absorbancia vs. Tiempo para una
concentracin de sustrato 0.001%. ((*) En el grfico se
elimina el valor medido a 0 minutos debido a no sigue
la tendencia esperada.
Imagen 14. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.05%













Con Inhibidor al 20%




y = -0.2106x + 2.3276
R = 0.9963
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.1% *
y = -0.2215x + 2.6516
R = 0.7641
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.5%
y = -0.0022x + 1.3379
R = 0.6311
1.325
1.33
1.335
1.34
1.345
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.001%
y = -0.0063x + 1.3438
R = 0.8913
1.31
1.32
1.33
1.34
1.35
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.05%
Imagen 16. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.5%
Imagen 15. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.1%
(*) En el grfico se elimina el valor medido a
3 minutos debido a no sigue la tendencia
esperada.

Imagen 17. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.001%
Imagen 18. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.05%








Clculo de la actividad enzimtica para cada concentracin del sustrato

En cada una de las grficas, la pendiente representa la actividad enzimtica. As tenemos:
INHIBIDOR
CONCENTRACIN
DEL SUSTRATO (%)
Pendiente
Velocidad
(mol/L/min)
SIN
INHIBIDOR
0.001 -0,006 0,006
0.05 -0,0066 0,0066
0.1 -0,2577 0,2577
0.5 -0,2608 0,2608
1%
0.001 -0,0046 0,0046
0.05 -0,007 0,007
0.1 -0,0342 0,0342
0.5 -0,0636 0,0636
10%
0.001 -0,004 0,004
0.05 -0,0058 0,0058
0.1 -0,1381 0,1381
0.5 -0,2605 0,2605
15%
0.001 -0,0033 0,0033
0.05 -0,0061 0,0061
0.1 -0,2106 0,2106
0.5 -0,2215 0,2215
20%
0.001 -0,0022 0,0022
0.05 -0,0063 0,0063
0.1 -0,1645 0,1645
0.5 -0,2316 0,2316
Tabla 2. Datos calculados para la linealizacin.
y = -0.0434x + 1.2945
R = 0.8329
0
0.5
1
1.5
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.1%
y = -0.1645x + 1.2603
R = 0.9429
0
0.5
1
1.5
0 2 4 6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo (min)
Concentracin de Sustrato
0.5%
Imagen 19. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.1%
Imagen 20. Grfico Absorbancia vs. Tiempo
para una concentracin de sustrato 0.5%
Parmetros cinticos


SUSTRATO
INHIBIDOR

0% 1% 10% 15% 20%
1/[So] 1/Vo 1/Vo 1/Vo 1/Vo 1/Vo
1,00E+03 166,66 217,39 250 303,03 454,54
2,00E+01 151,51 142,86 172,41 163,93 158,73
1,00E+01 3,88 29,24 7,24 4,75 6,08
2,00E+00 3,83 15,72 3,84 4,51 4,32
Tabla 3. Datos de los recprocos calculados calculados para la linealizacin de Lineweaber-Burk.



Imagen 21. Linealizacin de Lineweaber-Burk a distintas concentraciones de Inhibidor.

Una vez realizada la linealizacin se calcula los parmetros cinticos para cada reaccin.

[]

y = 0.1167x + 51.374
R = 0.4128
y = 0.158x + 60.533
R = 0.6614
y = 0.193x + 58.587
R = 0.6034
y = 0.2499x + 54.579
R = 0.7391
y = 0.4043x + 51.6
R = 0.8917
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0.00E+00 2.00E+02 4.00E+02 6.00E+02 8.00E+02 1.00E+03 1.20E+03
1
/
V
o

1/[So]
Linelizacin de Lineweaber-Burk
Sin Inhibidor
Inibidor 1%
Inhibidor 10%
Inhibidor 15%
Inhibidor 20%


Inhibidor
Ecuacin y Parmetros Cinticos
Ecuacin Vmx km
0% y = 0,1167x + 51,374 0,0195 0,00227
1% y = 0,158x + 60,533 0,01652 0,00261
10% y = 0,193x + 58,587 0,01707 0,00329
15% y = 0,2499x + 54,579 0,01832 0,00458
20% y = 0,4043x + 51,6 0,01937 0,00784
Tabla 4. Parmetros cinticos a diferentes concentraciones de Inhibidor.

