Introduccion Biofisica

Introduccin a la Biofsica
Mtodos elctricos y pticos

Enrico Nasi

Enrico Nasi , 2010, 2013
CONTENIDOS:

I. MDULO DE BIOELECTRICIDAD

1. Introduccin
2. Elementos bsico de electricidad
El concepto de carga elctrica
- Introduccin histrica.
- Cuantificacin de la carga
- La ley de Coulomb
- El principio de superposicin
- Carga elemental
- Relacin con la estructura de la materia
El campo elctrico
Potencial elctrico
Corriente elctrica
3. Resistencia
Aislantes y conductores
La ley de Ohm
Combinacin de resistencias en serie y en paralelo
Leyes de Kirkhoff
4. Capacitancia
Combinacin de condensadores en serie y en paralelo
Corriente capacitativa
Filtros
5. Impedancia

6. Medios electrolticos
Dipolos elctricos, solventes polares, coeficiente dielctrico
Diferencias entre conduccin en metales y electrolitos
Aislantes en sistemas electrolticos
7. Electroforesis
Separacin de molculas
Micro-ionoforesis
8. Mediciones bio-elctricas e instrumentacin
Medicin de voltaje
Medicin y de corriente
Amplificacin
Amplificadores operacionales
Mediciones elctricas en clulas
Principios de registro elctrico extracelular
El osciloscopio
9. Ruido elctrico
Fuentes de ruido
Reduccin de ruido por filtros de frecuencias
Reduccin de ruido por promedio de ensamble
10. Transductores
Fuerza
Ondas acsticas
Temperatura
Luz
Concentraciones qumicas

11. Adquisicin computerizada de datos.
Rango dinmico
Frecuencia de muestreo
12. Anlisis de sistemas lineales
Definicin de sistema lineal
Funcin de transferencia
Anlisis en el dominio de frecuencia
Anlisis en el dominio temporal

13. Anlisis de fluctuaciones
Extraccin de la amplitud de los eventos elementales
Determinacin de la cintica de los eventos elementales

II. MDULO DE PTICA

1. Introduccin
Naturaleza de la luz
- Teora corpuscular
- Teora ondulatoria
Polarizacin
Espectro electromagntico
Luz visible

2. Cuantificacin de la luz
Escalas radiomtricas
Escalas fotomtricas

3. Absorcin de la luz
Efectos de la luz absorbida
- Mediciones bolomtricas.
- Deteccin fotoqumica
- Efecto fotoelctrico

4. ptica geomtrica
Reflexin
- El principio de distancia mnima
- Formacin de imgenes por espejos curvos
Refraccin
- Principio de Fermat de tiempo mnimo
- Refraccin y el principio de Huygens
Lentes
- Imgenes virtuales
- Dioptras
- Profundidad de campo
- Aberracin esfrica
- Aberracin cromtica
- El lmite de difraccin
- Sistemas pticos complejos
Reflexin total interna y sus aplicaciones
- Fibras pticas
- Aplicaciones a endoscopia

5. Fluorescencia
Fenmeno bsico
Espectros de excitacin y de absorcin
Aplicaciones de la fluorescencia: (i) marcaje de molculas
Aplicaciones de la fluorescencia: (ii) interacciones moleculares y transferencia
por resonancia

6. Elementos de microscopia
Diseo bsico de un microscopio
- Tren ptico de la imagen
- Tren ptico del iluminador
Objetivos de inmersin
Aumento de contraste
- Contraste de interferencia diferencial
Microscopa de fluorescencia
- Microscopa confocal
- Microscopa multifotnica
- Microscopa de fluorescencia con reflexin interna total (TIRF)
- Superando el lmite de difraccin: microscopia de reconstruccin
estocstica
7. Imgenes digitales
- Acoplamiento microscopio-cmara
- Resolucin espacial
- Profundidad de pixel
- Tamao de archivo y compresin
- Histograma de intensidad
- Filtros espaciales
8. El lser
- Aplicaciones del lser: (iii) ciruga y micro-ciruga
- Aplicaciones del lser: (ii) pinzas y trampas pticas

9. ptica fisiolgica
- El ojo de los vertebrados
- Acomodacin
- Resolucin ptica del ojo
- Limitaciones pticas del mosaico retinal
- Defectos de visin
- Visin cromtica

Mdulo 1: Electricidad
Enrico Nasi: Introduccin a la Biofsica Mdulo de Bioelectricidad
1

1. Introduccin

En esta seccin se revisarn algunos conceptos bsicos relacionados con fenmenos
elctricos. Hay dos razones fundamentales por las cuales es relevante hacer un repaso de
fsica de la electricidad para el estudio de la biologa y la bio-medicina:

(i) En primer lugar, la electricidad est intrnsecamente vinculada a los procesos
biolgicos. Eventos elctricos son esenciales al funcionamiento de todo organismo:
basta mencionar la capacidad de recibir estmulos externos convirtindolos en un
lenguaje biolgico, la transmisin de mensajes, la comunicacin intercelular, la
sincronizacin y coordinacin de funciones celulares, y la iniciacin de la actividad
de efectores (secrecin, motilidad), etc. No solamente las clulas generan eventos
elctricos, sino que varios de los mecanismos moleculares que subyacen estas
funciones son a su vez susceptibles a la influencia de fuerzas elctricas y
controlados por ellas. De esta manera, es ineludible que para comprender la
fisiologa de una clula o de un rgano se requiere un conocimiento de los aspectos
elctricos.
(ii) En segundo lugar, la tecnologa que se ha desarrollado con base en la electricidad
proporciona unas herramientas sumamente tiles en bio-medicina. El monitoreo de
funciones del organismo puede beneficiarse de mediciones elctricas, que
proporcionan no solamente un registro en tiempo real del funcionamiento de un
ensamble multicelular, o un rgano entero (por ejemplo, el electrocardiograma, el
electroencefalograma, el electromiograma, el electroretinograma etc.), sino aportan
tambin importantes criterios diagnsticos en caso de disfunciones o patologas.
Otras tcnicas de registro elctrico permiten monitorear clulas individuales, e
inclusive la funcin de molculas individuales; avances en la bio-medicina moderna
han podido atribuir ciertos estados patolgicos a disfunciones de molculas
especficas, y, en conjuncin con anlisis gentico, identificar las mutaciones
responsables. Paralelamente, debido a que clulas y tejidos son susceptibles de ser
estimulados elctricamente, este acercamiento tambin proporciona una forma de
controlar funciones biolgicas para su estudio, o corregir anomalas (el ejemplo ms
conocido es el marcapasos). As que un entendimiento de principios elctricos
tambin es til para el manejo de instrumentacin de uso corriente en el laboratorio
de investigacin biolgica, o los engendros ms modernos en la frontera de la
biomedicina.

Aunque se revisarn principios importantes de electricidad, los contenidos estarn
sesgados hacia temas relevantes a la biomedicina, y divergirn por lo tanto de la secuencia
de tpicos que aparece en programas tradicionales.

2
2. Elementos bsicos de electricidad
El concepto de carga elctrica
Introduccin histrica. La nocin de carga constituye la mdula de la electricidad, y todos los
dems conceptos y leyes fundamentales en este campo tienen que ver con la manera como las
cargas estn distribuidas en el espacio, como se mueven, las fuerzas que ejercen, etc.
Irnicamente, aunque hemos aprendido mucho sobre como se comportan las cargas elctricas,
realmente sabemos poco o nada acerca de lo que son. Histricamente, el concepto de carga
electrosttica es muy antiguo, originndose desde los
tiempos de la antigua Grecia, cuando se observaron
interacciones entre ciertos materiales (como el
mbar) que haban sido sometidos a friccin. Del
hecho de que un trozo de mbar frotado contra un
pao (es decir, cargado) atrae ciertos materiales
pero repele otros, y que dos trozos idnticos de
material cargado siempre se repelen, se dedujo que
esta energa de interaccin tiene dos polaridades:
positiva y negativa. Cargas del mismo signo se
repelen (Figura 2.1 (i)), mientras que cargas de signo
opuesto se atraen (Figura 2.1 (ii)).

Cuantificacin de la carga. La fuerza de interaccin entre dos cuerpos cargados elctricamente
sirve como base para definir una unidad de medida para la carga. Por ejemplo, la unidad esu
(unidades electrostticas electro-static units) se define de la siguiente manera: dos cargas
de 1 esu se repelen con una fuerza de una dina si se encuentran a 1 cm de distancia (sistema
CGS: cm, g, s). Frecuentemente (en fisiologa especialmente) se usa en cambio el Coulomb
(sistema MKS: m, kg, s), el cual corresponde a 2.99810
9
esu.
La ley de Coulomb. Midiendo la manera como cambia la intensidad de la interaccin
electroesttica entre dos cuerpos (idealmente puntuales) en funcin de sus respectivas cargas
y de la distancia que los separa, se determin que la fuerza (atractiva o repulsiva) es
directamente proporcional al producto de las cargas e inversamente proporcional al cuadrado
de la distancia entre ellas:
F =kq
1
q
2
/r
2

(F es la fuerza un vector - q denota las cargas, r la distancia, un vector unitario orientado
con la lnea imaginaria que une las dos cargas; k es la constante de proporcionalidad, que
depende, entre otras cosas, de las unidades de medida que uno adopte para las distintas
variables). Esta ley constituye el fundamento de la electroesttica.
El principio de superposicin. Rara vez, o nunca, uno se enfrenta a una situacin en la cual
slo se tienen dos cargas y su interaccin mutua es la nica relevante. Lo normal es que se
tenga una gran cantidad de cargas distribuidas en el espacio, en cuyo caso uno esperara que
cada una interactuara atractiva- o repulsivamente con todas las dems. Esto podra prestarse a
engendrar una situacin de gran complejidad si se quisiera determinar cuales son las
resultantes netas de todas esas fuerzas, es decir, cual es el vector de fuerza que en ltimas
acta sobre cada una de las cargas. Afortunadamente, se pudo establecer que con solo
averiguar por separado la interaccin de una carga con cada una de las dems y sumar todas
esas fuerzas, uno puede saber la respuesta. Esto parece obvio, pero en realidad no es para
nada trivial, y las consecuencias de este hecho son trascendentes: hubiera podido darse el
caso, por ejemplo, de que la presencia de mltiples elementos los hiciera interactuar de alguna

Figura 2.1
3
manera complicada (no-
lineal), que no fuera una
simple suma, y nos
enfrentaramos entonces a un
problema tal vez insoluble, ya
que en un sistema dado la
introduccin de cada nuevo
elemento alterara por
completo las reglas del juego.
Afortunadamente no es as, y
podemos descomponer el
juego total de fuerzas en un conjunto de elementos aditivos. Podemos formalizar esta
conclusin enuncindola de la siguiente manera: la fuerza con la cual dos cargas interactan
(ejemplo Figura 2.2 (i)) no es alterada por la presencia de una tercera carga (Figura 2.2 (ii)).
Eso permite deducir la fuerza total ejercida sobre una carga particular en un sistema complejo:
simplemente se suman una por una las fuerzas debidas a la interaccin con cada una de las
dems cargas individualmente. El panel (iii) de la Figura 2.2 muestra como la resultante (flecha
azul) de las fuerzas experimentadas por una carga particular se puede inferir aplicando la ley
del paralelogramo a los dos vectores que representan las fuerzas individuales de interaccin
entre dicha carga y las dems cargas del sistema.

Carga elemental. Es natural preguntarse si la escala de medida de la carga es continua, es
decir, si el tamao de una carga puede adquirir cualquier valor, incluyendo ser arbitrariamente
pequea. Un experimento clsico llevado a cabo por Robert Millikan (1909) estableci que eso
no es as: existe un tamao mnimo para las cargas elctricas. En ese histrico experimento se
introdujeron diminutas gotas de aceite cargadas elctricamente (por la friccin al salir del
atomizador mismo, o usando una fuente radioactiva
que las ionizara) en una cmara; stas tendan a caer
bajo el efecto de la gravedad, pero simultneamente
se aplic un campo elctrico vertical producido por un
generador variable de voltaje (V; Figura 2.3). Al
examinar como se desplazaban las microscpicas
gotas, se observ que la intensidad del campo
elctrico necesaria para contrarrestar la cada por
gravedad (g) tena valores discretos: para cada gota
era siempre el mltiplo de un valor mnimo, como si
en cada instancia la carga en una gota de aceite
siempre fuese un mltiplo de una unidad de carga
elemental. Distintos acercamientos experimentales a
lo largo de dcadas siempre han llevado a esa misma
conclusin: la carga elctrica invariablemente tiene una magnitud que es mltiplo de algn
paquete elemental.
Relacin con la estructura de la materia. La naturaleza cuntica de la carga elctrica encontr
un eco natural en la manera como est organizada la estructura de la materia a nivel
microscpico. Los tomos estn constituidos por un ncleo formado por protones
(positivamente cargados), alrededor del cual orbitan electrones (negativamente cargados).
Aunque la polaridad de la carga de las dos partculas elementales es opuesta, su magnitud es
idntica. Este valor representa la unidad fundamental de la carga elctrica, llamada carga
elemental, que corresponde a 1.610
-19
Coulomb y se suele representar como q
e
.
Figura 2.2

Figura 2.3
4

Campo elctrico y potencial
El campo elctrico. Ahora extendamos esta visin, tratando de vislumbrar el mapa de fuerzas
elctricas que puede existir en un dominio del espacio. Como punto de partida, consideremos
el caso ms simple, el de una sola carga q
0
, y coloqumosla por conveniencia en el origen del
sistema de coordenadas de nuestro espacio de 3 dimensiones (0,0,0). Por supuesto, mientras
q
0
sea la nica carga en nuestro sistema, no podemos detectar ninguna fuerza; pero sabemos
que tiene potencialmente la capacidad de interactuar con otras. De hecho, si aadiramos otra
carga de magnitud arbitraria, q
1
, en un punto cualquiera del espacio (con coordenadas x
1
, y
1
,
z
1
), la fuerza de interaccin sera, segn la ley de Coulomb, F= q
1
q
o
/r
2
; es decir, esta fuerza es
el resultado de multiplicar la carga de prueba, q
1
, con el componente q
0
/r
2
. Este ultimo, por lo
tanto, es un vector que define la influencia que una carga arbitraria experimentara si se
colocara en la posicin (x
1
,y
1
,z
1
), y no depende de la magnitud ni de la polaridad de la carga de
prueba, solo de la posicin. Como lo mismo se puede aplicar a cualquier otro punto del
espacio, se trata de un campo vectorial, es decir, una funcin E(x,y,z) que asocia a cada punto
del espacio un vector, y se llama el campo elctrico. En este caso particular, en el cual el
campo es producido por la presencia de una sola carga, q
0
, colocada en el origen de nuestro
sistema de coordenadas, el vector del campo en cada punto es:
E(x,y,z) = q
0
/(x
2
+y
2
+z
2
)
[la distancia entre un punto y el origen se deduce aplicando simplemente el Teorema de
Pitgoras]. Claramente, aqu tenemos un campo simtrico alrededor de la carga, cuya
intensidad se debilita a medida que uno se aleja de ella (decrece con el cuadrado de la
distancia). Ahora consideremos una situacin ms general: teniendo un sistema de N cargas
discretas, si consideramos la fuerza total que experimentara una carga de prueba, q
x
, ubicada
en un punto arbitrario del dominio espacial, sta sera la suma de todas las fuerzas ejercidas
por todas las cargas del sistema, i.e.:
F=q
x
q
i
/r
2

Puesto que q
x
no depende del ndice de sumacin, i, se puede extraer de la sumatoria,
F=q
x
q
i
/r
2
. De nuevo, el termino contenido en la sumatoria es el campo elctrico, y podemos
visualizarlo como un conjunto de flechas, una para cada punto del espacio, cuya orientacin y
longitud indican la direccin y la intensidad, respectivamente, de la fuerza que se
experimentara en ese punto (Figura 2.4A).

5

Potencial elctrico y su relacin al campo. Si en un dominio dado del espacio hay un campo
elctrico no nulo, debe ser que existe una distribucin no-homognea de cargas: de lo
contrario, si stas estuvieran uniformemente esparcidas en todas partes, en cualquier punto las
varias fuerzas se anularan mutuamente. En cambio, si se congrega en alguna regin un
exceso de carga de una polaridad respecto a otra regin, se engendran fuerzas netas: una
carga de prueba experimentara una atraccin hacia una direccin y repulsin hacia la direccin
opuesta. Diramos entonces que existe una diferencia de potencial entre esos dos puntos. Toda
situacin en la cual ocurre algn evento elctrico interesante involucra una distribucin
asimtrica de cargas en el espacio y/o un re-arreglo de las mismas. Tratemos de esbozar una
visin de lo que es el potencial elctrico a partir de lo que hemos aprendido respecto al campo
elctrico, y proporcionar una medida cuantitativa de los que es la diferencia de potencial. Para
ese fin pensemos en lo que ocurre si se tuviera que mover una carga de un punto a otro del
espacio; la presencia de un campo elctrico en ese dominio hace que, segn la orientacin del
campo a lo largo del recorrido, ese movimiento pueda verse bien sea favorecido o impedido. La
diferencia de potencial entre el punto de partida y el punto de llegada se reflejar en el balance
final de trabajo que hay que llevar a cabo para cubrir ese recorrido (positivo o negativo, segn
si el campo requiri esfuerzo o si ayud). Formalicemos esta nocin: dado un campo E(x,y,z),
si uno tomara una carga unitaria y la desplazara del punto P
1
= (x
1
,y
1
,z
1
) al punto P
2
= (x
2
,y
2
,z
2
)
(Figura 2.4B) el trabajo (elctrico) realizado sera el producto de cada elemento de
desplazamiento, llammoslo S
i
multiplicado por el componente de la fuerza del campo en ese
punto que est orientado en la direccin del desplazamiento (indicados por las flechas azules
en el panel C) y sumado a lo largo de todo el recorrido efectuado (anlogo a la definicin de
trabajo mecnico, que es fuerzadesplazamiento). Notar que, para un recorrido cualquiera, en
ciertos puntos del espacio la fuerza del campo puede estar alineada con la direccin del
desplazamiento (es decir a favor), en otros solamente en parte, o en contra, y as
sucesivamente. Para extraer en cada punto el componente de la fuerza alineado con la
direccin de desplazamiento, efectuamos una operacin denominada producto punto entre el
vector del campo elctrico, y un vector de magnitud unitaria en la direccin del movimiento;
esta operacin se define como el producto de las magnitudes de los dos vectores, multiplicado
a su vez por el coseno del ngulo entre sus respectivas direcciones. Se trata simplemente de la
magnitud de la proyeccin del vector fuerza sobre la lnea del desplazamiento local (notar que
es un valor escalar, sin direccin). Si las dos direcciones fueran ortogonales (90), este valor
sera cero (la proyeccin es nula, siendo cos(90) = 0); esto quiere decir que en ese punto la
fuerza ni ayuda ni impide el movimiento. Si, en el extremo opuesto, los dos vectores fueran

Figura 2.4
6
perfectamente co-lineales, el 100% de la fuerza bien sea ayudara o se opondra al movimiento
(dependiendo del sentido de las dos flechas). En los casos intermedios, habr un componente
del vector fuerza que coincide con la direccin del movimiento. Es como tomar el vector fuerza,
usar la regla del paralelogramo para descomponerlo en dos componentes ortogonales, uno de
los cuales est alineado con el eje del movimiento, y solamente tomar en cuenta la magnitud de
ste ltimo. Al sumar los valores obtenidos en cada paso del recorrido y sumarlos, obtenemos
un valor total,
2,1
, que nos dice si, al final de cuentas, el viaje entre el punto P
1
y el punto P
2

requiri algn esfuerzo (haciendo el balance de los tramos favorables y los desfavorables) o si
fue, globalmente, cuesta abajo. Esto se representa como:
2,1
= E
i
S
i

Ms correctamente, si el campo elctrico cambiara de una manera continua en diferentes
regiones del espacio, habra que partir el recorrido en elementos incrementales infinitamente
pequeos (dS), multiplicarlos puntualmente con F en cada sitio del trayecto, y sumar los
resultados, lo cual define una integral:
E dS
De nuevo, el resultado es un nmero escalar. Para ciertos tipos de campos vectoriales,
llamados conservativos, este resultado es independiente del recorrido que se haga entre los
dos puntos; por lo tanto, debido a que se trata de un nmero que define de una manera nica el
trabajo requerido para ir de un punto a otro, sin importar por cual ruta, eso define la diferencia
de potencial elctrico entre esos dos puntos. Esta condicin se cumple, por ejemplo, con un
campo elctrico estacionario. El potencial elctrico se mide en las unidades de statvoltios
(sistema de unidades CGS) o Voltios (sistema de unidades MKS); un statvoltio 300 V.
Tambin podemos tomar uno de los dos puntos como un punto de referencia fijo, y establecer
el potencial en cada punto del espacio respecto a dicha referencia. Se suele tomar una
referencia ideal ubicada infinitamente lejos, y el valor de este campo escalar en cada otro punto
del espacio es el trabajo realizado para desplazar una carga unitaria desde el infinito hasta el
punto dado. Se llama el potencial. Existe una relacin entre el campo elctrico y el potencial: el
campo elctrico en cada punto est dado por la magnitud de cambio del potencial por unidad
de desplazamiento, en la direccin en que cambia ms abruptamente. Este se llama el
gradiente del campo escalar, en este caso del potencial. Notar la diferencia entre los dos
conceptos: dos pares de puntos en el espacio pueden diferir de la misma cantidad en cuanto a
potencial elctrico (es decir en ambas casos para ir de un punto al otro el trabajo sera el
mismo), sin embargo el campo en un caso puede ser mucho mayor que en el otro si la
distancia es ms corta; puesto que el campo define las fuerzas ejercidas, situaciones en las
cuales existe un cambio de potencial sobre una distancia diminuta (i.e. un campo elctrico muy
fuerte) implican enormes fuerzas sobre cualquier partcula cargada que all se encuentre. Un
ejemplo que viene al caso en la biologa es la membrana celular, a travs de la cual existe una
diferencia de potencial elctrico del orden de 0.1 V (redondeando); pero considerando que su
espesor es inferior a 10 nm (una centi-milsima de milmetro), el campo elctrico que resulta es
enorme, algo como 100 mil voltios por centmetro! Quiere decir que si una molcula tiene
regiones con una carga elctrica y se encuentra localizada en una membrana biolgica, estos
grupos estarn sometidos a fuerzas muy considerables. Si, adems el potencial a travs de la
membrana celular cambiara en un momento dado, el campo de fuerza tambin cambiara, y
podra inducir una alteracin en la conformacin de la molcula. Este principio, como se
examinar ms tarde, es responsable por la capacidad de ciertas clulas (neuronas y fibras
musculares, por ejemplo) de ser activadas elctricamente.