Representacin de Michaelis-Menten

Ecuaciones de Michaelis-Menten para los parmetros calculados


Inhibidor al 0%


[]
[]



Inhibidor al 1%


[]
[]



Inhibidor al 10%


[]
[]



Inhibidor al 15%


[]
[]


Inhibidor al 20%


[]
[]






Grficas de Michaelis-Menten



Imagen 22. Grfica de Michaelis-Menten para cada concentracin de Inhibidor



7. Discusin
Segn Donald V. (2007) la succinato deshidrogenasa es una enzima que slo se encuentra en mitocondrias,
y por lo tanto la medicin de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en una
fraccin subcelular, en la prctica realizada se pudo afirmar que hay la enzima succinato deshidrogenasa en
las mitocondrias ligadas al hgado pues se pudo determinar la actividad de esta enzima, mediante la
reduccin del azul de metileno y para asegurarnos que el FADH
2
solo ceda electrones al azul de metileno
usamos un inhibidor de la cadena respiratoria el tricloroactico.
En la prctica al medir absorbancias a diferentes tiempos y realizando grficas de linealizacin encontramos
que el km aumenta mientras que la velocidad mxima se mantiene constante por lo tanto es una inhibicin
competitiva donde la enzima que actuaba es las succinato deshidrogenasa que fue inhibida por el cido
tricloroactico, lo cual podemos comprobarlo pues segn Mendez J. (2005) la succinato deshidrogenasa,
una enzima del ciclo del cido ctrico que convierte succinato en fumarato es inhibida en forma competitiva
por malonato que se asemeja estructuralmente al succinato pero no puede deshidrogenarse.
Segn Devlin M. (1999) la actividad de una enzima vara considerablemente en diferentes organismos y
an en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos generales, debe
seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales,
la fuente debe ser fresca, dado que la mayora de las enzimas se deterioran rpidamente. Frecuentemente
una buena eleccin de la fuente de enzima permite simplificar la extraccin y purificacin de la enzima, en
la prctica de laboratorio el hgado no era tan fresco por lo que se pudieron degradar algunas enzimas por
lo que hubo problemas en el momento de las mediciones de absorbancia.

8. Conclusiones

Las pruebas realizadas en presencia y ausencia de un inhibidor (cido tricloroactico),
mediante la reduccin de azul de metileno comprobamos que en el hgado de res se
encuentra presente la enzima succinato deshidrogenasa.
Debido a que km aumenta y la Vmax disminuye se determin que tenemos una inhibicin
competitiva.
Para poder medir la actividad de la succinato deshidrogenasa se utiliz azul de metileno
para que los electrones del FADH
2
no vayan a la cadena de electrones y tricloroactico que
inhibe el funcionamiento del complejo citocromo c oxidasa.
















9. Recomendaciones
Es indispensable que el tejido del cual se va a extraer la enzima sea fresco para que no
haya complicaciones en la prctica como coagulacin
Se debe realizar varias repeticiones en la toma de datos de absorbancia para que los
resultados obtenidos sean confiables y disminuya el error de medicin.


10. Bibliografa

Bioqumica: libro de texto con aplicaciones clnicas, Thomas M. Devlin, ,1999, Reverte
Brandan N. (2008). Enzimas. Universidad Nacional del Nordeste. Extraido de: <
http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf>
Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt. (2007).Fundamentos De Bioqumica
Fundamental of Biochemistry, Editorial. Mdica Panamericana, pag 1260.
Mendez J. (2005). Modificaciones en el consumo de oxgeno, la excrecin nitrogenada y
dos enzimas de la cadena respiratoria. Escuela de Biologa laboratorio de Macromolculas.
Extraido de:
<http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/memorias/Extenso/TS/EO/TSO-07.pdf>