Corriente elctrica. Una carga tiende a ser atrada por una regin cuyo potencial elctrico es de
la polaridad opuesta. Por lo tanto si existe una diferencia de potencial entre dos puntos y
7
existen cargas que puedan moverse libremente, stas tendern a fluir. Si llamamos la rata de
desplazamiento de carga corriente, simbolizada por la letra I, esta se medir en
Coulombs/segundo, lo cual define la unidad fundamental de medida de corriente, el Amperio
(simbolizado por la letra A; 1 A = 1 Coul/seg). La corriente elctrica implica una re-distribucin
de cargas, y por lo tanto est estrechamente asociada con la generacin de cambios de
potencial.

Potencia. Finalmente, mencionamos la medida de la energa disipada en realizar algn trabajo
o producir calor en un proceso elctrico. La potencia se representa necesariamente en
unidades de energa/tiempo. El Watt (o Vatio, simbolizado por la letra W) es la unidad bsica, y
a su vez representa Joules/segundo (ya que representa la rata a la cual se va disipando
energa). En trminos de parmetros elctricos, la potencia est dada por el producto de voltaje
y corriente:
W = VA
Por ejemplo, si por el filamento de un bombillo de 120 V fluye una corriente de 0.5 A, la
potencia ser 1200.5 = 60 W. En la medida en que parte de esta energa se disipe en calor,
se obtiene un incremento de temperatura; por lo tanto, en numerosas aplicaciones en las
cuales puede ocurrir dao trmico es imprescindible tener en cuenta estos parmetros.

8
3. Resistencia

Aislantes y conductores. Ahora consideremos los determinantes de la posibilidad de
mover cargas a travs de algn dominio espacial. En metales, la matriz de la materia es
inmvil, mantenida por enlaces atmicos en una estructura fija. Por lo tanto, la
posibilidad de translocar carga depende de la movilidad de partculas sub-atmicas,
electrones en los orbitales externos que estn dbilmente ligados a sus respectivos
ncleos (la banda de conduccin), de tal manera que puedan saltar de posicin en
posicin, bajo la influencia de un voltaje. Materiales que cumplan con esta propiedad se
denominan conductores (el cobre, por ejemplo), y este tipo de conduccin se llama
conduccin electrnica, Por otra parte, materiales en los cuales los electrones no se
prestan a desplazarse entre distintos tomos funcionan como aislantes (plstico, vidrio,
etc.). La posibilidad de que una carga pueda desplazarse por un material no es del todo-
o-nada, sino hay un continuo de gradaciones: distintos materiales difieren
cuantitativamente en la facilidad con la cual un electrn puede desprenderse de su
respectivo ncleo para ir a ocupar otra posicin. Esta propiedad intrnseca de cada
material se denomina resistividad (usualmente indicada por la letra ). No hay que
confundir la resistividad de un material con la resistencia entre dos puntos; lo primero,
como ya se ha dicho, es una caracterstica del medio y su composicin, lo segundo
depende tambin de factores geomtricos. En un cable, por ejemplo, habra que
considerar no solamente el material, sino tambin la longitud, y el grosor,
respectivamente. La unidad de medida de la resistencia es el Ohm, simbolizado por la
letra , definida de la siguiente manera: si entre dos puntos hay una resistencia de 1 ,
entonces al aplicar un voltaje de 1 V fluir una corriente de 1 A. Si se tiene un elemento
homogneo con una geometra regular, tal como un paraleleppedo o un cilindro,
entonces la resistencia entre dos caras opuestas crecer proporcionalmente a la
distancia entre ellas, es decir la longitud del slido, y ser inversamente proporcional al
rea de seccin transversal:
R = L/A
Estas consideraciones son intuitivamente obvias: haciendo una analoga, entre ms
largo el camino, mayor el impedimento total, mientras que entre ms ancho, ms fcil el
trnsito. Por ejemplo, consideremos un cable de dimetro d, longitud L, y resistividad .
La resistencia entre sus dos extremos ser:
L/[(d/2)
2
] = 4L/d
2

Puesto que la longitud (en el numerador de la expresin) tiene dimensiones de cm (en
el sistema CGS) y el rea tiene dimensiones de cm
2
, es imprescindible que la
resistividad, , tenga como unidades cm para que el resultado final se mida en
unidades de .
Corriente elctrica y la ley de Ohm. La magnitud de un flujo de cargas ser ms grande
entre mayor la diferencia de potencial entre los dos puntos (voltaje), y entre menos difcil
el movimiento de las cargas en el material examinado; la relacin cuantitativa entre
voltaje (diferencia de potencial elctrico), resistencia, y corriente est dada por la ley de
Ohm:
I=V/R
9
La misma ley se puede expresar despejando bien sea V (V=IR) o R (R=V/I). A veces, en
lugar de una medida de la dificultad que enfrenta un flujo de carga, i.e. la resistencia, se
habla de la facilidad, i.e. su recproco, llamada conductancia, que se representa con la letra
g y se mide en Siemens (S; 1 S = 1/). En este caso podramos escribir la ley de Ohm
como I = Vg.

Combinacin de resistencias en
serie y en paralelo. Un sistema
rara vez se puede representar
como un solo elemento resistivo.
Ms a menudo consiste de
mltiples elementos
interconectados. Hay dos
maneras de conectar dos
resistencias: (i) una seguida de la
otra (en serie; Figura 3.1A), o (ii)
una al lado de la otra (en
paralelo; Figura 3.1B). La resistencia total de un sistema que consista de dos
resistencias conectadas en serie o en paralelo se puede calcular conociendo cul es la
resistencia de cada uno de dos elementos, y aplicando la ley de Ohm:

(i) En serie: El voltaje entre los dos extremos del circuito, V
tot
, debe ser la suma de
los dos incrementos de voltaje a travs de cada una de las dos resistencias
(adems, la corriente que fluye por las dos resistencias es la misma):
V
tot
=V
1
+V
2
= IR
1
+IR
2
=I(R
1
+R
2
)
pero tambin V
tot
=IR
tot
R
tot
= R
1
+R
2
. Es decir, el valor de la resistencia total de
dos resistencias colocadas en serie es la suma de los valores individuales (y por
lo tanto es necesariamente mayor que la de cada elemento por separado).
(ii) En paralelo: La corriente total que pasa por el arreglo de las dos resistencias, I
tot,

debe ser la suma de las corrientes que pasan por las dos ramas:
I
tot
= I
1
+I
2
= V/R
1
+V/R
2
= V(1/R
1
+1/R
2
)
pero tambin I
tot
= V/R
tot
1/R
tot
= 1/R
1
+1/R
2
Es decir, el recproco del valor de la
resistencia total de dos resistencias colocadas en paralelo es la suma de los
recprocos de los valores individuales; por lo tanto, la resistencia total resulta
menor que la de cada componente individual. El valor de
R
tot
ser R
1
R
2
/(R
1
+R
2
).

A partir de estas dos simples relaciones, podemos
determinar la resistencia total en un circuito ms complejo,
compuesto por numerosas resistencias interconectadas (y
tambin los voltajes y las corrientes en distintas sub-
partes). Se trata simplemente de descomponer el circuito
en trozos ms simples aplicando las dos reglas. Por
ejemplo, en la Figura 3.2 si preguntramos cual es la
resistencia total, diramos que debe ser el arreglo en
paralelo entre la rama A y la rama B. Ahora, la rama A es
Figura 3.2
Figura 3.1
10
la conexin en serie entre R
1
y R
2
(cuya resistencia total sabemos calcular), mientras en la
rama B es un arreglo en paralelo de R
3
y R
4
(que tambin calculamos fcilmente) a su vez
conectado en serie con R
5.
Aplicando las dos reglas secuencialmente varias veces, obtenemos
la respuesta deseada. De nuevo, parece un ejercicio abstracto, pero eso es justamente lo que
se hace cuando uno ha de establecer las pautas de flujo de corriente en un tejido constituido
por elementos elctricamente excitables como el cerebro o el corazn.

Una aplicacin particularmente simple y ubicua de las reglas de combinacin de resistencias es
el as llamado divisor de voltaje. Este consiste simplemente en un circuito de dos resistencias
en serie, al cual se aplica un voltaje dado entre los dos
terminales (Figura 3.3). La pregunta es cul ser el
valor del voltaje en el punto medio, donde las dos
resistencias se conectan. La respuesta es sencilla y
solo hace uso de la regla de como se suman dos
resistencias en serie y la ley de Ohm. La corriente total
es I=V
tot
/R
tot
. Pero R
tot
= R
1
+R
2
, con lo cual es trivial
calcular I. Consideremos que uno de los extremos del
circuito, digamos aquel donde est R
1,
se encuentra a un voltaje = 0 (i.e. tierra esto solo
simplifica el anlisis, pero no es una suposicin necesaria). Entonces, aplicando de nuevo la ley
de Ohm, sabemos que respecto a ese punto, el voltaje en el punto intermedio, llammoslo V
X
,
ser IR
1
. Pero I = V
tot
/(R
1
+R
2
), por lo tanto:
V
X
= V
tot
[R
1
/(R
1
+R
2
)]
Es decir, el voltaje del punto intermedio ser el voltaje de los extremos multiplicado por un
factor que representa cual fraccin de la resistencia total esta dada por la contribucin de R
1
.
Puesto que esta fraccin puede tender valores entre (casi) 0 y (casi) 1, la conclusin es que el
punto medio estar comprendido entre 0 y V
tot
, y que variando la razn entre R
1
y R
2
se puede
obtener cualquier valor deseado en ese rango. Por ejemplo, supongamos que hace falta un
voltaje de 3.6 V para hacer funcionar un cierto circuito, pero se dispone solamente de una pila
de 9 V. Entonces, se necesitan dos resistencias tales que:
R
1
/(R
1
+R
2
)=V
X
/V
tot
= 3.6/9 = 0.4
Hay una infinidad de combinaciones que satisfacen esta condicin, basta que R
2
=1.5R
1

(despejando de la ecuacin). Si el circuito requiere una cantidad significativa de corriente, es
deseable seleccionar valores bajos de resistencia, porque la corriente de alimentacin ha de
fluir a travs de R
2
y a lo sumo puede ser V
tot
/R2. Este circuito es muy til en la prctica para
generar voltajes arbitrarios, pero, para nuestros fines, tiene ulteriores implicaciones para las
mediciones de seales elctricas generadas por clulas, la separacin de molculas por
campos elctricos, etc. Estos temas se tratarn en una seccin posterior.
Leyes de Kirkhoff. Muchas de las propiedades de un circuito pueden deducirse a partir de dos
consideraciones generales:

(1) La suma algebraica de todos los voltajes a lo
largo de un circuito es cero. Es decir, si
partiramos un circuito en un nmero
arbitrario de tramos, y determinramos la
diferencia de potencial en los dos extremos de
cada tramo, la suma de estos valores es cero.
La Figura 3.4 ilustra un ejemplo, que consiste
en un circuito con una batera y tres

Figura 3.3

Figura 3.4
11
resistencias arregladas en serie. Las letras A, B, y C determinan la divisin (arbitraria)
del circuito en sub-tramos. La batera genera 1 Voltio y los valores de las resistencias
son R
1
= 5 , R
2
= 3 , y R
3
= 2 . La corriente que fluye por el circuito se calcula
fcilmente considerando la regla de combinacin de
resistencias en series, lo cual da la resistencia total
del circuito: R
Tot
= 10 . Aplicando la ley de Ohm (I
= V/R) el resultado es I = 1/10 = 0.1 A. Ahora la
magnitud del voltaje en el tramo entre A y B es
IR
A,B
= 0.18 = -0.8 V (el signo negativo se debe a
que el punto B es necesariamente menos positivo
que el punto A, por encontrarse ms alejado del
polo positivo de la batera). El voltaje entre B y C
es IR
B,c
= -0.12 = -0.2 V. Y el voltaje entre C y A
es el voltaje generado por la batera = 1 V. Si sumamos los tres valores, el resultado es
cero.
(2) En cada punto del circuito, la suma de todas las corrientes es cero. El caso no-trivial es
cuando el punto en cuestin es un nodo, es decir, la unin entre 3 o ms conductores.
Como ilustracin, consideremos un circuito con dos resistencias en paralelo y una
batera, y el nodo N (Figura 3.5). La batera genera 5 Voltios y las dos resistencias
tienen valores R
1
= 20 y R
2
= 50 . La resistencia total obedece a la regla de
combinacin de resistencias en paralelo R
Tot
= 2050/(20+50) = 14.3 , y por lo tanto la
corriente total del circuito es 5/14.3 = 0.35 A. Esta es la corriente que entra al nodo N.
La que sale por las dos ramas es I
1
= V/R
1
= 5/20 = -0.25, y I
2
= V/R
2
= 5/50 = -0.1 A.
La suma de las tres es cero. Esto, en esencia, simplemente reafirma el principio de
conservacin de carga: si no hay fuentes ni sumideros en un punto nodal, la cantidad
total de carga que entra ha de ser igual a la que sale.

Figura 3.5
12
4. Capacitancia.

Mientras una resistencia permite el paso de corriente de un lado a otro, existe otro componente,
llamado condensador o capacitador, por el cual no fluye corriente pero que es capaz de
acumular carga. Un condensador est constituido por una delgada capa de aislante entre dos
conductores (Figura 4.1A), cuya superficie tenga un rea considerable (e.g. dos placas
metlicas separadas por una brecha de aire). Al aplicar un voltaje entre sus dos terminales,
cargas de polaridad opuesta ocupan la
superficie de los dos conductores, y, aunque no
pueden fsicamente saltar la barrera aislante, se
encuentran lo suficientemente cerca para que
puedan atraerse mutuamente por la ley de
Coulomb (Figura 4.1B). Por lo tanto, an si se
desconectara la fuente de voltaje, el
condensador queda cargado (i.e. quedan cargas
de polaridad opuesta separadas por el
dielctrico; Figura 4.1C). La cantidad de carga
acumulada (Q) depende del voltaje aplicado (V), y de la capacitancia intrnseca del
condensador (C):
Q = VC
Por consiguiente, la capacitancia de un condensador representa cuanta carga es capaz de
acumular para un voltaje dado (C = Q/V). A su vez, la capacitancia es directamente
proporcional al rea de las placas (entre ms grandes ms cargas pueden acomodarse;
comparar Figura 4.2 A y B), e inversamente proporcional a su separacin (entre ms cercanas
una a la otra, menor la distancia entre cargas de polaridad opuesta, y por lo tanto mayor la
fuerza de atraccin, por la ley de Coulomb; comparar Figura 4.2 A y C):
C A/d
(la constante de proporcionalidad, que omitimos, tiene que ver con propiedades del material
aislante entre los dos conductores). Estos parmetros tendrn relevancia en sistemas
biolgicos, cuando encontraremos capas elctricamente
aislantes que son supremamente delgadas, como la
membrana que envuelve una clula, y que pueden
presentar numerosos pliegues que le confieren una
superficie de rea considerable: su capacidad de
acumular carga ser por lo tanto significativa, lo cual
tendr importantes repercusiones en su comportamiento
elctrico. La capacitancia se mide en unidades de Farad,
y se simboliza con la letra F.

Combinacin de capacitancias en serie y en paralelo. As
como las resistencias muchas veces se encuentran
conectadas unas a otras bien sea en paralelo o en serie,
tambin tenemos reglas que nos permiten establecer la
capacitancia total de dos (o ms) condensadores
conectados en paralelo o en serie. Estas reglas resultan
ser la imagen especular de las que gobiernan la combinacin de resistencias: Si dos
condensadores, C
1
y C
2
, se conectan en paralelo, C
T
= C
1
+ C
2
. Si se conectan en serie, 1/C
T
=
1/C
1
+ 1/C
2
. En otras palabras, la capacitancia de dos elementos en paralelo es siempre mayor
que la de cada uno por separado, mientras que en serie la capacitancia total es menor que la

Figura 4.1

Figura 4.2
13
de cada elemento. La demostracin es trivial: si los condensadores se encuentran en paralelo y
se aplica un voltaje V al circuito, la carga en el primer condensador ser Q
1
= VC
1
, la del
segundo ser Q
2
= VC
2
. Evidentemente la carga total separada es Q
T
= Q
1
+ Q
2
. Dividiendo
ambos lados de la ecuacin por V, se obtiene Q
T
/V= Q
1
/V

+ Q
2
/V, es decir, C
T
= C
1
+ C
2
. Si los
dos condensadores estn en serie, la carga separada entre los dos terminales del circuito es Q;
pero tambin es la carga separada en cada uno de los condensadores (debe haber una
cantidad de carga igual y opuesta en cada par de placas), con lo cual Q = C
1
V
1
= C
2
V
2
. Por
consiguiente, teniendo en cuenta que V
T
= V
1
+ V
2
, Q
T
/C
T
= Q
1
/C
1
+ Q
2
/C
2
, i.e. 1/C
T
= 1/C
1
+
1/C
2

Corriente capacitativa. El condensador tiene gran utilidad en el diseo de circuitos elctricos, ya
que su capacidad de acumular carga y luego liberarla permite construir aparatos cuyo
comportamiento tiene caractersticas temporales muy definidas, como por ejemplo slo
responder a estmulos que cambien rpidamente, o, viceversa, a estmulos estacionarios o
lentamente cambiantes. Esto se puede vislumbrar considerando que ocurre en un condensador
cuando se altera el voltaje a travs de sus dos terminales: si pasamos de V
1
a V
2
la carga en el
condensador cambiar de Q
1
= V
1
C a Q
2
= V
2
C. Es decir una cierta cantidad de carga (Q)
debe bien sea entrar o salir del condensador. Este movimiento de carga representa una
corriente, que llamaremos corriente capacitativa simbolizada como I
C
. Puesto que la corriente
se define como rata de flujo de carga por unidad de tiempo, I
C
es la derivada temporal de la
carga, I
C
= dQ/dt, lo cual a su vez es = CdV/dt. Si el voltaje es estacionario, dV/dt = 0 I
C
= 0;
en otras palabras, no importa que tan alto el voltaje, no habr corriente por el condensador
mientras V permanece estable. En cambio, si el voltaje cambia habr corriente capacitativa, la
cual ser ms grande entre mayor la rata de cambio del voltaje. Entonces vemos que,
contrariamente a una resistencia, por la cual fluye corriente siempre en proporcin a la
diferencia de voltaje entre sus terminales, en el caso de un condensador lo que ms importa es
como va cambiando el voltaje, es decir sus caractersticas temporales. Notamos tambin que,
contrariamente a una resistencia en la cual se mantiene en todo momento una estricta relacin
de proporcionalidad entre V y I, la ley del condensador implica que en ese caso la amplitud de
la corriente y la del voltaje pueden estar desfasadas en el tiempo. Consideremos un voltaje que
vare segn una funcin sinusoidal:
V(t) = Asin(t)
La expresin indica que el voltaje crece y decrece cclicamente, alcanzando una amplitud de
+A y A (cuando sin(t) = +1 y -1, respectivamente). El
parmetro se conoce como la frecuencia angular. Si = 1 el
sinusoide cumple un ciclo cuando t incrementa por 2 (en
radianes, i.e. 360). Si fuera 2, en cambio, al cabo de
segundos ya se cumplira un ciclo, y as sucesivamente. Entre
ms grande el valor de , ms rpidas las oscilaciones: la
frecuencia, f, medida en ciclos por segundo (i.e. Hz), ser f =
/2. Ahora apliquemos ese voltaje a un condensador y
miremos la corriente que entra y sale del condensador. Puesto
que, como ya se explic, la corriente capacitativa es proporcional
a la rata de cambio del voltaje aplicado (I
C
= CdV/dt), para un
voltaje que vare sinusoidalmente la corriente ser mxima
cuando el voltaje tiene valor 0 (i.e. cuando el sinusoide cruza la
lnea negra horizontal que es el momento de mxima pendiente;
el signo podr ser positivo o negativo, representando la
direccin de la corriente, segn nos encontremos en la fase

Figura 4.3
14
ascendiente o descendiente del ciclo); en cambio la corriente ser cero justo cuando el voltaje
alcanza su pico mximo o mnimo (en esos puntos la tangente, cuya pendiente representa la
rata de cambio, es horizontal). Siendo ms formales, I
C
= Cd/dt(Asin(t)) = C Acos(t) [la
derivada de la funcin seno es el coseno]. Pero cos(x) = sin(x+/2). Evidentemente corriente y
voltaje estarn desfasados, como ilustra la Figura 4.3.

Filtros. Combinando resistencias y condensadores es posible modular la respuesta temporal de
de un circuito. Este concepto est a la base de la construccin de filtros, circuitos que dejan
pasar o rechazan selectivamente seales elctricas que oscilen con diferentes frecuencias.
Consideremos, por ejemplo, una seal de voltaje que
podra cambiar en el tiempo, y por lo tanto la
representamos como una funcin V(t). En lugar de
monitorearla directamente, la pasamos por el circuito
ilustrado en la Figura 4.4, el cual consiste de una
resistencia seguida de un condensador cuyo otro
terminal est conectado a tierra. Como modifica este
simple circuito la seal en cuestin? Llamemos V(t) el
voltaje de salida del circuito. Evidentemente, por la ley
de Ohm, V y V diferirn en la medida en que pase
una corriente a travs de la resistencia R, y la
diferencia, V, ser IR. Esta corriente solo puede continuar su camino por el condensador C, y
por lo tanto es igual a la corriente capacitiva, que como ya sabemos es igual a CdV/dt.
Entonces podemos representar nuestro voltaje desconocido, V, como:
V = V + V = V + RI = V + RCdV/dt
Podemos re-arreglar los trminos de esta ecuacin y re-bautizar RC como :
dV/dt V/ = V
Se puede resolver esta ecuacin para un caso sencillo, en el cual el voltaje V es inicialmente 0,
y en el instante t=0 brinca abruptamente a un valor fijo, llammoslo V
o
. Esto es como asumir
que el trmino de la derecha es una constante, V
0
, y que el sistema empieza en V=0, es decir,
las condiciones iniciales de la ecuacin son V = 0 para t< 0. La solucin de este problema es
una funcin exponencial:
V(t) = V
0
(1 exp(-t/))
Cuando t = 0, V tambin es cero (todo nmero elevado a un exponente de 0 da como resultado
1), y por consiguiente esta funcin satisface las condiciones iniciales del problema. Cuando
t VV
0
. En otras palabras, V empieza de cero, y sube exponencialmente hacia la asntota
V
0
; la rapidez de esta transicin gradual est dada por (=RC), y por eso se le llama la
constante de tiempo del sistema. Este parmetro tiene de hecho unidades de tiempo, lo cual
puede parecer sorprendente, pero es fcil comprobarlo: R tiene unidades de , pero por la ley
de Ohm es tambin igual a V/I, cuyas unidades son V/A = Vs/Coul. Por otra parte, la
capacitancia C se mide en Farad, pero puesto que C = Q/V (por la ley fundamental del
condensador), entonces F= Coul/V. Multiplicando R y C las unidades son por consiguiente s
(segundos). La constante de tiempo, , es el tiempo que ha de transcurrir para que el sistema,
empezando desde sus condiciones iniciales, llegue aproximadamente al 63% del valor final, la
asntota (V
0
). Esto se deduce asignando a la variable tiempo el valor : se obtiene V(t) = V
0
(1
exp(-/)) = V
0
(1 exp(-1)) = V
0
(1 1/e). El valor de e (la constante de Euler) es 2.718..., por
lo tanto 1/e 0.37, es decir 1-1/e 0.63. La Figura 4.5 muestra dos ejemplos de curvas
exponenciales (o relajaciones exponenciales), que empiezan en ambos casos desde el valor 0

Figura 4.4
15
y tienen como asntota 1 (en unidades
arbitrarias); es decir, ambas estn
descritas por la ecuacin V(t) = 1
exp(-t/), pero en un caso (curva azul
punteada) la constante de tiempo, , es
0.5 (unidades de tiempo arbitrarias).
Por lo tanto, cuando t= 0.5 entonces V
habr llegado al 63% de su valor
asinttico. Para el otro caso (curva roja
continua) = 1, y por consiguiente ese
es el tiempo que ha de transcurrir para
que el valor de V llegue a 0.63. Esto
nos dice que una transicin abrupta en
el voltaje de entrada, solo producir un
cambio gradual en la salida. Si en lugar
de un paso sostenido se aplicara un
breve impulso (e.g. ms corto que la constante de tiempo), la salida no alcanzara a cambiar
mayor cosa, y la amplitud de la seal resultante ser por lo tanto significativamente atenuada.
Una transicin de por si lenta y sostenida, en cambio, no se ver afectada por la limitante de la
lentitud del circuito en responder, y entonces no sufrir atenuacin considerable. Hemos creado
un filtro pasa-bajos: una seal oscilatoria de alta frecuencia ser atenuada (rechazada) pero
una de baja frecuencia (es decir, cuyos ciclos son lentos) pasar sin mayor prdida de
amplitud. La discriminacin entre cuales frecuencias pasan o se rechazan depende, por
supuesto, de la constante de tiempo. Si invirtiramos las posiciones de R y C en el circuito, el
efecto ser opuesto: seales sostenidas no pasan (una vez C est cargado no hay ulterior
movimiento de cargas: por lo tanto, si no hay corriente por R, no habr voltaje entre sus
terminales), seales lentas pasarn con mucha atenuacin, mientras las rpidas no tendrn
inconveniente alguno. Esto sera un filtro pasa-altos. Los controles de tono (Bajos y Altos) de
un equipo de sonido son precisamente filtros ajustables, por medio de los cuales el usuario,
cambiando con una perilla el valor de una resistencia conectada a un condensador, puede
atenuar o enfatizar distintas bandas de frecuencia, es decir, sonidos graves y sonidos agudos.
Ms adelante se ver que la capacitancia es una propiedad elctrica de gran relevancia a la
biologa, ya que encontraremos a menudo instancias en las cuales dos medios conductores en
un tejido se encuentran separados por una muy delgada capa de aislante cuya superficie de
rea es considerable (la membrana celular es el ejemplo ms obvio). Combinada con la
resistencia de diferentes componentes del tejido, tambin se constituyen filtros de frecuencia en
las clulas. Este concepto subyace propiedades esenciales que determinan la forma como, por
ejemplo, clulas del sistema nervioso son capaces de procesar seales elctricas rpidamente
en algunos casos, o integrar lentamente la informacin en otros. Tambin es un factor
importante en las tcnicas de medicin elctrica, ya que si alguna resistencia de alto valor y
alguna capacitancia se interponen entre la seal a ser medida y el aparato que las mide, sus
caractersticas temporales se vern afectadas. En algunas instancias, estos efectos son
indeseados, ya que distorsionan las seales elctricas que se quieren examinar; en otros
casos, como se ver ms tarde, la modificacin es deliberada y pretende bien sea eliminar
interferencias o resaltar ciertas caractersticas de la seal.

Figura 4.5
16
5. Impedancia

Las consideraciones anteriores sugieren que en un circuito que contenga tanto resistencias
como condensadores, la corriente que fluye no depender solamente de la magnitud del voltaje
aplicado, sino adems de sus caractersticas temporales. Por lo tanto, el concepto de
resistencia entre dos puntos, tal como se haba presentado, ya no se aplica en un sentido
estricto: por ejemplo, un cierto circuito podr fcilmente permitir el flujo de una corriente (i.e.
ofrecer baja resistencia) en respuesta a un voltaje dado si este se mantiene constante, pero no
si vara rpidamente (en cuyo caso aparecera como un medio de alta resistencia), o viceversa.
Claramente, un simple nmero ya no basta para caracterizar que tan fcilmente fluye corriente
por un medio o un circuito dados. Esto nos lleva a la nocin de impedancia, lo cual constituye
una generalizacin del concepto de resistencia: la impedancia elctrica, usualmente
representada por la letra Z, ya no es un numero, sino una funcin que depende de la frecuencia
de oscilacin del voltaje que se aplica (asumiendo que los cambios son sinusoidales), es decir
Z(f). Para cada frecuencia, la impedancia estar dada por el cociente entre la magnitud del
voltaje y la de la corriente resultante (anlogo a la ley de Ohm, solo que especificada
separadamente para cada frecuencia). Pero hay una complejidad adicional: hemos visto que la
presencia de una capacitancia resulta en un desplazamiento de fase entre voltaje y corriente.
En el caso de un condensador solo, el desplazamiento es de 90 (/2): Entonces una
descripcin de la corriente que fluye por un circuito que solamente tome en cuenta la magnitud
de la corriente para cada frecuencia de voltaje aplicado es insuficiente: hace falta adems
especificar el tamao de cualquier corrimiento temporal entre voltaje y corriente, es decir, el
desplazamiento de fase que puede ocurrir a cada frecuencia. Por lo tanto la impedancia tiene
que especificar dos nmeros para cada valor de la frecuencia, y por consiguiente representa
dos funciones. Si uno analizara un filtro (por ejemplo, el filtro pasa-bajos considerado
previamente), se podra caracterizar enteramente su comportamiento conociendo la atenuacin
y el desplazamiento de fase que sufre un sinusoide aplicado a su entrada, en funcin de la
frecuencia de oscilacin del mismo.

De que nos sirve determinar el valor de la impedancia en un sistema biolgico? Posteriormente
consideraremos la conduccin elctrica en los tejidos y fluidos biolgicos, y veremos que
algunos constituyentes se comportan como una simple resistencia, mientras que otros solo
pueden mediar transitoriamente un desplazamiento de carga local cuando cambia el voltaje, tal
como lo hace un condensador. El anlisis de la impedancia nos permite discernir, entre otras
cosas, la presencia y la predominancia de lo uno vs. el otro, y sus caractersticas, con lo cual
uno deriva informacin valiosa sobre la constitucin estructural de un tejido, de una clula, o de
sus componentes. De hecho, fue este tipo de acercamiento que proporcion alguna evidencia
de que las clulas deban poseer una delgada capa aislante (la membrana) que separara los
fluidos intra-celulares y extra-celulares. En una de las tantas aplicaciones prcticas de estos
conceptos, se han desarrollado mtodos que, midiendo la impedancia elctrica de los tejidos,
permiten estimar el porcentaje de grasa corporal de un individuo, lo cual es til como criterio
diagnstico sobre su estado nutricional y para formular estrategias de modificacin de dieta.
17
6. Medios electrolticos

Hasta el momento se ha considerado la conduccin elctrica en metales, pero una corriente
puede darse en cualquier medio en el cual existan cargas y stas se encuentren en relativa
libertad de desplazarse bajo la influencia de un campo elctrico. El plasma, un gas en el cual
floten molculas ionizadas es un ejemplo (como ocurre al interior de una lmpara de nen).
Esto ocurre tambin en ciertos lquidos, en los cuales estn disueltas molculas que lleven una
carga elctrica neta, como por ejemplo en los fludos biolgicos tanto en el interior de las
clulas como en los intersticios y espacios extracelulares.

Dipolos elctricos, solventes polares, coeficiente dielctrico. La razn por la cual en un medio
acuoso pueden estar disueltas partculas cargadas es que el agua es un solvente polar. Esta
propiedad hace referencia al hecho de que las molculas de agua, aunque elctricamente
neutras, son alargadas y manifiestan una distribucin asimtrica de su nube electrnica, la cual
es ms densa alrededor del oxgeno (ms electronegativo), como muestra la Figura 6.1A. Esto
confiere una carga negativa a esta regin de la molcula, mientras que los dos protones de los
hidrgenos quedan neutralizados de una manera incompleta y por lo tanto mantienen una
carga neta positiva (Figura 6.1B).
La separacin espacial de las dos
regiones con carga opuesta
confiere a la molcula de agua
propiedades de un dipolo elctrico:
la aplicacin de un campo elctrico
no produce una fuerza neta ni una
migracin, ya que la carga total de
la molcula es cero, pero aplica un
torque (T = E, donde es el
momento dipolo, definido como el
producto de la carga y la distancia
que la separa, = rq), el cual re-
orienta la molcula, alinendola
con el vector del campo elctrico. Esto hace que una partcula cargada disuelta en un medio
acuoso pueda encontrarse en una situacin energticamente favorable, rodeada de molculas
de solvente apropiadamente alineadas, apuntando hacia su centro de carga y neutralizndola
parcialmente. A nivel macroscpico, la presencia y magnitud de un momento dipolo en las
molculas del medio se traduce en el coeficiente dielctrico, . Molculas polares y ionizadas
se disuelven fcilmente en un solvente con alto coeficiente dielctrico como el agua (80); en
cambio, molculas no-polares lo haran con dificultad, porque interferiran con las interacciones
electrostticas entre las molculas del solvente, y tendern por lo tanto a agregarse y formar un
precipitado insoluble. Por ejemplo, en agua el cloruro de sodio (NaCl; Figura 6.1C) se disocia
en Na y Cl, pero el cloro, siendo ms electronegativo, retiene un electrn extra, y adquiere una
carga neta negativa (Cl
-
, un anin). Recprocamente, el sodio queda corto de un electrn y
tendr por lo tanto una carga neta positiva (Na
+
, un catin). Ambos constituyentes se
encontrarn en una situacin energticamente favorable, rodeados de molculas polares
orientadas apropiadamente para neutralizar su carga (la as llamada concha de hidratacin;
Figura 6.1D).
Ahora podemos considerar que ocurre con la conductividad de un medio acuoso. En principio,
uno dira que si se trata de agua pura, la conductividad debera ser nula, por ser las molculas
de H
2
O elctricamente neutras y por lo tanto incapaces de migrar en respuesta a un campo

Figura 6.1
18
elctrico y mediar una corriente. Pero realmente, adems de H
2
O, el agua contiene una
cantidad finita de protones libres (H
+
) y de hidroxilos (OH
-
) debido al equilibrio de la reaccin:
H
2
O H
+
+ OH
-

El pH representa log([H
+
]), donde la concentracin de protones est dadas en molares
(mol/litro). Por lo tanto a pH neutro = 7 la concentracin de protones es 10
-7
M o 0.1 M (una
deci-millonsima de molar); lo mismo con los hidroxilos. Tanto los protones como los hidroxilos
son cargados (i.e. son iones) por lo tanto confieren al agua propiedades de conductor. Pero a
pH neutro (lo cual es inevitable si se trata de agua pura, porque se disocia el mismo nmero de
H
+
y de OH
-
) su concentracin es muy baja, y por consiguiente la conductividad elctrica es
muy modesta (i.e. alta resistividad): 18 Mcm. Pero si el pH fuera, por ejemplo, muy acdico,
digamos pH=3 (lo cual implica aadir algn cido, por ejemplo HCl), ya se tendra un milimolar
de protones libres, lo cual constituye una concentracin apreciable y determina una
conductividad significativa. El mismo efecto se obtendra si disolviramos una buena cantidad
de sal (NaCl): sta de disociara en iones de sodio (Na
+
) y de cloruro (Cl
-
), los cuales
incrementaran significativamente la conductividad. Los fludos intra- y extra-celulares contienen
gran cantidad de iones disueltos (totalizando casi 300 mM en un mamfero, y mas de 1M en un
animal marino), y esto implica que estamos tratando con medios de alta conductividad,
propicios para mediar fenmenos elctricos. Otras sustancias como la sacarosa (C
12
H
22
O
11
)
tambin se disuelven en agua, pero sus molculas no se disocian, y al quedar intactas son
elctricamente neutras; por lo tanto la conductividad de la solucin no incrementa.
Clarificacin de las diferencias entre conduccin en metales y electrolitos. En resumen,
mientras en metales la matriz de tomos es fija y la nica manera de tener movimiento de
carga es desplazando electrones, en lquidos no hay una estructura fija de la materia: las
molculas mismas, tanto de solvente como de soluto, son mviles y capaces de desplazarse
por difusin. Por lo tanto, la conduccin elctrica ocurre con el desplazamiento de molculas
enteras que posean una carga neta (iones). Podemos fcilmente ver cuales factores
determinan la resistividad/conductividad de un medio electroltico. En primer lugar, es obvio que
la concentracin inica de la solucin va a jugar un papel importante: entre ms disponibilidad
partculas cargadas, ms corriente puede fluir bajo un voltaje dado. Segundo, la movilidad de
los iones es determinante: evidentemente una molcula pequea experimentar menor friccin
al desplazarse por un medio que tiene cierta viscosidad, y por lo tanto puede fluir ms
fcilmente (su coeficiente de difusin ser mayor). Finalmente, entre ms grande la carga
elctrica neta que lleva la molcula en cuestin - i.e. ze, z siendo la valencia y e la carga
elemental - mayor la fuerza que experimentarn al aplicarse un campo elctrico. Los ltimos
dos factores a menudo suelen juntarse en un solo parmetro, denominado la movilidad

electrofortica.

Aislantes en sistemas electrolticos: Una interfase entre un compartimiento acuoso y un medio
no polar acta como una barrera para el movimiento de los iones que estn disueltos en el
medio acuoso (i.e. partculas cargadas tendern a no penetrar el medio no-polar). La clula
esta delimitada por una membrana (plasmalema) constituida por una capa de fosfolpidos;
stos se componen de un cido graso, con su doble cadena de hidrocarbonos, enlazado a un
glicerol, el cual, a su vez, se une a otra molcula (serina, colina, etanolamina, etc.). Debido a su
naturaleza anfiptica, con la cabeza polar y las dos cadenas hidrofbicas, en un medio polar
como el agua los fosfolpidos pueden asumir pocas configuraciones energticamente estables,
en las cuales las cadenas aclicas de distintas molculas se juntan entre si y exponen al medio
acuoso las cabezas polares; configuraciones posibles son micelas y bicapas planas (es decir,
una doble capa que expone las cabezas polares a los dos lados) cerradas en forma de
19
vescula. sta ltima configuracin permite la creacin de compartimentos separados en
sistemas electrolticos: no solamente queda la clula delimitada por dicha membrana, sino
tambin se pueden crear sub-compartimentos internos que ejercen funciones especializadas
dentro de la clula y requieren estar separados del resto del citoplasma. La membrana impone
una barrera difusional para los iones, que difcilmente abandonaran un ambiente polar
(coeficiente dielctrico 80) para insertarse en la fase hidrofbica de la membrana (2-3).
Puesto que los iones son los que median toda transferencia de carga elctrica en una solucin,
desde el punto de vista elctrico las membranas biolgicas funcionan como aislantes, y por lo
tanto entre el interior y el exterior de la clula existe una barrera elctrica de alta resistencia (la
resistencia de la membrana, R
m
).

Ahora que sabemos que los fenmenos elctricos en medios electrolticos representan la re-
distribucin de iones, a menudo querremos cuantificar el flujo de molculas a partir del tamao
de la corriente o, viceversa, conociendo el movimiento de una cierta especie de molculas
tendremos la necesidad de calcular cuanta corriente eso representa. La constante de Faraday
(96500 coulmol
-1
) y el nmero de Avogadro (N
o
610
23

partculas/mol) permiten convertir
entre cantidades elctricas y qumicas, haciendo posible el clculo del nmero de partculas
implicadas en un fenmeno elctrico (o viceversa). Por ejemplo, si fluye una corriente de 0.1 A
(es decir, 0.1 Coul/s), al dividir por la constante de Faraday sabramos que es equivalente a
0.1/96500 mol/s de iones monovalentes. Multiplicando por N
o
podramos determinar cuantos
iones/segundo estn fluyendo.

La importancia de los fenmenos elctricos en medios electrolticos es enorme: a travs de la
membrana de toda clula existe un voltaje significativo (negativo en el interior, respecto a los
fluidos extracelulares), y cambios en este voltaje constituyen el principal sistema de transmisin
de informacin a distancia, y sirven tambin para gatillar un sinnmero de procesos celulares,
desde la liberacin de mensajeros qumicos, hasta la contraccin de fibras musculares. La
consideracin fundamental que nos permite esclarecer la naturaleza de estos fenmenos bio-
elctricos es que los iones, siendo partculas disueltas en un medio lquido y portadoras de una
carga elctrica neta, son susceptibles a dos determinantes que pueden inducir su movimiento:
por una parte, como todo soluto en un fluido, tienden a desplazarse de regiones del espacio
donde se encuentren en alta concentracin hacia regiones donde su concentracin sea menor.
La ley de Fick formaliza esta relacin:
J = -DdC/dx
Donde J es el flujo de partculas (en molss
-1
cm
-2
), dC/dx es la rata de cambio de la
concentracin en el espacio), y D una constante positiva, llamada el coeficiente de difusin. En
otras palabras, el flujo difusional de partculas es proporcional al gradiente de concentracin; el
signo negativo simplemente recalca el hecho de que el movimiento se dar en la direccin en la
cual la concentracin va disminuyendo. Por otra parte, el movimiento de iones es tambin
influenciado por fuerzas elctricas, es decir el gradiente del potencial elctrico en el espacio, y
los factores que determinan qu tanto dichas fuerzas elctricas se traducen en movimiento del
soluto: su valencia (cuanta carga lleva cada molcula), su concentracin, y la facilidad con la
cual las partculas se pueden desplazar en dicho medio (el tamao de las partculas y la
viscosidad del medio, que determinan las fuerzas de friccin). Cada vez que existen diferencias
de concentracin de un tipo de soluto inico, el movimiento que resulta lleva a un re-arreglo de
cargas, y por lo tanto corrientes elctricas y cambios en el potencial elctrico en diferentes
puntos del espacio. Viceversa, cada vez que fuerzas elctricas impulsan el movimiento de
partculas ionizadas, se engendran cambios en su concentracin en dicho dominio espacial.
Consideremos dos compartimientos acuosos separados por una barrera. Imaginemos que en el
lquido se haya disuelto alguna sal, la cual se disocia en cationes y aniones, y que la
20
concentracin en los dos
compartimientos fuera diferente. Por
ejemplo, podramos tener 100 mM de
KCl en el lado izquierdo y 10 mM de
KCl en el lado derecho (Figura 6.2,
panel de la izquierda). Asumamos
adems que la barrera fuera
selectivamente permeable a una sola
de las dos especies inicas, por
ejemplo, al potasio (los motivos
detallados trascienden los propsitos de este curso, pero tienen que ver con la presencia en la
membrana de molculas especializada en transportar solutos de un lado al otro, pero capaces
de discriminar cuales especies tendrn paso, y cuales no podrn translocarse). Debido a la
diferencia de concentracin, la ley de Fick predice que habr un movimiento difusional del lado
izquierdo al lado derecho, pero esto solamente se aplica al K
+
, ya que el Cl
-
no puede. Pero
puesto que el potasio es positivamente cargado, cada vez que un K
+
se desplaza, el
compartimiento izquierdo pierde una carga elctrica positiva y queda por lo tanto
electronegativo, mientras que el derecho gana una carga positiva y se torna ms positivo (panel
de la derecha). Este desbalance de carga no es compensado, ya que el cloruro, pese a
experimentar el mismo gradiente de concentracin, no puede cruzar la barrera. Entre mayor el
flujo de potasio, mayor la diferencia de potencial elctrico que se establece entre los dos
compartimientos. Pero este voltaje repercute a su vez sobre el movimiento de potasio: entre
ms grande, ms la electronegatividad del compartimiento de la izquierda tiende a retener los
iones de potasio (que son positivos) mientras que el de la derecha tiende a repelerlos. Llegar
el punto en el cual la diferencia de potencial contrabalancear el gradiente de concentracin:
tendencias difusionales y fuerzas elctricas sern iguales y opuestas y los iones de potasio se
encontrarn en equilibrio, y dejarn de producir un flujo neto. Esta situacin se conoce como
Equilibrio de Nernst, y el voltaje que balancea el gradiente de concentracin para un in dado
es el potencial de Nernst para ese in. Esto se expresa cuantitativamente por la ecuacin de
Nernst (cuya derivacin trasciende los propsitos de esta exposicin):

E
x
= RT/zFln([X]
e
/[X]
i
)

E
x
representa el potencial de equilibrio del in X, R es la constante universal de gases, T la
temperatura absoluta, z la valencia del in en cuestin, F la constante de Faraday (la carga
contenida en un mol de un in monovalente, ln el logaritmo natural, [X]
e
y [X]
i
la concentracin
externa e interna del in. Las consideraciones anteriores implican que, si existen
concentraciones desiguales a los dos lados de una particin semi-permeable, se puede llegar a
la creacin de un potencial elctrico estable, engendrado por movimientos selectivos,
impulsados por difusin a lo largo de un gradiente de concentracin. En las clulas sucede algo
muy similar: la concentracin de distintos iones en el interior vs. el exterior es diferente, gracias
a la accin de molculas llamadas bombas inicas. Justamente, el potasio se acumula en el
interior alcanzando un gradiente de concentracin de 40, mientras el sodio y el calcio son
extrudos y por lo tanto se encuentran a mayor concentracin en el exterior; ms an, la
membrana celular, aunque generalmente impermeable a molculas polares y cargadas, deja
sin embargo pasar potasio (pero no sodio ni tampoco calcio, por lo menos en el estado de
reposo). El xodo del potasio del interior de la clula engendra un gradiente de potencial
elctrico, el potencial de reposo, que es negativo adentro porque tiende hacia el equilibrio de
Nernst de este in. Esto ocurre prcticamente en la totalidad de las clulas animales conocidas.
Ms an, si en otro momento otros iones (por ejemplo, sodio o calcio) se volvieran
transitoriamente permeantes, se engendraran movimientos netos que tenderan a alterar el
Figura 6.2
21
potencial elctrico a travs de la membrana, desplazndolo hacia el potencial de equilibrio de
estos otros iones. De esta manera la clula es capaz no solamente de mantener un potencial
negativo sostenido en estado de reposo, sino tambin de generar cambios elctricos en
respuesta a diferentes estmulos. Esta es la base, por ejemplo, de la sealizacin elctrica que
subyace la actividad del cerebro o de los msculos.
22
7. Electroforesis
Podemos brevemente considerar una de las tantas aplicaciones de los principios de
electricidad en sistemas electrolticos, donde la conduccin elctrica es mediada por molculas
enteras ionizadas y por lo tanto la aplicacin de un voltaje causa su migracin. La
electroforesis consiste en el desplazamiento de una partcula cargada bajo la influencia de
fuerzas elctricas, y tiene considerable relevancia a las ciencias biolgicas.

Separacin de molculas
La aplicacin ms tpica concierne la separacin de macromolculas que se encuentren
mezcladas en una muestra; esto se basa en que si distintos compuestos depositados en un
punto de un medio migran a velocidades diferentes, entonces al cabo de un cierto tiempo
habrn recorrido distancias diferentes y por lo tanto se habrn separado unos de otros. Este
acercamiento puede servir bien sea para ayudar la identificacin e inclusive la cuantificacin de
constituyentes presentes en la mezcla (electroforesis analtica) o bien para su purificacin para
uso posterior (electroforesis preparativa). En esta breve introduccin se enfatizarn solamente
los fundamentos elctricos de la tcnica, no los aspectos bioqumicos. Por supuesto, es
imprescindible que las molculas en cuestin posean una carga elctrica neta, lo cual puede
ocurrir naturalmente en el caso de muchos tipos de sustancias, o puede requerir el uso de
algn compuesto exgeno que se adhiera a ellas y les confiera una carga. Los determinantes
fundamentales de la velocidad de migracin en un campo elctrico dado son (i) la carga de la
molcula (la cual dictamina la fuerza ejercida sobre ella por el campo: F = Eq, donde F es la
fuerza, E el campo elctrico y q la carga) y (ii) su tamao (el cual establece una fuerza de
friccin que se opone al movimiento). De esto se desprende que una molcula puede migrar
ms rpidamente que otra bien sea porque tuviera una mayor carga elctrica, o bien porque
an teniendo la misma carga su tamao fuera menor, lo cual facilita el desplazamiento; por
consiguiente, aunque podramos fcilmente lograr la separacin elctrica entre especies
moleculares, desconoceramos el porqu (es decir, cuales propiedades de las diferentes
sustancias son responsables por esa separacin). Ms an, el mismo campo elctrico podra
producir la migracin de diferentes molculas en direcciones opuestas, si la polaridad de su
carga es tambin opuesta. Claramente hace falta imponer algn orden para que el concepto de
electroforesis se vuelva de utilidad prctica. La aplicacin ms comn pretende separar
molculas segn su masa y para lograrlo hace falta tomar dos medidas. Un primer paso es
cerciorarse de que las diferentes molculas no difieran de una manera caprichosa en cuanto a
su carga elctrica, sino posean una carga neta de la misma polaridad, que sea proporcional a
su masa. Esto sucede naturalmente en polmeros cuyos elementos constituyentes (i.e. los
monmeros) tienen una carga y un tamao ms o menos fijos (por ejemplo, las cadenas de
cidos nuclicos, ADN y ARN, las cuales estn constituidas por nucletidos que son aninicos
y de peso molecular similar). En cambio, en las protenas la composicin de aminocidos vara
mucho, y stos a su vez pueden diferir drsticamente tanto en la carga neta (que puede ser
positiva, negativa o neutra) como en el peso molecular (desde 75 Dalton para glicina, hasta 204
Da para triptfano). Para obviar este problema, se aplica un detergente aninico, sodio dodecil
sulfato (SDS), que se combina con las protenas en una relacin prcticamente constante: 1.4
gramos de SDS por cada gramo de protena. La carga introducida por el SDS es (i)
cuantitativamente mucho mayor que toda carga endgena que poseyera inicialmente la
protena, y (ii) proporcional a la masa del polipptido; por consiguiente, se obtiene una
poblacin de protenas modificadas que son todas negativamente cargadas (cualquier carga
positiva habr sido abrumada por las cargas negativas mucho ms numerosas del SDS
adsorbido), y con una relacin carga-masa aproximadamente constante. Esta primera medida
sirve para uniformar la carga elctrica de las protenas, pero no nos ayuda a separarlas, ya que
la constancia del cociente carga-masa hace que la movilidad de diferentes molculas tender a
23
ser la misma: las ms grandes son las que experimentan la mayor fuerza elctrica, pero
tambin sufren mayor friccin con el medio, y viceversa. Para obviar este inconveniente se
introduce entonces un medio que proporcione un impedimento diferencial a molculas de
diferentes tamao: en lugar de un lquido, se usa alguna matriz cuya textura dificulte ms el
paso de molculas grandes: por ejemplo, un gel,
constituido por una telaraa de algn polmero (tal
como acrilamida o agarosa), con los intersticios
ocupados por un lquido conductivo. Ahora las
molculas se vern selectivamente retardadas en su
migracin dependiendo de su tamao, y, debido a sus
diferentes velocidades, al cabo de un determinado
perodo se encontrarn segregadas en posiciones
distintas (Figura 7.1). La comparacin con la
migracin de molculas de referencia cuya masa sea
conocida permite asignar un peso molecular a las
molculas que se han separado en la muestra.
Tambin es posible recoger solamente una poblacin
de molculas de cierta masa, una vez separadas de las dems, y obtener por lo tanto su
purificacin.

Consideremos las fuerzas que empujan la migracin electrofortica. Es importante recalcar
que, para una carga dada, la fuerza elctrica depende del campo, el cual a su vez es el
gradiente del potencial; en otras palabras, la fuerza depende de que tan rpidamente va
cambiando el potencial al desplazarse en el espacio (i.e. la derivada espacial del potencial,
dV/dx). No es lo mismo aplicar un voltaje de 10 V entre dos puntos separados por una distancia
de1 cm, vs. de 10 cm: a pesar de que la diferencia de potencial es la misma en los dos casos,
el campo elctrico (y por lo tanto las fuerzas ejercidas sobre partculas cargadas) ser 10 veces
mayor en el caso de la distancia corta (la pendiente del voltaje es ms empinada).

Hay dos maneras de implementar una separacin electrofortica: por voltaje constante, o por
corriente constante; cada uno de los dos acercamientos presenta ventajas y desventajas. En el
primer caso la fuente de poder se encarga de mantener una diferencia de potencial fija (el
voltaje, V) entre los extremos del medio (el cual, como se ha dicho, suele ser un gel). En el
segundo caso, la fuente de poder impone un flujo de corriente pre-determinado (I) a travs del
medio. Aqu el voltaje que resulta depende, por la ley de Ohm, de la resistencia del medio: V =
IR; para una corriente dada, entonces, el voltaje ser mayor si el medio es de alta resistencia.
La resistencia, recapitulando conceptos presentados en una seccin anterior, crece con la
longitud del recorrido por el medio resistivo, y decrece con el rea de seccin del mismo: R =
L/A. Es importante tener en claro el impacto de diferentes parmetros elctricos para lograr el
objetivo y evitar percances: (i) se necesita un campo elctrico de intensidad apropiada para
impulsar la migracin de molculas cargadas, y (ii) se quiere evitar excesiva disipacin de
energa en calor, lo cual podra perjudicar la integridad de la muestra y/o del medio mismo.
Recordemos que la disipacin de energa (medida en vatios, y simbolizada por la letra W) es el
producto de corriente y voltaje: W = IV. Pensemos en casos prcticos: usualmente la
separacin electrofortica se lleva a cabo por un medio cuya geometra es un paraleleppedo
(Figura 16) que tiene una longitud considerable (muchos centmetros) en la direccin del campo
que se aplica; esto permite que las diferentes clases de molculas puedan llegar a distanciarse
significativamente unas de otras. Por otra parte, el espesor del medio (y por lo tanto el rea de
seccin) es muy modesto (0.5 a 5 mm); conjuntamente, estos dos parmetros se traducen en
una alta resistencia longitudinal. Si uno opta por usar voltaje constante, ste suele ser
considerable (tpicamente > 100 V), para poder engendrar un campo aceptablemente intenso

Figura 7.1
24
(voltaje/distancia). Si uno prefiere corriente constante, sta en cambio tendr que ser modesta
(milliamperios), porque al cruzar un medio de tan alta resistencia an una corriente pequea
genera un voltaje grande (V = IR). Ambos parmetros, adems, han de cumplir con el requisito
de que la disipacin de energa no sobrecaliente el medio (por ejemplo si tenemos 120 V y 20
mA, se disipan 24 W, lo equivalente a un bombillo de baja potencia; si en cambio, para acelerar
la migracin, subiramos mucho el voltaje y la corriente, podramos llegar a tener una
disipacin en calor de muchas decenas o cientos de vatios, que llevara a una enorme
elevacin de temperatura y la consecuente destruccin de la muestra y del gel y tal vez
tambin de la fuente de poder!

La electroforesis no se utiliza solamente para separar molculas; el experimentador puede
tambin estar interesado en transferirlas a otro medio una vez lograda su separacin por
tamao (por ejemplo, hacindolas migrar a una membrana de nitrocelulosa o de nylon). En este
caso, se pondra el gel en contacto con la membrana y se aplicara un campo elctrico en la
direccin del espesor del gel (es decir, transversalmente, entre las caras anchas del
paraleleppedo). Aqu no hace falta un gran voltaje, ya que el campo resultante ser intenso
debido a la corta distancia a travs de la cual se aplica V; en modalidad de corriente constante,
en cambio, el valor de I deber ser considerable para lograr producir un voltaje an modesto,
porque en esta direccin la resistencia es muy baja (ahora en la frmula R = L/A la distancia L
es pequea y el rea de seccin A es grande).

Hay muchas variantes de la electroforesis, y sus derivaciones conceptuales exceden los
objetivos de esta resumida introduccin; cabe solo mencionar que la composicin del medio
puede ser no homognea en cuanto a conductividad elctrica (lo cual engendra campos
localmente diferentes, puesto que V = IR); puede ser no-homognea en cuanto a impedimentos
mecnicos (i.e. un gel progresivamente ms tupido); y puede implicar gradientes de pH, que
cambian la carga neta en las protenas (dependiendo si se le pega o no un protn); finalmente,
pueden aplicarse secuencialmente campos elctricos orientados en ms de una direccin, para
obtener una separacin ms fina de las molculas en cuestin.

Micro-ionoforesis
Una segunda aplicacin es el uso de fuerzas elctricas para lograr la aplicacin controlada de
diminutas cantidades de una molcula dada, siempre y cuando sta posea una carga neta (es
decir, est ionizada). El principio es simplemente que si se toma una micro-pipeta y se llena
con una solucin de la sustancia en cuestin, al pasar una corriente elctrica entre la pipeta y el
bao externo esta corriente necesariamente refleja la migracin de molculas, que va a incluir
la eyeccin de la sustancia de inters (si la polaridad de la corriente es correcta!) En una
primera aproximacin, el flujo obedece la Ley de Faraday:
J ( mols
-1
) = nI/zF
I es la corriente, z la carga de la molcula en cuestin, F la constante de Faraday (si corriente
se mide en amperios = couls
-1
y F = coulmol
-1
, entonces I/zF es nmero de mol de carga z
que fluye por segundo) . El parmetro n se conoce como el nmero de transporte y representa
la fraccin total de la corriente que es llevada por la molcula de inters: por supuesto sta no
ser la nica clase de molcula ionizada en la pipeta (debe existir un contra-in, para respetar
la condicin de electro-neutralidad) ni en el bao externo. Por consiguiente, la corriente total
implica la movilizacin tambin de otras especies; molculas que se desplacen con mayor
facilidad (por ejemplo, por ser pequeas y/o con una gran carga elctrica) o que estn
presentes en grandes concentraciones harn una contribucin dominante al flujo total. Por lo
tanto, es imprescindible poder cuantificar cual porcin de la corriente es llevada por la sustancia
25
que se quiere aplicar. Pero una vez se conozca dicho parmetro, esta tcnica brinda la
oportunidad de producir inyecciones finamente controladas (por ejemplo, al interior de una
clula individual), de una forma que sera difcil de lograr por aplicacin a presin.
26
8. Mediciones bio-elctricas e instrumentacin

El esta seccin se mirarn de una manera elemental los principios tcnicos que hacen posible
medir fenmenos bioelctricos generados por muchos tipos de clulas del organismo.

Medicin de voltaje.
Todo acercamiento a medir una variable se esmera para no alterar significativamente la
variable que pretende cuantificar, de lo contrario el resultado obtenido es ficticio. Lo mismo es
vlido en las mediciones elctricas. En el caso del voltaje, sabemos que una diferencia de
potencial elctrico entre dos regiones en el espacio implica que existe una distribucin
asimtrica de carga elctrica. Si no se quiere perturbar este estado de cosas, el sistema
utilizado para medir, compuesto por el voltmetro o electrmetro y las dos sondas que
establecen contacto elctrico con los dos puntos en cuestin, no
deben proporcionar un camino por el cual esas cargas
encuentren la manera de fluir y re-distribuirse. Esto implica que
el voltmetro debe tener una resistencia interna (R
in
) muy alta.
Las sondas simplemente se colocan a contacto de los dos
puntos del circuito, cuya diferencia de potencial se quiere medir
(Figura 8.1). Este instrumento, estrictamente hablando, mide el
voltaje presentado a su entrada, no el valor que existe en el
punto donde la sonda hace contacto con la muestra; por lo
tanto, las sondas deben garantizar buen contacto elctrico con
la muestra, y su resistencia debe ser mucho menor que la
resistencia interna del voltmetro, de lo contrario se forma un
circuito de divisor de voltaje (repasar el concepto, presentado
anteriormente!), y por consiguiente el voltaje reportado por el
voltmetro sera solamente una fraccin del voltaje verdadero. La
Figura 8.2 ilustra el problema, suponiendo que una de las dos
sondas (usualmente un simple cable de muy baja resistencia),
tuviera en cambio una resistencia considerable (R
s
). En la
entrada 1 del voltmetro (IN
1
) el voltaje experimentado por el
instrumento ya no ser el valor que se tiene en el punto que se
quera medir (A), sino un valor modificado por el cociente entre la
resistencia de acceso y la resistencia total del sistema. En
circunstancias normales estas consideraciones son innecesarias,
ya que las sondas son unos cables que conducen muy bien la
electricidad. Pero en ciencias bio-medicas este problema surge
cuando se miden potenciales en dominios microscpicos, porque
en esos casos la sonda tambin necesita ser muy fina, y por
consiguiente su diminuta rea de seccin implica una muy alta
resistencia elctrica (repasar seccin sobre resistencia!) que podra llegar a niveles
comparables a la del instrumento (que, como ya sabemos, de por s debe ser alta), y generar
una divisin de voltaje. En una seccin posterior se considerar el caso de mediciones del
voltaje que existe a travs de la membrana celular, con lo cual es imprescindible insertar un
electrodo de minsculas dimensiones en el interior de una clula individual. Para estas
aplicaciones es entonces indispensable que la entrada del instrumento utilice un tipo de
transistor especial (llamado transistor de efecto de campo, o FET) que tiene una resistencia de
entrada extraordinariamente alta (billones de Ohms) y por lo tanto seguramente mayor que la
de un microelectrodo, por fino que sea. Notar tambin que el sistema de medicin se introduce
sin alterar el circuito en cuestin, es decir, se aade en paralelo a ste.

Figura 8.1

Figura 8.2
27
Medicin de corriente
Para medir la corriente que fluye por un cierto tramo de un
circuito (incluyendo tejidos, etc.) es imprescindible saber que
toda esa corriente pase por el instrumento (llamado
ampermetro) y esto requiere abrir el circuito en cuestin (el
corte que en la Figura 8.3 se representa por la lnea
punteada) e introducir las sondas y el ampermetro como
nico camino posible: en otras palabras, se trata de introducir
el instrumento en serie con el circuito, desviando el flujo
original de corriente. Adems, se quiere que el instrumento
no altere la cantidad de corriente que fluye normalmente, y
por consiguiente su resistencia debe ser lo ms baja posible
(lo opuesto que para voltaje).

Amplificacin
Las seales elctricas relevantes en un contexto biolgico suelen ser muy pequeas: los
voltajes trans-membrana no alcanzan una dcima de voltio, mientras que los potenciales
extracelulares son del orden de fracciones de milsima de voltio. Por otra parte, las corrientes
elctricas generadas por las clulas y los tejidos son igualmente diminutas: millonsimas a
billonsimas de amperio (la nica excepcin est dada por los rganos elctricos de algunos
organismos acuticos, que usan fuertes descargas para poner fuera de combate a presas y
enemigos). As que poder agrandar seales bioelctricas es una necesidad, y el uso de
amplificadores es pan de cada da para muchas reas de la fisiologa. Un amplificador, en
esencia, es un aparato que presenta dos entradas y una salida; el voltaje que se produce en la
salida es proporcional la diferencia de voltaje aplicado a las dos entradas, multiplicado por un
factor de ganancia, G:
V
out
= (IN
+
- IN
-
)G
Se acostumbra representar un amplificador simblicamente como un tringulo, como ilustra la
Figura 8.4 (la designacin + y - de las dos entradas solo
sirve para indicar que para generar el voltaje de salida se resta
el valor aplicado a IN
-
del valor aplicado a IN
+
, y no viceversa).
Para poder funcionar, un amplificador necesita ser alimentado
por una fuente de poder, es decir, es un elemento activo (en
contraste con las resistencias y los condensadores, que son
componentes pasivos, ya que funcionan sin necesitar
alimentacin elctrica). Debido a que la fuente de poder
suministra al amplificador un voltaje de alimentacin
determinado (indicado por las dos lneas verticales en la Figura
8.4), el voltaje de salida del amplificador no puede exceder
esos valores (de hecho, normalmente se queda
significativamente corto!). Por ejemplo, si un amplificador funcionara con una pila de 9 V, no se
puede esperar que produjera un voltaje de salida de 24 V; por lo tanto, hay que considerar
siempre el tamao de la seal de entrada (i.e. la diferencia de potencial entre las dos entradas),
y el factor de ganancia, para evitar que el amplificador se sature, es decir, llegue a su mxima
capacidad y se quede all mientras lo que se le pide exceda dicho lmite. En el ejemplo ilustrado
por la Figura 8.5, el voltaje de entrada (lnea azul) es una rampa que crece gradualmente
desde 0 hasta 2 V y la ganancia del amplificador es de 10; cuando el voltaje de entrada llega

Figura 8.3

Figura 8.4
28
0.9 V la salida ya estar saturada (0.910 = 9 V sera el
mximo terico en este caso, si el voltaje de alimentacin
es 9 V), y de all en adelante aunque el voltaje de entrada
siga creciendo, el de salida (lnea roja) permanecer
anclado a su lmite (Saturacin), en lugar de crecer
ulteriormente segn el factor nominal de amplificacin
(Predicho). La ganancia del amplificador se elije por lo
tanto de acuerdo con las caractersticas de la seal de
inters: un potencial de accin, por ejemplo, tiene una
amplitud total de 100 mV, y con una ganancia de 10
sera un voltio, lo cual es fcil medir con cualquier
instrumento. En cambio, los potenciales evocados en el
cerebro y medidos desde la superficie del crneo pueden
ser do 100 V, con lo cual para tener una amplitud
comparable al caso anterior la ganancia debera ser de
10000.
Un amplificador tiene limitaciones tambin en cuanto a su rapidez: debido a que requiere un
tiempo finito para cambiar su voltaje de salida de un nivel a otro, una seal aplicada a su
entrada que flucte demasiado rpidamente podra no verse representada adecuadamente en
la salida: el amplificador no alcanzar a seguirla. El parmetro que caracteriza la velocidad de
un amplificador es el ancho de banda, y usualmente se define haciendo referencia a seales de
entrada sinusoidales (senos o cosenos). Si un amplificador tuviera un ancho de banda de 50
KHz, entonces una seal sinusoidal que oscilara con frecuencia de menos de 50000
ciclos/segundo se amplificar segn la ganancia nominal del instrumento, pero una que fuera
significativamente ms rpida se ver considerablemente atenuada.
Amplificadores operacionales
A continuacin se introducir el concepto (y la utilizacin) de amplificadores operacionales,
circuitos integrados constituidos por muchos transistores y componentes pasivos en un solo
chip de silicn. stos constituyen mdulos flexibles que permiten, con slo aadir unos pocos
componentes pasivos externos, implementar variadas configuraciones aptas para realizar una
amplia gama de funciones. Su recurrencia es tan ubicua en tantas aplicaciones (incluyendo
muchos tipos de mediciones biofsicas, especialmente en electrofisiologa), que se justifica el
esfuerzo invertido en dilucidar sus caractersticas ms bsicas. Un amplificador operacional
(abreviado OpAmp), como todo amplificador, produce un voltaje a la salida que representa la
diferencia de voltaje aplicado a las dos entradas, multiplicado por un factor de ganancia; pero,
en ausencia de ulteriores conexiones y componentes, un OpAmp tiene las siguientes
caractersticas:
Resistencia de entrada (R
in
, la resistencia entre los dos terminales de entrada)
(en trminos reales, se trata de valores muy altos, del orden de de 10
12
a 10
15
)
Ganancia (de nuevo, es una idealizacin; al acto prctico es un nmero finito
muy grande, del orden de 10
5
o 10
6
)
Impedancia de salida muy baja: el OpAmp es capaz de proveer corrientes de tamao
significativo en su salida, lo cual le permite actuar sobre aparatos que requieren
mucha corriente.

Figura 8.5
29
Parecera que un factor de ganancia tan alto hace intil un amplificador operacional, ya que con
el ms mnimo voltaje de entrada (digamos, 1 mV) la salida seguramente va a exceder
ampliamente el rango posible del aparato (el cual, como hemos visto, no puede ser mayor que
el voltaje que alimenta el circuito mismo, usualmente 10 o 15 V); por lo tanto uno esperara
que con la ms mnima perturbacin en el input, el output quedara en saturacin, atascado al
mximo voltaje que es capaz de generar. Esto no tendra utilidad alguna; sin embargo, el
circuito es domado introduciendo un camino de retroalimentacin negativa (feedback
negativo), lo cual se logra conectando la salida del amplificador a la entrada negativa (IN-); el
efecto es que se aplica a dicha entrada un voltaje que neutraliza la discrepancia con respecto a
la otra entrada. Al hacerlo, el circuito se torna
estable, y su salida guarda una relacin til con la
entrada, dependiendo de la naturaleza de las
conexiones y los componentes utilizados en la
retroalimentacin negativa. Por ejemplo, se puede
generar un amplificador con una ganancia
controlada y razonable (bien sea que invierta o no
invierta la seal), o un amplificador que convierta
una corriente en un voltaje, un amplificador que
integre en el tiempo la seal de entrada, etc.
Examinemos algunas configuraciones clsicas. En
todos los casos el anlisis se basa en el hecho de
que la retroalimentacin negativa hace que el
potencial en los dos puntos de entrada se mantiene
a todas horas al mismo nivel (esto es vlido
ignorando breves instantes de transicin...); el
porque es obvio: si el voltaje en IN+ se torna ms
positivo que el de IN-, V
out
se volver positivo
(recuerden que V
out
= [IN+ - IN -]G), y al aplicrse
el voltaje de salida a IN- se neutraliza la diferencia.
Viceversa, si IN+ es ms positivo que IN-,
inmediatamente V
out
se vuelve negativo, y la accin
correctiva de nuevo anula las diferencias entre las
dos entradas.

Sabiendo esto, en general solo hace
falta usar la ley de Ohm y el concepto de divisor de
voltaje para entender exactamente el
comportamiento de un circuito, o para disear un
circuito que cumpla con las especificaciones
precisas que uno requiere. La figura 8.6A ilustra un
caso particular, conocido como amplificador
invertido. Debido a que IN+ est conectado a tierra
(en la figura se indican las dos entradas del
OpAmp simplemente como + y -), la entrada IN-
tambin se encontrar siempre a 0 V (tierra), es
decir al mismo potencial que IN+, por el motivo ya
explicado. La corriente que fluye desde la fuente de
la seal a travs de la resistencia R
in
es igual, por
la ley de Ohm, al voltaje de la seal dividido por la
resistencia de entrada: I = V
in
/R
in
. Esta corriente
solo puede seguir su camino por la resistencia R
f
,
ya que la resistencia de entrada del OpAmp es
supremamente alta. Por consiguiente, V
out,
siendo

Figura 8.6
30
la diferencia de voltaje entre los terminales de R
f
, ser IR
f
(de nuevo, por la ley de Ohm). El
signo negativo se debe a que si la corriente fluye desde la fuente de la seal hacia tierra
(virtual), y de all hacia la salida del OpAmp, debe ser que el potencial en los dos extremos del
recorrido tiene polaridad opuesta. Una manera sencilla de visualizar la situacin es viendo que
las dos resistencias, R
in
y R
f
, forman un divisor de voltaje cuyo punto medio se mantiene a 0 V;
si un extremo (la seal) se torna positivo, el otro se vuelve negativo, y viceversa. Si las dos
resistencias fueran iguales, el valor absoluto de V
in
y V
out
sera el mismo, solo que la polaridad
sera opuesta. Si R
f
fuera mayor, V
out
sera ms grande que V
in
(y con el signo opuesto), ya que
a igual corriente el cambio de voltaje entre los terminales de una resistencia es proporcional a
su valor. En resumen, la relacin entrada-salida estar dada por:
V
out
= -V
in
(R
f
/R
in
)
La ganancia del circuito (G) est dada por el cociente entre las dos resistencias (G = R
f
/R
in
), lo
cual permite que una seale se agrande (si R
f
/R
in
> 1) o se achique (si R
f
/R
in
< 1). La
resistencia de entrada del amplificador en esta configuracin es R
in
(la resistencia que la seal
ha de cruzar para fluir al potencial de tierra).
Como construir un amplificador que no invierta la seal? Intuitivamente, es obvio que sta
deber aplicarse a la entrada IN+ (en lugar de IN-). La Figura 8.6B muestra el esquema de un
amplificador no-invertido. La seal entra directamente a IN+. Por retroalimentacin, V- se
mantiene tambin al mismo potencial que V
in
. Aqu IN- es el punto medio de un divisor de
voltaje, y podemos hacer un razonamiento anlogo al caso anterior: la corriente que fluye por
R
in
es I = V
in
/R
in
. Esa misma corriente fluye por R
f
, as que la diferencia

entre V
out
y

IN- es IR
f
.
Entonces V
out
= V
in
+IR
f
. = V
in
+ (V
in
/R
in
)R
f
, decir:
V
out
= V
in
(1+R
f
/R
in
)
El factor d ganancia es:
G = V
out
/V
in
= 1+R
f
/R
in

Notar dos diferencias respecto al caso anterior (aparte el hecho de que la polaridad de la salida
no se invierte): en primer lugar, la ganancia mnima tiende a 1, en el caso lmite cuando
R
f
<<R
in
. En segundo lugar, la resistencia de entrada del circuito esta dada por la del OpAmp, la
cual sabemos que es extremadamente alta.
Ahora consideremos el circuito de la Figura 8.6C. Evidentemente, debido a que la conexion
entre la salida y la entrada IN- es directa, V
out
= V
in
; pero por retro-alimentacin, IN- = IN+
(donde se aplica la seal), por lo tanto V
out
mantiene el mismo voltaje que la seal de entrada.
Esta configuracin se llama seguidor de voltaje. De que nos sirve un circuito que produce en la
salida una rplica exacta de la seal aplicada a la entrada? No es para nada tan intil como
podra parecer, de hecho este circuito abri las puertas a la posibilidad de realizar mediciones
intracelulares, como se entender ms tarde: este circuito evidentemente tiene alta resistencia
de entrada, y por lo tanto no drena la fuente de la seal cuando sta sea muy dbil (piensen
en los potenciales bioelctricos generados por una clula diminuta); en cambio, en su salida
replica la misma seal pero con capacidad de generar buena corriente. Ms tarde veremos que
esta caracterstica tambin permite minimizar errores de medicin cuando el acceso a la
muestra de debe dar a travs de una sonda que tiene alta resistencia.
31
Uno podra tener inters en determinar y amplificar no simplemente el nivel de potencial de una
fuente sino la diferencia entre dos seales. En este caso, las dos seales se aplican a las dos
entradas, respectivamente, y las resistencias adicionales establecen la ganancia, dada por G =
R
f
/R
1
, como ilustra la Figura 8.6D. En esta configuracin se mantiene simetra entre los dos
caminos, poniendo R
1
=R
2
y R
f
=R
3
. Este se llama un amplificador diferencial y tiene importantes
aplicaciones en electrofisiologa.
Finalmente, consideremos el circuito ilustrado el la Figura 8.6E. El punto IN- se mantiene a 0, y
no hay resistencia alguna que se interponga entre la fuente de la seal y tierra (tierra virtual).
Si la fuente fuera un generador de corriente, I, esta fluira a tierra sin impedimento alguno. Cual
es el valor de V
out
? Claramente I debe fluir por R
f
, ya que la entrada del OpAmp presenta una
resistencia prohibitivamente alta. Entonces V
out
= IR
f
. Es decir, hemos creado un conversor
corriente-voltaje
,
cuyo factor de conversin est determinado por el valor de R
f
: entre ms alto
R
f
, mas sensible el conversor (mayor el voltaje de salida para un tamao dado de la corriente a
la entrada).
En esta breve resea hemos esbozado las ms comunes configuraciones de amplificadores
operacionales. Muchas funciones especficas (e.g. registrar un voltaje con una ganancia y una
resistencia de entrada prescrita, generar un estmulo elctrico, cuantificar una corriente, etc.) se
pueden lograr de esta manera.

Mediciones elctricas en clulas
La importancia de los principios de la electricidad para el estudio de sistemas biolgicos radica
en que toda clula mantiene un potencial elctrico entre el interior y el exterior de la membrana;
es ms, esta carga puede movilizarse bajo el control de varios estmulos, y producir un cambio
en la magnitud del voltaje que existe a travs de la membrana. Estas seales elctricas
constituyen el lenguaje biolgico primordial, utilizado por los organismos para derivar
informacin sobre el mundo externo, procesarla, e iniciar acciones motoras. La aplicacin de
principios de mediciones elctricas a un contexto biolgico y en particular a escala celular
requiere unas consideraciones especiales. Para la medicin de diferencias de potencial o
corrientes a travs de la membrana celular es indispensable la disponibilidad de dos sondas,
una intracelular y la otra extracelular. Mientras la segunda no presenta mayores obstculos,
una sonda que se pueda insertar dentro de una clula de pocas micras sin producir dao
sustancial requiere ms precauciones. Usualmente sta se fabrica de un capilar de vidrio, 1 a 2
mm en dimetro, cuya seccin central se calienta con un filamento candente hasta derretir el
vidrio (Figura 8.7A). Aplicando tensin a los dos extremos la porcin derretida se adelgaza y
finalmente se separa en dos mitades, cuyas puntas son diminutas, del orden de 0.1 a 1 m.
Estas micropipetas son lo suficientemente finas para penetrar una clula, bajo control por
micromanipulacin y visualizacin por microscopio, sin afectar drsticamente sus funciones.
Puesto que el lumen del capilar permanece abierto, formando un minsculo orificio en la punta,
al llenarlo con una solucin electroltica (e.g. 3 M KCl) se obtiene una sonda elctricamente
conductiva con la cual establecer contacto con el citoplasma. Pero otro requisito igualmente
crtico es establecer el contacto entre el sistema electroltico constituido por el medio
intracelular y el interior de la pipeta (en el cual la conduccin elctrica es inica), con el cable
metlico que conecte el microelectrodo al amplificador (donde la conduccin es electrnica). Si
no se toman medidas especiales, la interfase entre el metal y el lquido no conduce (un in no
puede transformarse en un electrn o viceversa): solamente se podra cargar/descargar la
capacitancia de la superficie de la interfase (i.e. se formara una doble capa cargada de
electrones - o huecos - en el lado metlico, y iones en el lado lquido), lo cual podra servir
para seales transientes (AC) pero no habra transmisin DC. Para obviar esta dificultad se
32
fabrica un electrodo reversible que haga contacto con el medio electroltico; ste est
constituido por un metal recubierto por una delgada capa porosa de una sal del mismo metal.
Esta sal debe ser poco soluble (de lo contrario, al entrar en contacto con el lquido, la capa se
disolvera, dejando solamente el metal expuesto), y el contra-ion debe ser una especie
representada en la solucin electroltica. Tpicamente se usa plata (Ag) como metal, cubierto de
AgCl (ya que es poco soluble, y el Cl suele ser el principal anin presente en soluciones
fisiolgicas). Esto permite la siguiente reaccin reversible:
AgCl + e
-
Ag + Cl
-
De esta manera, un electrn que viaje por el metal se combina preferencialmente con el Cl de
una molcula de AgCl (por ser el Cl ms electronegativo) y el in de Cl
-
resultante se
desprende y puede entrar en solucin, llevando corriente en el medio lquido (y dejando atrs
un Ag). Viceversa, un in de Cl
-
difundindose por el lquido hasta la interfase con el metal se
puede combinar con Ag formando AgCl, y el electrn que sobra lleva la corriente por la matriz
metlica del cable (Figura 8.7B). Otros arreglos utilizan mercurio (Hg) en lugar de plata
(electrodos de calomel).
La finsima punta de un micro-electrodo, necesaria para no inducir dao a la clula,
inevitablemente se acompaa, como ya se ha dicho, de una muy alta resistencia elctrica
(desde unos cuantos Megaohms hasta
cientos de Megaohms). Esta situacin
tiene repercusiones indeseables para la
fidelidad del registro elctrico. En primer
lugar, el efecto de divisor de voltaje que
ya se analizado: al existir una diferencia
de potencial entre la punta del
microelectrodo (que muestrea el
verdadero potencial que existe en el
compartimiento intracelular) y el otro
lado, donde el alambre de Ag/AgCl hace
contacto con la solucin salina, quiere
decir que el voltaje aplicado al input del
amplificador no es aquel que el
experimentador pretende medir. La

Figura 8.7

Figura 8.8
33
Figura 8.8 ilustra este problema, que, como se ha mencionado, puede ser aliviado
cerciorndose de que la resistencia de entrada del amplificador sea an ms alta. Pero esta
precaucin no evita un segundo problema. Un microelectrodo de vidrio est constituido por una
delgada pared de material aislante que separa dos medio conductivos (la solucin salina dentro
del electrodo mismo, por una parte, y los fludos electrolticos en el exterior); como tal,
constituye un condensador (cuya capacitancia, C
e
, tiene un valor que tpicamente puede ser del
rden de unos 10 pF). Conjuntamente con la resistencia del electrodo, este arreglo forma un
filtro pasa-bajo, idntico al que se analiz previamente (la seal del voltaje intracelular
encuentra primero la alta resistencia del electrodo, que se concentra en la punta donde el
dimetro es mnimo, y ms arriba una capacitancia - donde la superficie de rea del aislante es
mayor; el otro terminal de este condensador est conectado al potencial de referencia del
medio exterior, es decir, a tierra). Este arreglo implica que las seales transmitidas desde el
interior de la clula al amplificador estn sujetas a una atenuacin de frecuencias altas; por
consiguiente, transientes rpidos, como un potencial de accin producido por una neurona,
podrn ser significativamente atenuados, comprometiendo la fidelidad del registro. En el
ejemplo de un microelectrodo con C
e
= 10 pF (10
-11
F) y una resistencia R
e
= 100 M (10
8
) su
constante de tiempo sera 1 ms ( = R
e
C
e
= 10
-3
s); quiere decir que un potencial de accin
que alcance su pico mximo en menos de un milisegundo, se ver aparentemente reducido a
un 63% de su de amplitud real; para obviar estas deficiencias se han desarrollado varias
estrategias que bien sea reducen la constante de tiempo del microelectrodo (reduciendo su
resistencia y/o su capacitancia), o compensan electronicamente la prdida de frecuencias altas.

Principios de registro elctrico extracelular
El estudio riguroso de los potenciales bioelctricos necesariamente implica el uso de sondas
intracelulares (microelectrodos, a los cuales ya aludimos). Sin embargo, aunque estos
enfoques proporcionan la informacin ms detallada y precisa, su naturaleza invasiva, delicada
y tcnicamente compleja los hace no aptos para monitorear la actividad global de un rgano
constituido por un enorme nmero de clulas elctricamente activas, ni tampoco para el uso
rutinario con fines diagnsticos en la prctica clnica. Otros acercamientos modificados han
permitido desarrollar alternativas ms sencillas que proporcionan suficiente informacin para
ser de gran utilidad en fisiologa y en medicina. Todos estos comparten dos caractersticas
fundamentales: (i) hacen uso de electrodos extracelulares, tpicamente aplicados a la superficie
del cuerpo (ii) reportan la actividad elctrica de poblaciones de
clulas, en lugar que de clulas individuales. Para entender
como esto ha sido posible, es preciso examinar primero que
todo el porqu habra de funcionar una medicin que solo
compare la diferencia de potencial entre dos electrodos,
cuando ambos estn localizados afuera de la(s) clula(s) cuya
actividad se desea monitorear. Claramente, en condiciones de
reposo ambos electrodos veran el mismo potencial, y la salida
del amplificador ser cero. Pero si una(s) clula(s)
manifiesta(n) actividad elctrica, debe ser que alguna corriente
esta cruzando la membrana, entrando y saliendo, y
completando un recorrido cerrado. Por lo tanto, si nos fijamos
en el compartimiento extracelular, habr corriente elctrica que
fluye por los fluidos intersticiales; la ley de Ohm nos dice que
entre dos puntos existir un voltaje V = IR. Por lo tanto, como
se ilustra en la Figura 8.9A, dos electrodos que muestrearan
dos puntos de ese espacio podrn revelar una diferencia de
potencial durante un episodio de actividad elctrica, siempre y
Figura 8.9
34
cuando haya una corriente neta que fluya entre esos dos puntos. Por otra parte, si ante el
mismo patrn de corriente colocramos nuestro par de electrodos en una direccin ortogonal a
la de la corriente (Figura 8.9B), entonces no habr diferencia de potencial alguna reportada por
los dos electrodos, ya que ninguna corriente fluye entre las dos regiones muestreadas. Si
consideramos el conjunto de curvas que interceptan a 90 las lneas de flujo de corriente
(como, por ejemplo, las lneas puntuadas en la figura 8.9), a lo largo de cada una de ellas no
fluye corriente alguna, y por lo tanto todos sus puntos se encuentran al mismo potencial
elctrico: las llamamos curvas isopotenciales. En el caso ms general, quiere decir que dos
electrodos ubicados en dos puntos del dominio espacial, llammoslos A y B, podrn detectar
una diferencia de potencial proporcional a la magnitud de aquel componente de la corriente que
fluye en la direccin del eje imaginario que une a los dos puntos. Si la corriente total en esa
regin fuese representada por un vector, esa cantidad estara dada por la proyeccin del vector
sobre el eje A-B; cuantitativamente, eso representa Mcos(),
M siendo la magnitud de la corriente y el ngulo entre el
vector del flujo neto de corriente y el eje que une los dos
electrodos. Es lo mismo que decir el producto punto entre los
dos vectores. La Figura 8.10 ilustra este concepto. En un
medio homogneo est fluyendo una corriente I,
representada por la flecha verde diagonal; dos electrodos, A
y B, miden la diferencia de potencial entre dos puntos de ese
medio. La lnea imaginaria que une los dos electrodos (el eje
de los electrodos) forma un ngulo con respecto a la
direccin del vector de la corriente. Proyectando este ltimo
sobre el eje de los electrodos obtenemos el componente de I
en la direccin entre A y B, llammoslo la corriente efectiva,
I
eff
o I
A,B
(ya que viene siendo la porcin de la corriente total
que fluye entre A y B). Entonces, por la ley de Ohm, la
diferencia de potencial entre A y B ser la magnitud de I
A,B
multiplicada por la resistencia entre
esos dos puntos, R
A,B
.Lejos de ser una desventaja, podemos aprovechar el hecho de que
nuestro registro depende de la orientacin relativa entre el flujo de corriente y el eje del par de
electrodos para reconstruir la pauta de actividad elctrica en el dominio de inters: por ejemplo,
si colocramos dos pares de electrodos (A-B y A-B) perpendicularmente alrededor de una
regin de tejido, y uno mostrara en un momento dado una diferencia de potencial mientras que
el otro no, podramos concluir que existe actividad elctrica la cual se manifiesta en un flujo
neto de corriente orientado en la direccin del eje de uno de los dos pares de electrodos (y, por
supuesto, ortogonal al otro). Si ambos pares reportaran la misma magnitud de voltaje, la
corriente estara fluyendo a 45 respecto a los dos ejes de los pares de electrodos, y as
sucesivamente.

La seal registrada depender no solamente de la direccin de la corriente respecto a la del eje
de los electrodos, sino tambin de la distancia entre electrodos y el foco en el cual se origina la
actividad elctrica. Supongamos que en un dominio de 3 dimensiones (un conductor de
volumen) hubiera dos puntos, P
1
y P
2
, con potencial elctrico diferente: las lneas de flujo de
corriente se extienden en todo el espacio alrededor, pero su densidad disminuye al alejarse de
la fuente de actividad elctrica (en otras palabras, habr ms corriente que fluye por el camino
directo entre , P
1
y P
2
, comparado con el flujo que toma una vuelta ms larga, alejndose de
dichos puntos. El motivo es obvio: recorridos ms largos implican una resistencia mayor
(asumiendo homogeneidad del medio) y por lo tanto menor corriente (I = V/R). Por
consiguiente, al colocar el par de electrodos a distancias progresivamente mayores con
respecto a la fuente de la actividad elctrica uno observara una menor amplitud de la seal
registrada. La Figura 8.11 muestra un hipottico foco de actividad representado por un polo

Figura 8.10
35
positivo y un polo negativo. Lneas rojas representan flujo
de corriente; hay ms lneas que toman el camino directo,
mientras que las que toman recorridos ms y ms alejados
son progresivamente ms escasas. Consideremos dos
pares de electrodos utilizados para medir el voltaje. El
primero, A y B, se encuentra lejos del foco de actividad, y
por consiguiente la densidad de corriente en esa regin es
baja. El segundo, A y B, est cerca de los polos, donde la
densidad de corriente es mayor. La distancia entre cada
par de electrodos es igual, y, asumiendo que el medio es
homogneo, la resistencia entre A y B ser entonces
idntica a la resistencia entre A y B. Puesto que el voltaje
reportado por cada par de electrodos es IR, a igualdad de
resistencia la mayor cantidad de corriente entre los puntos
muestreados por A y B hace que el medidor
correspondiente de voltaje indique una seal ms grande.
La dependencia de la amplitud de la seal con respecto a
la distancia de la fuente sugiere que, teniendo distintos
electrodos (o desplazando un mismo par de electrodos)
podemos derivar informacin acerca de la localizacin del
foco de actividad. Estas consideraciones indican que el
arreglo geomtrico de los electrodos respecto a la
ubicacin de la fuente de actividad elctrica es un factor
determinante para registrar una seal extra-celularmente:
la comparacin entre muchos pares de electrodos que muestreen la misma regin pero con
una orientacin diferente de sus respectivos ejes y, por supuesto, diferentes posiciones en el
espacio, nos puede informar acerca de la proximidad del foco de actividad, y la direccin del
flujo de corriente. Tales consideraciones implican que eligiendo un conjunto adecuado de
electrodos colocados en la superficie del conductor de volumen es posible reconstruir muchos
aspectos del patrn espacio-temporal de actividad elctrica en esa regin y detectar la
ubicacin de los focos de actividad. Esta es precisamente la lgica que subyace el registro de
la actividad elctrica cardaca (electrocardiograma, o ECG) y cerebral (electroencefalograma, o
EEG).

El osciloscopio
Uno de los instrumentos de mayor utilidad para mediciones elctricas es el osciloscopio,
aparato que proporciona de una manera grfica una medida de voltaje en funcin del tiempo.
Para ese fin se utiliza un tubo de rayos
catdicos, parecido a los de los televisores
anlogos, el cual tiene una forma
aproximadamente cnica o piramidal: en el
pex, el extremo ms estrecho, se encuentra
un filamento que, al conectarse a una fuente
de voltaje (V
F
), se calienta (Figura 8.12). El
extremo opuesto (la base del cono o de la
pirmide) est recubierto internamente con
una molcula usualmente referida como
fsforo, e.g. P1, P22, etc. (pero en general se
trata de un compuesto de zinc y otros
elementos que ni siquiera contienen fosforo!),

Figura 8.12

Figura 8.11
36
y estos recubren la pantalla del instrumento. Adems, en los dos extremos tambin se
encuentran dos rejillas metlicas, las cuales se mantienen a potenciales muy diferentes (V
A
,
que tiene valores de hasta miles de voltios): la del lado del filamento es negativa (el ctodo) la
del lado de la pantalla es positiva (el nodo). Con esto se establece un fuerte campo elctrico
orientado longitudinalmente al interior del tubo. Al ponerse incandescente el filamento, la
agitacin trmica de las molculas del metal es suficiente para que continuamente algunos de
los electrones se desprendan de sus respectivos ncleos. Estos electrones libres son
acelerados fuertemente por el campo elctrico en la direccin de la pantalla, contra la cual se
estrellan. Su energa cintica es tal que la colisin con
las molculas de fsforo lleva a stas ltimas a un
estado de excitacin electrnica (los electrones externos
brincan a un orbital superior) el cual es de muy corta
duracin, y al devolverse la molcula al estado inicial
disipa el excedente energtico con la emisin de un
fotn de luz visible. Por consiguiente, si un chorro
continuo de electrones chocara contra el mismo lugar de
la pantalla, el observador al frente de la pantalla vera un
punto luminoso fijo. El resto del aparato consiste en
circuitos para controlar espacialmente este haz de
electrones, con lo cual se logra desplazar arbitrariamente
la posicin del punto luminoso en la pantalla. Un par de
placas metlicas horizontales en la mitad del camino,
una por encima y la otra por debajo del eje del tubo,
permite que al aplicrseles una diferencia de voltaje, se
induzca una deflexin al rayo: si la placa superior fuera
ms positiva que la inferior, los electrones no solamente
seran sometidos al campo longitudinal que los acelera hacia la pantalla, sino que al cruzar la
zona de las placas experimentaran simultneamente una fuerza transversal que los desviara
hacia arriba. Es decir, la resultante de los dos vectores de fuerza sera una trayectoria
inclinada. Si el voltaje fuera opuesto, la desviacin ser hacia abajo. Por consiguiente la
ubicacin del punto luminoso en la pantalla cambiar en la dimensin vertical (el eje Y),
dependiendo de la polaridad y de la magnitud del voltaje aplicado a las placas horizontales de
deflexin. La Figura 8.13 ilustra este arreglo. Lo mismo se puede lograr en cuanto a desplazar
el punto luminoso horizontalmente; en este caso, un segundo par de placas metlicas
colocadas verticalmente causarn un desplazamiento del haz de electrones en el eje X (Figura
8.14). Ahora, controlando los voltajes aplicados a los dos pares de placas de deflexin,
estamos en posicin de ubicar el punto luminoso en cualquier lugar del plano X-Y de la
pantalla. En un osciloscopio la
dimensin Y representa el voltaje, la
dimensin X el tiempo. Por lo tanto,
necesitamos que el voltaje a ser
medido produzca, a travs de un
amplificador, un desplazamiento del
punto luminoso que, por convencin, es
hacia arriba cuando el voltaje es
positivo, y viceversa. Ahora
necesitamos que el desplazamiento
horizontal represente el tiempo. Para
eso el punto debe moverse a una
velocidad fija de izquierda a derecha y,
al llegar al extremo de la pantalla, Figura 8.14

Figura 8.13
37
devolverse y re-empezar. Esto se logra aplicando inicialmente un voltaje que fuera ms positivo
en la placa de deflexin vertical izquierda, y cuyo valor fuera lo requerido para que desviar el
rayo ubicndolo inicialmente en el margen izquierdo de la pantalla; el voltaje debe luego
disminuir linealmente en el tiempo, hasta quedar anulado (el punto luminoso se mover
gradualmente hasta el centro de la pantalla), luego seguir cambiando, ahora con la placa
derecha volvindose cada vez ms positiva (lo cual desva el rayo hacia la derecha, hasta que
el punto luminoso llegue al margen derecho). A ese punto dos cosas ocurren: (i) el ciclo se
repite, volviendo abruptamente al voltaje positivo en la placa izquierda (ii) durante ese
brevsimo intervalo el punto luminoso se apaga, para que no se vea el trayecto de retorno.
Estos cambios simplemente se obtienen conectando las dos placas a un generador de ondas
que produzca una seal cclica en forma de serrucho (representada por el trazo azul en la
Figura 8.14), e interrumpiendo momentneamente el potencial del filamento al final de cada
ciclo para que cese transitoriamente el haz de electrones. Con esto tenemos lo bsico: el
movimiento horizontal representa el tiempo, el vertical el voltaje. Si quisiramos medir voltajes
ms pequeos o ms grandes, simplemente variaramos la ganancia del amplificador de
entrada para que la deflexin vertical para un voltaje dado fuera mayor o menor. La perilla de
Ganancia indica la calibracin en mV/divisin, referida a un gratculo marcado en la pantalla
misma, cuyas lneas usualmente estn a 1 cm de distancia una de otra. De la misma manera, si
quisiramos discernir eventos cuyo curso temporal fuera muy rpido, aceleraramos la
velocidad de barrido horizontal, lo cual simplemente implica utilizar una onda serrucho con una
pendiente mayor (ms corto el tiempo para cruzar horizontalmente toda la pantalla, y por lo
tanto ms ciclos por segundo). La perilla de control de barrido (Time Base) tiene posiciones
calibradas en segundos (o mili-, o micro-segundos) por divisin.

Queda un ltimo problema. Si se quisiera mirar un evento que ocurre bien sea
espontneamente o bien en respuesta a un estimulo aplicado por el experimentador, sera
deseable sincronizar el barrido con la ocurrencia del evento de inters. De lo contrario, ste
aparecera cada vez en distintas posiciones de la
pantalla, y sera difcil examinar sus caractersticas. La
Figura 8.15 muestra un ejemplo tpico en neurofisiologa,
en el cual un estimulador aplica pulsos despolarizantes a
una neurona a travs de un microelectrodo, mientras un
segundo microelectrodo registra, a travs de un
amplificador, los cambios de voltaje intracelular. Como
sabemos, en un clula elctricamente excitable si el
voltaje a travs de la membrana se despolariza por
encima de un cierto valor umbral, se desencadena un
rpido cambio impulsivo de voltaje, llamado el potencial
de accin. Quisiramos examinar en detalle los
potenciales de accin, pero, debido a que el barrido del
osciloscopio ocurre repetitivamente de una manera
continua sin tener en cuenta cuando se aplican los
estmulos, los potenciales de accin ocurren
aleatoriamente durante cada barrido, y su posicin
horizontal en la pantalla es variable. Esto dificulta las mediciones. Pero podramos aprovechar
el hecho de que el evento de inters es gatillado por un estmulo bajo el control del
experimentador: entonces, en lugar de dejar que el barrido ocurra repetitivamente de una
manera automtica, utilizaramos el modo de gatillo externo, en el cual el mismo estmulo que
desencadena el evento (en este caso, el pulso aplicado a la clula) se aplica tambin a una
entrada especial del osciloscopio (Trigger), e inicia cada vez un solo barrido (gatilla un solo
ciclo en el generador de onda de serrucho). Con lo cual habr siempre una relacin temporal

Figura 8.15
38
fija entre el inicio del barrido y la ocurrencia del evento, el cual aparecer por lo tanto siempre
en una posicin determinada de la pantalla (Figura 8.16). Cuando el evento no es controlado
por un estmulo explcito sino que ocurre espontneamente, se puede usar otra modalidad, en
la cual el mismo evento a ser medido tambin inicia el
barrido. Esto se logra fijando un umbral y cuando la variable
a ser medida lo excede, se gatilla el barrido. De nuevo, en la
medida en que el evento examinado tenga un curso
temporal estereotipado, el barrido empezar siempre en un
punto fijo del evento, y sucesivas repeticiones aparecern
en la misma posicin de la pantalla (aunque en esta
modalidad uno perdera lo que ocurri antes de que la seal
alcanzara el nivel-umbral).

En tiempos recientes los osciloscopios anlogos, cuyos
principios de funcionamiento se acaban de esbozar, han
venido siendo reemplazados por osciloscopios digitales. Su
funcionalidad es esencialmente la misma, pero en lugar de
un tubo de rayos catdicos tienen una pantalla LCD
constituida por una matriz de pixels, y la electrnica de control emula el barrido del rayo
activando secuencialmente en diferentes puntos. Sus ventajas son unas dimensiones ms
compactas, peso reducido, y posibilidad de procesamiento sofisticado de los datos adquiridos;
al mismo tiempo, an padecen de algunas desventajas, como menor resolucin grfica, y
menor ancho de banda.

Figura 8.16
39
9. Ruido elctrico.
La discusin de las dos secciones anteriores podra dejar la impresin de que nuestra
capacidad de extraer informacin representada por una seal elctrica, por pequea y/o rpida
que fuera, depende solamente de la disponibilidad de un amplificador con suficiente ganancia y
ancho de banda. En la realidad nos topamos con los lmites impuestos por la presencia de
ruido elctrico, fluctuaciones espreas de voltaje (o de corriente) que contaminan la seal de
inters.
Fuentes de ruido
Hay muchos orgenes del ruido, y algunas instancias son susceptibles de ser corregidas (por
ejemplo, alejndose de la fuente de interferencia), pero existe un componente de ruido que no
se puede evitar, y hace parte intrnseca de la naturaleza; como tal, establece el lmite supremo
de la detectabilidad. Primero aclaremos conceptos bsicos: todo evento que podamos registrar
representa en realidad la superposicin de dos componentes (i) la seal de inters y (ii) el
ruido. Es obvio que el tamao relativo de los dos dictamina el grado de contaminacin, y por lo
tanto la fidelidad con la cual recibimos la seal; en el caso en que la amplitud del ruido fuera
mucho mayor que la de la seal, podra ser imposible para el observador percatarse la seal
misma. Esta relacin se conoce como cociente seal/ruido (S/R, o en Ingles S/N signal-to-
noise ratio) y es un parmetro crtico de la calidad de una medicin. Si el cociente S/R fuera
muy pequeo, nuestra seal est muy contaminada, y de nada nos sirve aplicar una ganancia
alta: nuestro instrumento amplificara de la misma manera tanto la seal como el ruido, y por lo
tanto no mejorara nuestra capacidad de extraer informacin. En electricidad pueden existir
variadas fuentes que producen seales indeseadas, las cuales calificaramos de ruido:
motores elctricos ubicados en proximidad de un instrumento de medicin, luces fluorescentes,
emisoras de radio, etc. Uno logra escudar la seal de inters, protegindola de tales
interferencias, resguardando las sondas y los instrumentos de medicin dentro de un
compartimiento cerrado cuyas paredes son conductivas y conectadas a tierra (una as llamada
caja de Faraday). Sin embargo, siempre queda un ruido residual que es ineludible y se debe a
lo siguiente: en todo cuerpo en equilibrio trmico con su entorno las partculas estn en
constante agitacin aleatoria (el movimiento Browniano), que depende de la temperatura. Esto
se aplica tambin a partculas elctricamente cargadas, como los electrones en una matriz
metlica, o los iones en una solucin. El carcter estocstico de dicho movimiento implica que
entre dos regiones del espacio se pueden congregar transitoriamente cargas, resultando en
diferencias de potencial. Pensemos en una simple resistencia, cuyos terminales no estn
conectados a nada; el voltaje entre ellos ser cero, pero solo en promedio: en cada instante
dado, puede ser que varios electrones hayan brincado a un tomo vecino a la izquierda, no
contrabalanceados por un nmero exactamente igual de electrones que hayan sufrido un
desplazamiento en la direccin opuesta; lo mismo en una solucin electroltica. El resultado
ser una momentnea separacin de cargas positivas y negativas, es decir, la creacin de una
diferencia de potencial elctrico. No hay ninguna tendencia sistemtica que propicie una
distribucin asimtrica de carga, as que, probabilsticamente, esta situacin no perdurar sino
que se compensar rpidamente; pero instantes ms tarde puede crearse un desbalance
transitorio en la direccin opuesta, y as sucesivamente. A lo largo del tiempo el voltaje
promedio ser nulo, sin embargo, se darn constantemente breves desviaciones en una
direccin y la otra, lo cual representa un voltaje fluctuante alrededor de 0, con excursiones
positivas y negativas de amplitud variable (entre ms grandes menos frecuentes, porque la
probabilidad de que por simple azar ocurra un gran nmero de desplazamientos netos en una
direccin es muy baja igual que la expectativa de obtener una gran predominancia neta de
caras vs. sellos al lanzar al aire un nmero considerable de monedas). Entre mayor la
temperatura, mayor la agitacin trmica y mayor el ruido. De la misma manera, si en lugar del
40
voltaje estuviramos monitoreando la corriente que fluye por un corte de seccin de nuestro
objeto, veramos una corriente fluctuante en ambas direcciones, alrededor de 0. Si se midiera el
ruido trmico como voltaje, ste aumenta con la resistencia del objeto (cada desplazamiento de
una carga repercute como un voltaje ms conspicuo si la resistencia es alta, ya que V =IR); en
cambio, el ruido de corriente decrece con la resistencia, porque la facilidad de que una partcula
cargada se desplace por un medio es inversamente proporcional a la resistencia. El ruido
elctrico debido a la agitacin trmica de partculas cargadas se conoce como el ruido de
Johnson-Nyquist. Este ruido est presente en el objeto a ser medido (como en el ejemplo de la
resistencia), pero tambin lo est en los componentes de los circuitos del instrumento utilizado
para medir: sondas, transistores, etc. Todas nuestras mediciones inevitablemente estn
superpuestas a unas incesantes fluctuaciones; cuando la seal de inters es muy grande, la
contribucin relativa de estas fluctuaciones es mnima y a menudo ni siquiera somos
conscientes de que existe esa variabilidad de fondo. Pero en otras situaciones se pretende
medir voltajes diminutos, como los potenciales post-sinpticos producidos por la exocitosis de
una sola vescula cargada de neuro-transmisor, o las corrientes inicas mediadas por protenas
transportadoras individuales; en estos casos la amplitud de la seal puede ser comparable a la
del ruido trmico, y la tarea de obtener informacin aceptablemente fiel e interpretable se torna
ardua.
Reduccin de ruido por filtros de frecuencias
Existen dos acercamientos que nos permiten recuperar en parte la calidad de la seal. El
primero consiste en hacer uso de filtros capaces de atenuar diferencialmente seales de
diferentes caractersticas temporales. El ruido trmico se caracteriza por excursiones que no
solamente tienen amplitud variable sino tambin rapidez variable, incluyendo transientes
supremamente breves que contribuyen a la variabilidad total. Si la seal de inters tiene un
curso temporal que no contempla transiciones muy
rpidas, podemos pasar el registro total (seal +
ruido) por un filtro pasa-bajos, el cual descarta las
fluctuaciones de ms alta frecuencia. Como ningn
aspecto de nuestra seal tiene esas caractersticas
temporales, sta queda prcticamente intacta,
mientras que buena parte del ruido es eliminada. La
Figura 9.1 muestra el efecto de un filtro pasa-bajo
ajustado a dos niveles progresivamente ms drsticos
de corte de frecuencias altas (rechazando frecuencias
>200 y >50 Hz, respectivamente); notar que, aunque
el trazo se limpia significativamente, fluctuaciones
lentas sobreviven la accin del filtro. Es preciso tener
en cuenta que el ruido no necesariamente concierne
las frecuencias ms altas: por ejemplo, un
investigador podra estar interesado en estudiar el
patrn de distribucin temporal de potenciales de
accin (los cuales son de muy breve duracin) en alguna rea del cerebro. Esta actividad, si se
registra mediante electrodos extracelulares, es de muy baja amplitud (en la escala de
microvoltios a fracciones de milivoltios) y se encuentra inevitablemente sumergida en las
oscilaciones lentas de la actividad elctrica del cerebro, que pueden tener una amplitud
comparable. Esto dificulta la extraccin confiable de los potenciales de accin, como por
ejemplo se podra desear lograr con un mtodo automatizado que contara como potencial de
accin toda excursin que cruzara un cierto voltaje-umbral. De nuevo, es posible a travs de un
filtro que rechaze selectivamente ciertas frecuencias, obtener la separacin o la eliminacin del
componente indeseado. Sin embargo, debido a que en este caso la seal de inters est
Figura 9.1
41
constituida por frecuencias altas mientras el
ruido contaminante est constituido por
frecuencias bajas, un filtro pasa-altos puede
ayudar. En la figura 9.2 se muestra como dicho
filtro deja las espigas intactas sobre una lnea
de base plana (trazo inferior), ya que ha sido
despojada de toda oscilacin lenta. Hay que
enfatizar que el uso de este acercamiento
requiere, como condicin indispensable, que la
seal y el ruido difieran en cuanto a su
respectiva composicin de frecuencias
constituyentes, de lo contrario cualquier filtro
afectar tanto el ruido como la seal.

Reduccin del ruido a travs de promedio de ensamble
Hay un segundo enfoque que se puede utilizar con seales que sean gatilladas por un
estmulo especfico, bajo el control del experimentador, y cuyo curso temporal sea
estereotipado: aqu la estrategia es repetir numerosas veces la estimulacin, desencadenando
cada vez la respuesta a ser registrada, y promediar los trazos obtenidos. Puesto que en todas
las instancias la seal se repite de la misma manera, mientras que las fluctuaciones del ruido,
siendo estocsticas, tienden a ocurrir fuera de fase en
sucesivas repeticiones, la operacin de promediar va
atenuando el ruido (transientes en diferentes direcciones
se van cancelando), mientras se preserva la seal (la
cual tiene las mismas caractersticas en todas las
repeticiones). La Figura 9.3 muestra el ejemplo de un
trazo de una seal ruidosa producida por la aplicacin de
un estmulo, y el efecto de repetir y promediar 16 o 64
veces el mismo evento. El progresivo incremento en la
calidad de la seal es evidente (se puede demostrar que
la mejora en el cociente seal-ruido crece con la raz
cuadrada del nmero de repeticiones. Notar que para que
este enfoque funcione es imprescindible que exista una
relacin fija estmulo-respuesta y una forma reproducible
de sta ltima, requisitos que en cambio no tienen
relevancia para la reduccin del ruido por medio de filtros.
Por otra parte, si esta condicin se cumple, es posible
obtener un significativo incremento de la relacin seal-
ruido aunque las bandas de frecuencias que representan a la seal y al ruido, respectivamente
estn sobrelapadas (situacin en la cual, como ya se ha dicho, los filtros no funcionaran).
Parte de la experticia de un experimentador que registre seales elctricas consiste en
optimizar la relacin S/R mediante el uso de estas y otras estrategias.

Figura 9.3

Figura 9.2
42

10. Transductores
En las secciones anteriores se han esbozado algunos principios bsicos de mediciones
elctricas; posteriormente se examinar como empalmar dicha clase de registros con un
computador, el cual permita adquirir, almacenar y procesar datos. Pero antes de proceder es
importante recalcar que todas estas consideraciones realmente se extienden a muchos otros
tipos de mediciones, aunque la forma de energa originalmente implicada no sea elctrica, tal
como el caso de la temperatura, fuerzas mecnicas, ondas acsticas, concentraciones
qumicas de ciertas sustancias, y luz. En todas estas instancias la variable a ser medida es
primero convertida a electricidad, as que luego se pueden aplicar exactamente los mismos
acercamientos que se utilizan para mediciones elctricas. La clave radica en disponer de algn
aparato, denominado transductor, cuya funcin es precisamente encargarse de esa conversin.
Esta estrategia, por supuesto, no es novedosa y la naturaleza la ha adoptado hace millones de
aos: por ejemplo, el mismo proceso ocurre en los rganos sensoriales de cualquier
organismo, los cuales absorben diferentes modalidades de energa para transducirlas a
cambios elctricos en la membrana celular que constituyen el lenguaje biolgico utilizado por el
organismo para procesamiento y transmisin de informacin. A continuacin se describirn
algunos ejemplos comunes de trasductores que tienen amplia utilizacin en muchas ramas de
la ciencia, incluyendo biofsica, fisiologa y ciencias biomdicas en general.
Fuerza
El ms comn de los trasductores de fuerzas mecnicas, llamado medidor de deformacin
(strain gauge) explota los cambios en la resistencia que ocurren
en una lmina de material que sea sometida a tensin o
compresin, con la resultante deformacin: si se estira, la
longitud, l, aumenta, y el sensor se adelgaza (A, el rea de
seccin, disminuye); por consiguiente, la resistencia aumenta
(recuerden que R = l/A); la compresin producir el efecto
opuesto (Figura 10.1A). Para lograr que minsculos cambios en
longitud de un sensor sometido a estiramiento se traduzcan en
cambios apreciables de resistencia los strain gauges tienen un
diseo ingenioso y sencillo: simplemente, una delgada lmina de
conductor forma una tupida serpentina, montada sobre un
sustrato deformable (Figura 10.1B). Si la serpentina tiene n
vueltas, al estirar (o comprimir) el sensor en la direccin
longitudinal por una distancia l, el cambio total de longitud de la
serpentina ser nl, es decir, se incrementar
multiplicativamente con el numero de segmentos; con eso se
logra que los cambios en su resistencia sean tambin
significativos. Para medir fuerzas, se coloca el sensor de tal
manera que la fuerza en cuestin cause una deformacin a lo
largo de su eje principal, y luego se trata entonces de monitorear
continuamente la resistencia del aparato, por ejemplo, pasando
una corriente y registrando el voltaje resultante (ya que V = IR). La Figura 10.2 ilustra una
aplicacin tpica en fisiologa o biofsica: se conecta un strain gauge en serie con un msculo
escindido (Panel A) o inclusive una fibra muscular aislada. A su vez, el otro lado del medidor
est sujetado a un soporte rgido. Al aplicar un estmulo elctrico al msculo, que gatilla una
contraccin, el sensor, al estirarse, mide la fuerza ejercida (Panel B). Otro tipo transductor
mecano-elctrico se fabrica con cristales piezoelctricos, materiales compuestos de molculas
que posean un marcado momento dipolo (es decir, sus molculas son polares). Al deformarse,

Figura 10.1
43
se re-alinean los momentos dipolos, lo cual, tratndose de
un material en estado cristalino, ocurre de una manera
ordenada; por lo tanto, la re-distribucin de las cargas se
suma sistemticamente, originando un cambio de voltaje.
La Figura 10.3 ilustra este concepto. Los cristales
piezoelctricos funcionan de una manera reversible, as
que se pueden aprovechar tambin para aplicar una fuerza
o inducir un desplazamiento diminuto de un objeto si se
aplica un voltaje al cristal. El exquisito control que se puede
ejercer hace este
elemento ideal para
aplicaciones en
biofsica celular, en
las cuales se debe
desplazar una
estructura
microspica como
los cilios mecano-
sensibles de una
clula individual.
Ondas acsticas
El micrfono es un artculo familiar a todos, y funciona colectando las ondas acsticas que
inciden sobre una membrana flexible, y acoplando su movimiento vibratorio resultante a un
transductor mecano-elctrico. Entre los ms comunes se
encuentran: (i) un cristal piezoelctrico, el cual produce un
diminuto voltaje cuando se somete a deformacin (ii) Fabricando la
membrana de un material elctricamente conductivo, y
colocndola muy cerca de otra lmina metlica fija; este arreglo
(dos conductores cuya superficie de rea, A, es significativa,
separados por una corta distancia, d) tiene propiedades de
condensador. Cuando las ondas de sonido hacen que las dos
lminas se acerquen o se alejen una de otra, el valor de la
capacitancia cambia (recuerden que C A/d); por lo tanto, a un
voltaje fijo la carga almacenada cambia (Q = CV). Monitoreando
continuamente la corriente capacitativa y convirtindola a un
voltaje se genera por lo tanto una seal elctrica que replica la
forma de las ondas sonoras. Este diseo, llamado por obvios
motivos micrfono de condensador, se muestra en la Figura 10.4.
Temperatura
Uno de los conversores temperatura-electricidad ms utilizados es la termocopla, la cual se
basa en el as llamado efecto Seebeck (que toma el nombre del fsico que primero lo describi):
si se altera la temperatura en una unin entre dos metales dismiles, se forma un potencial
elctrico entre los dos lados de la unin. Este fenmeno refleja el hecho de que, al ser diferente
la conductividad trmica de los dos metales, se forma un gradiente de temperatura. Los
electrones de valencia en la regin caliente, sufriendo mayor agitacin trmica, pueden migrar
ms fcilmente, alejndose hacia la regin ms fra, con lo cual se establece una diferencia de
voltaje. La Figura 10.5 muestra esquemticamente el sensor esfrico de la termocopla
(usualmente de dimensiones de 1 mm o menos); la aplicacin de calor produce un gradiente de
temperatura a travs de la unin bi-metlica, lo cual da origen a un voltaje, el cual se puede
Figura 10.2

Figura 10.4

Figura 10.3
44
medir remotamente. Diferentes uniones bi-metlicas manifiestan distinta
sensibilidad, y se utilizan segn el rango de temperaturas que se quiere
medir.
Luz
Existe una gran variedad de conversores de luz en electricidad. Algunos se
basan en que la absorcin de un fotn por parte de cierto material desplace
por completo un electrn del orbital externo, generando un electrn libre y
dejando atrs un tomo ionizado (el efecto fotoelctrico). Con esto se puede
bien sea medir la corriente (el flujo de los electrones liberados) o bien el
potencial electroesttico que se acumula en la matriz del material; ambas
variables sern funcin de la cantidad de luz incidente. En la seccin de
ptica de examinar un tipo de detector basado en el efecto fotoelctrico.
Alternativamente, se explotan ciertos materiales que en estado basal no
conducen electricidad (sus electrones externos se encuentran en orbitales
de valencia desde los cuales son poco propensos a saltar a un tomo vecino); la absorcin de
un fotn, sin embargo, puede elevar un electrn a un orbital ms externo, desde el cual s
pueda migrar (la as llamada banda de conduccin).
En la aplicacin ms sencilla, este fenmeno
representa simplemente un cambio de resistencia
elctrica en dicho material, que ocurre en respuesta
a la iluminacin (una fotoresistencia); basta
entonces aplicar un voltaje y medir la corriente
resultante (o viceversa, imponer una corriente y
medir el voltaje que se genera), y, por la ley de
Ohm, el cociente V/I arroja R, cuyo valor refleja el
flujo de luz incidente. La Figura 10.6 ilustra la
deteccin de luz por una fotoresistencia: los fotones
incidentes, al ser absorbidos por los tomos, elevan
los electrones de valencia a la banda de conduccin
(mayor energa), con lo cual se permite el flujo de
corriente en respuesta a un voltaje aplicado entre
los terminales de la fotoresistencia.
Concentraciones qumicas: hay por lo menos dos acercamientos muy comunes para generar
seales elctricas que reflejen la concentracin de sustancias especficas en una solucin. El
primero se aplica a molculas elctricamente cargadas (iones), y se basa en una particin
semi-permeable separa el exterior de la sonda de su interior (donde tambin se encuentra una
solucin electroltica). La permeabilidad de la particin es selectiva para algn tipo de sustancia
especfica (por ejemplo, protones, Na
+
, K
+
etc.); esto ocurre naturalmente en algunos tipos de
vidrio, pero tambin se puede lograr haciendo que la particin sea alguna matriz lquida
hidrofbica en la cual se encuentren disueltas molculas que pueden especficamente ligar el
soluto en cuestin, acarrendolo de un lado al otro. Dicho in est presente tambin al interior
de la sonda; la diferencia de concentracin entre el compartimiento externo a ser medido y el
interior de la sonda impulsa un flujo difusional (que puede ser facilitado por los acarreadores),
el cual a su vez genera una separacin de carga elctrica. Este movimiento cesa cuando el
potencial electrosttico resultante contrarresta justamente la tendencia difusional, i.e. se
estabiliza al potencial de equilibrio (o potencial de Nernst) de ese ion (E
X
= RT/zFln([X
e
]/[X
i
]),
donde R es la constante universal de gases, T la temperatura en grados Kelvin, z la valencia
del ion, F la constante de Faraday, [X
e
] y [X
i
] las concentraciones externa e interna del ion,
respectivamente). Como este tiene un valor proporcional al logaritmo del gradiente de

Figura 10.6

Figura 10.5
45
concentracin, el voltaje generado refleja la
concentracin del ion de inters en el medio externo.
Un electrodo de pH opera justamente de esta manera.
En la Figura 10.7 se ilustra el esquema bsico de
medicin por medio de un electrodo selectivo a un in
X. Este ha sido uno de los acercamientos que ha
permitido determinar las concentraciones de iones
fisiolgicamente relevantes en los fluidos intersticiales y
en el citoplasma (lo segundo, por supuesto, requiere la
fabricacin de sondas microscpica que se puedan
introducir al interior de una clula).
Existe otra estrategia que funciona con sustancias que
sean fcilmente oxidables. En este caso se tiene un
electrodo metlico (usualmente grafita, o platino) en la
solucin, el cual es mantenido a un voltaje en exceso del potencial de xido-reduccin de la
sustancia de inters. En ausencia del sustrato, no puede haber conduccin DC entre metal y
lquido, pese al voltaje aplicado (los electrones de la matriz del electrodo no se pueden
transformar en iones y disolverse en el medio lquido, ni viceversa); as que la superficie del
electrodo queda polarizada, pero no fluye corriente (Figura 10.8A). Pero si una molcula
oxidable X (Figura 10.8B, crculos amarillos) se adsorbe a la superficie del electrodo, el fuerte
campo elctrico le arrebata un
electrn (oxida el sustrato), y este s
puede viajar por el electrodo. Por
consiguiente, se genera una
corriente (corriente oxidativa)
proporcional a la rata de eventos de
oxidacin, la cual a su vez es
proporcional a la concentracin del
sustrato. De nuevo, hemos logrado
generar una seal elctrica que
refleja la concentracin de una
sustancia qumica. Debido a que
una gran variedad de sustancias bio-
activas (como por ejemplo los neuro-transmisores que las clulas del sistema nervioso
secretan) son oxidables, este acercamiento ha sido muy til para monitorear la forma como las
neuronas se comunican unas con otras a travs de un lenguaje qumico. Variantes de estas
tcnicas electroqumicas para determinar concentraciones de sustancias oxidables se conocen
como amperometra y voltametra.
Figura 10.7
Figura 10.8
46
11. Adquisicin computerizada de datos.
Habiendo revisado algunos principios elementales de mediciones elctricas, tenemos ahora
que considerar como generar un registro permanente de alguna variable medida a lo largo del
tiempo. En la actualidad, casi sin excepcin, todo proceso de adquisicin de datos en ltima
instancia implica su almacenamiento en forma de archivo digital en un computador. No
solamente esto permite su rpido acceso, sino brinda enormes posibilidades para el
procesamiento y la representacin de dicha informacin. Estas consideraciones nos obligan a
familiarizarnos con la trasformacin de la informacin en un formato idneo para lograr este
objetivo. Las seales elctricas, como por ejemplo el voltaje y la corriente, son variables
continuas (es decir pueden cambiar por cantidades arbitrariamente pequeas y adquirir por lo
tanto un continuo de valores); adems pueden cambiar continuamente en el tiempo. Un
computador digital, en cambio, opera con una cantidad finita de nmeros (dictada por la
memoria disponible), cada uno de los cuales solo puede asumir un abanico finito de valores
(dictado por el nmero de dgitos que se asignan a cada nmero). Por lo tanto, la adquisicin
de datos por computador est sujeta a dos limitaciones intrnsecas al proceso de digitizacin (o
conversin anlogo-digital): (i) Aunque la
variable en cuestin est en un continuo
temporal, slo podremos ceirnos a un
conjunto finito de sus valores, muestreados
en ciertos momentos discretos (tpicamente
a intervalos regulares). (ii) Cada valor de la
variable en cuestin debe ser redondeado,
si es necesario, para respetar el requisito
de que slo se dispone de un nmero fijo
de dgitos para representarlo. La Figura
11.1 muestra una seal anloga (trazo
azul) y el conjunto de valores muestreados
(puntos rojos, interpolados); notar que
variaciones finas de la seal, que ocurren
entre sucesivas nuestras (las cuales son
tomadas a intervalos de T), o que se
cien a valores comprendidos entre dos niveles contiguos de digitizacin (V), no son
registrados por el proceso de conversin anlogo-digital.

El computador utiliza un sistema numrico binario, es decir, sus dgitos individuales solo
pueden asumir dos valores (usualmente referidos como 0 y 1); estos representan dos niveles
de voltaje (tpicamente 0 V y +5 V) utilizados por los circuitos de electrnica digital. As que, al
igual que en nuestro acostumbrado sistema numrico decimal, formamos un nmero
constituido por una serie de dgitos, pero en el caso del computador el nmero siempre tiene
una cantidad pre-definida de dgitos, lo cual limita su precisin. Por ejemplo, si eligiramos
establecer que los dgitos (llamados bits) que constituyen nuestro nmero binario fueran 8, ste
podra solamente asumir 256 posibles valores: cada bit tiene 2 posibilidades, as que un
conjunto de 8 bits (llamado un byte) puede tener 2
8
valores, desde 0 (=00000000) hasta 255
(=11111111). Si fueran nmeros de 12 bits, habra 4096 posibilidades, si fueran de 16 bits
habra 65532, etc. Al adquirir datos, se dedica una cierta rea de la memoria RAM del
computador para esta tarea (a veces llamado el buffer de adquisicin), y sta tiene un tamao
dado: por ejemplo si el buffer fuera de 200 KB, y los valores muestreados fueran representados
en nmeros binarios de 16 bits (2 bytes), podramos almacenar 100 mil muestras. Qu tan
rpido se nos acabara la memoria disponible depender de la rapidez, o mas exactamente, la
frecuencia, con la cual muestreramos la variable. Por ejemplo, si lo hiciramos 5 mil veces por

Figura 11.1
47
segundo (5 KHz, es decir una muestra cada 200 s), podramos seguir muestreando durante
20 segundos, al cabo de los cuales habramos agotado la memoria y tendramos que
interrumpir el proceso. El arte (en realidad, la ciencia) de adquirir datos por computador radica
en saber minimizar la prdida de informacin implcita en el proceso de conversin anlogo-
digital. A continuacin se esbozarn los dos aspectos ms importantes.

Rango dinmico
Un conversor anlogo-digital (ADC, analog-digital converter) puede recibir un voltaje dentro de
un rango definido (por ejemplo desde -10 V hasta +10 V) y convertirlo a un nmero binario de
una cierta resolucin (llamada la profundidad de bits, por ejemplo, 8 bits). Al hacerlo, asigna el
nmero binario menor (000000, es decir 0 decimal) al valor mnimo de su rango permitido (en
nuestro ejemplo, -10 V), y el numero binario mximo (11111111, o 255 decimal) al valor
mximo (que en este caso sera +10 V) [Nota: existen otras formas de codificacin binaria para
representar nmeros positivos y negativos, pero el esquema presente es representativo y basta
para lo que se quiere examinar aqu]. Valores de voltaje de entrada que estn bien sea por
debajo o por encima del rango permisible seran asignados a 0 o 255, respectivamente, sin
hacer distinciones de que tan negativo o positivo es el voltaje en cuestin: en ambos casos el
conversor estara saturado, habiendo excedido su capacidad (y si se excede ese rango de
voltaje por un margen muy grande se puede quemar el conversor!). En cambio, voltajes dentro
del rango lcito seran convertidos en nmeros variables entre 0 y 255, segn su tamao; en
otras palabras, el rango entre -10 V y +10 V (en este ejemplo) se dividira en 256 intervalos
iguales (asumiendo conversin en 8 bits), y cualquier voltaje al caer en un intervalo dado se
convertira en el nmero binario correspondiente. Por supuesto, uno quisiera optimizar este
proceso, el cual sufre del problema de no hacer distinciones ms finas que el tamao de los
256 escalones. Esta limitante, de por s significativa, es susceptible de empeorar mucho ms
si el rango dinmico de la seal a ser medida (es
decir, el voltaje mnimo y mximo que la seal de
inters efectivamente asume en el curso de una
medicin) no fuera ms o menos equiparable al
rango dinmico de entrada del ADC: para hacer un
ejemplo, el conversor podra ser capaz de recibir
valores desde -10 a +10 V, y ya sabemos que si la
seal a ser medida se excediera en cualquiera de
los extremos, por ejemplo llegando hasta voltajes
de +27 V, entonces parte del tiempo el conversor
entrara en saturacin, asignando
indiscriminadamente a toda excursin por encima
de +10 V el valor 255. Esto, por supuesto no sera
una representacin fiel de la seal. Pero un
problema igualmente serio ocurre si la seal a ser
medida fuera demasiado pequea y, por ejemplo,
oscilar solamente entre -0.05 V y +0.1 V (-50 mV a +100 mV). En nuestro ejemplo, el tamao
de los escalones del ADC es de 78 mV (rango dinmico del conversor dividido por el numero
de valores posibles, es decir [+10 [-10]]/256] = 0.078 V), as que nuestra seal apenas dara
excursiones que abarcaran solo unos 3 escalones, y su apariencia, una vez digitizada, sera
una serie de saltos rectangulares (pese a haber podido ser originalmente una seal que
cambiara de una forma lisa y continua, Figura 11.2); en particular, todas la fluctuaciones cuya
amplitud hubiera sido menor que 78 mV desapareceran del registro, quedando convertidas al
valor constante = 0. Una vez efectuada la conversin digital, no hay manera de corregir estas
fallas y recuperar la informacin perdida. Estas consideraciones nos indican que es
imprescindible tener una idea del rango de valores de la variable a ser medida, para

Figura 11.2
48
amplificarla o atenuarla antes de entrar al ADC, de tal manera que ocupe una porcin
generosa del rango dinmico del ADC, sin llegar a saturarlo en ninguno de los dos extremos.

Frecuencia de muestreo
Un problema paralelo ocurre con el requisito de tener que muestrear solamente en momentos
discretos; aqu la dificultad radica en poder resolver los cambios temporales de la seal. Si la
seal cambiara lentamente (por ejemplo, una onda sinusoidal que realizara una oscilacin cada
segundo i.e. 1 Hz), evidentemente muestreando a 100 Hz podramos dar cuenta con bastante
precisin de su crecer y decrecer gradual (cada ciclo estara representado por 100 puntos).
Pero eso no ocurrira si, con la misma frecuencia de muestreo, tratramos de seguir el rastro de
un voltaje que estuviera oscilando a 1000 Hz, ya que solamente se tomara una muestra cada
10 ciclos de la onda, y claramente perderamos toda posibilidad de seguir sus cambios. Para
entender como ajustar correctamente la frecuencia de muestreo, hay que introducir, aunque
sea como simple concepto (sin matemticas ni demostraciones) dos teoremas.

Toda onda que cambia continuamente en el tiempo se puede representar como la
superposicin de muchas ondas sinusoidales (i.e. senos y cosenos) de diferentes
frecuencias, amplitudes y fase. La Figura 11.3 proporciona un ejemplo, mostrando como
la representacin de una onda cuadrada por suma de sinusoides se torna cada vez mas
precisa a medida que uno aade ms y ms componentes de frecuencias
progresivamente mayores. Este
enunciado se conoce como el
Teorema de Fourier. Uno de los
aspectos de gran importancia de esta
deduccin es que muchas veces lidiar
con una simple funcin sinusoidal es
muy fcil, mientras que puede no serlo
con una funcin cuyo curso
temporal es complicado. Si
necesitamos aplicar algn
procedimiento computacional a una
funcin complicada, a menudo resulta conveniente descomponerla en sus elementos
constituyentes, aplicar las operaciones a cada uno de ellos, y re-constituir la funcin
resultante, sumando los resultados individuales.

Si se muestreara una onda sinusoidal simple por lo menos dos veces por cada ciclo, se
puede reconstruir su curso temporal (acudiendo a un malabarismo matemtico que en
este contexto no viene al caso detallar). Este
enunciado se conoce como el teorema de
muestreo de Nyquist. Por supuesto, entre
mayor el nmero de muestras por ciclo de
oscilacin, ms fcil ver, por simple
interpolacin, que se trata de un sinuside de
cierta frecuencia, sin necesidad de cmputos
complejos. Pero si la frecuencia fuera menor
que 2/ciclo, no sera posible discernirla como
tal: la Figura 12.4 muestra un ejemplo en el
cual una onda rpida (trazo rojo) fue
muestreada con baja frecuencia (menos de 2
muestras por ciclo), y la secuencia resultante de valores da la idea errnea de que se
tratara de un sinusoide lento (trazo azul). A este fenmeno se le llama aliasing. De all

Figura 11.4
49
la necesidad de asegurarse que la seal medida no contenga frecuencias mayores que
2 la rata de muestreo; el uso apropiado de filtros pasa-bajos colocados antes del
conversor A/D previene esta clase de errores.

Ahora juntemos los dos conceptos. Si tenemos una seal arbitraria (cuya forma fuera compleja,
no un simple sinuside) podemos descomponerla en sus sinusides constituyentes (su
espectro de Fourier). Por lo tanto, si muestreramos dicha seal con una frecuencia por lo
menos el doble que la frecuencia del sinuside ms rpido, tendramos la certeza de que cada
componente estara muestreado lo suficientemente a menudo para garantizar su reproduccin
fiel, y por lo tanto lo mismo se aplica a la suma de todos ellos, es decir, nuestra seal original.
Dicho en otras palabras, si se conoce de antemano el rango de frecuencias constituyentes de
una seal (su ancho de banda) se puede definir cual es el lmite mnimo de frecuencia de
muestreo para evitar prdida de informacin. De no ser posible, se puede modificar la seal
misma, pasndola por un filtro que rechaza frecuencias mayores a un cierto lmite (un as
llamado filtro pasa-bajos) antes de que llegue al conversor anlogo-digital, y luego establecer la
rata de muestreo con base en la frecuencia crtica del filtro.

50
12. Anlisis de sistemas lineales
Definicin de sistema lineal
Los conceptos de anlisis en el dominio de frecuencia (es decir, representar alguna variable no
en trminos de como cambian sus valores en el tiempo, sino en trminos de la superposicin
de sinusoides de diferentes frecuencias, amplitudes, y fases) se pueden extender al estudio de
como se comportan ciertos sistemas cuando se someten a estimulacin. Esto nos brinda una
descripcin compacta de su relacin estimulo-
respuesta, la cual sintetiza su desempeo y, como
describimos ms abajo, nos permite predecir cual
ser su respuesta ante un estimulo arbitrario. Esta
poderosa herramienta se aplica a una cierta clase de
sistemas, conocidos como sistemas lineales.
Aclaremos que quiere decir. Llamamos un sistema a
alguna entidad S, a la cual se aplica una estimulacin
(el input) y se produce alguna respuesta (el output);
un ejemplo podra ser un rgano sensorial, que se
expone a estimulacin de la modalidad energtica
apropiada y se monitorea la frecuencia de las
descargas neuronales que produce en el
correspondiente nervio aferente. Tanto el input como
el output pueden variar en el tiempo, y por lo tanto
son funciones; llammoslas X(t) y Y(t), respectivamente; el sistema opera sobre X(t),
transformndolo en Y(t): S[X(t)] = Y(t). En un sistema lineal, si se aplicara un input que
representa la suma de dos estmulos, X1(t) y X2(t), la respuesta resultante sera la suma de las
respuestas a los dos estmulos individuales:

Si X(t) = X1(t) + X2(t) entonces Y(t) = Y1(t) +Y2(t)

donde Y1(t) = S[X1(t)], y Y2(t) = S[X2(t)]

La Figura 12.1 muestra grficamente este comportamiento. Tambin, si modificramos la
amplitud de un input, multiplicndola por una constante, la respuesta se vera multiplicada por
la misma constante: en otras palabras:
S[aX(t)] = aY(t)
La Figura 12.2 ilustra un ejemplo. Notar que estas
propiedades no son para nada generales de todo
sistema: para dar un ejemplo que las viole,
consideremos una fibra nerviosa. Si se aplica a un
axn un estmulo elctrico por encima del umbral, se
produce un potencial de accin. Si ahora aplicamos
un estmulo dos veces ms intenso, se produce un
potencial de accin similar (no el doble de grande!):
evidentemente no se mantiene una proporcionalidad
entre estmulo y respuesta, y diramos que este
sistema es no-lineal.
Funcin de transferencia

Figura 12.1

Figura 12.2
51
Ahora pasamos a examinar la manera como la seal es transformada para generar la seal de
salida. Un sistema lineal posee la fundamental propiedad de que la respuesta a un input
sinusoidal es tambin un sinusoide de la misma frecuencia (aunque su amplitud y fase, por
supuesto, pueden cambiar). La importancia de estas caractersticas radica en que, como ya
sabemos, una funcin arbitraria (fsicamente realizable) siempre se puede descomponer, por el
teorema de Fourier, en sus componentes sinusoidales. En un sistema lineal la respuesta a un
input compuesto de la suma de ciertos sinusoides, debe ser igual a la suma de las respuestas a
cada uno de los sinusoides (por definicin de linealidad). Por lo tanto, si conociramos para
cada frecuencia la manera como el sistema transforma un input sinusoidal, podramos predecir
la respuesta para cualquier estimulo: lo que haramos es (i) descomponer el input arbitrario
(representndolo como la suma de sinusoides de diferentes amplitudes y fase), (ii) aplicar a
cada constituyente la trasformacin predicha (lo cual consiste sencillamente en un cambio de
amplitud y fase) y (iii) sumar todas las respuestas elementales obtenidas. Solo hace falta haber
establecido de antemano cual es el cambio de amplitud y fase que sufre un sinusoide,
dependiendo de su frecuencia. Esta regla de transformacin es lo que se conoce como la
funcin de transferencia de modulacin, y caracteriza plenamente el comportamiento de un
sistema lineal. La Figura 12.3 muestra el proceso: para predecir la respuesta al input, ste se
decompone en sus constituyentes
sinusoidales (anlisis de Fourier,
ilustrado por los trazos a la
izquierda); en este caso, para
simplificar, asumimos que solamente
3 frecuencias (f
1
, f
2
, y f
3
) contribuyen
a la seal original. Al pasar por el
sistema, la amplitud y la fase de cada
uno de los tres sinusoides son
modificadas segn la funcin de
transferencia (representada por las
dos grficas en el panel central),
generando los tres sinusoides de de
la derecha. Notar que segn la
funcin de transferencia f
1
no sufre
atenuacin alguna, ni cambio de
fase; en cambio f
3
debe reducirse
considerablemente en amplitud y
desfasarse. Las respuestas
sinusoidales resultantes luego se suman para reconstituir la respuesta del sistema al estmulo
inicial (sntesis). Las aplicaciones de este tipo de anlisis para determinar el desempeo de un
circuito son obvias, y de hecho ya hemos estado tratando estos mismos conceptos, aunque
fuera de una manera un poco encubierta, cuando se discuti la nocin de impedancia y cuando
se describi la funcin de los filtros pasa-bajos y pasa-altos. Tal vez es menos obvia la
trascendencia de este mismo acercamiento en fisiologa, pero resulta ser una herramienta
crucial en muchos campos, y no necesariamente cindose a fenmenos elctricos. Por
ejemplo, el estudio del sistema auditivo claramente se puede beneficiar de un anlisis en el
dominio de frecuencia, y la caracterizacin de la funcin de transferencia nos brinda no
solamente una descripcin compacta de sus lmites de desempeo, sino tambin proporciona
una visin de como una onda acstica compleja (un comps de msica, una frase hablada) es
transformada en cada paso del proceso auditivo: desde las vibraciones inducidas en la
membrana timpnica, a la conversin en potenciales de receptor de las clulas ciliadas, a su
transmisin sinptica a las neuronas del ganglio espiral que forman el nervio auditivo, con la
consecuente modulacin de la produccin de potenciales de accin. En la medida de que las
Figura 12.3
52
condiciones de linealidad puedan justificarse, cada una de esas transformaciones se puede
caracterizar por su propia funcin de transferencia. Ms an, aunque hasta el momento se ha
supuesto que las oscilaciones de los sinusoides ocurren en el tiempo, en realidad esta
restriccin es innecesaria y se pueden considerar sinusoides que varen, por ejemplo, en el
espacio. Un ejemplo est dado por el estudio
de la agudeza visual: en lugar de examinar la
discriminacin de dos puntos apenas
separados (como se haca tradicionalmente), se
pueden considerar estmulos visuales
constituidos por gratculos (i.e. bandas
alternantes claras y oscuras), cuyo grosor (es
decir, cuya frecuencia espacial, especificada en
#ciclos/distancia) vare. La capacidad de
discernir detalles finos puede caracterizarse
entonces en trminos de la funcin
transferencia de de modulacin espacial: que
tanto se atena la percepcin de patrones
espaciales dependiendo de la frecuencia (uno
se imagina que si las barras son demasiado
finas, el sujeto con dificultad discernir que se
alternan bandas claras y oscuras, o inclusive
solo percibir un campo uniforme). La Figura
12.4 muestra este acercamiento: el panel est constituido por un alternarse de barras
verticales (en realidad ondas que varan sinusoidalmente entre negro y blanco), cuya
frecuencia espacial aumenta progresivamente hacia la derecha (i.e. crece el nmero de barras
por unidad de distancia horizontal, o, equivalentemente, disminuye el grosor de las barras). El
contraste de las barras (la diferencia entre la parte oscura del ciclo, y la clara) disminuye
gradualmente hacia arriba, desde negro vs. blanco (100% contraste), hasta matices de gris
prcticamente uniformes (0 contraste). Hay un rango de frecuencias espaciales, entre bajas y
medianas, que el observador puede discernir an con poco contraste (la sensacin es que las
barras se extienden considerablemente hasta arriba), pero cuando la frecuencia espacial
incrementa mucho solamente logramos discernir esas barras muy finas si tienen alto contraste
(i.e. la porcin inferior). Es decir, el perfil de hasta donde se extienden las barras verticalmente
proporciona directamente la funcin de transferencia de modulacin, que describe la agudeza
visual del observador! (ensayar como cambia acercndose o alejndose de la grfica). Aunque
hemos invadido el terreno de la ptica fisiolgica, vemos que los mismos acercamientos
analticos que se utilizan en electricidad siguen siendo valiosos.
Anlisis de frecuencia
Ahora vamos a tratar de matizar la sensacin de que el anlisis en el dominio de frecuencia
implica operaciones absolutamente misteriosas; ms especficamente, se pretende ilustrar de
donde sale la extraccin de las frecuencias sinusoidales que contribuyen a una seal arbitraria.
Solamente esbozaremos los aspectos conceptuales ms salientes, sin una derivacin detallada
y rigurosa. El mtodo se basa en un simple resultado de la trigonometra: consideremos dos
funciones sinusoidales, X
1
y X
2
, con amplitud, frecuencia, y fase arbitrarias:
X
1
(t) = A
1
sin(
1
t +
1
)
X
2
(t) = A
2
sin(
2
t +
2
)

Figura 12.4
53
(A, , siendo la amplitud, la frecuencia angular, y la fase, respectivamente). Multiplicamos
X
1
(t)X
2
(t) i.e. A
1
sin(
1
t +
1
) A
2
sin(
2
t +
2
). El resultado, segn una conocida identidad
trigonomtrica, es:
A
1
A
2
{cos[(
1
-
2
)t +(
1
-
2
)] - cos[(
1
+
2
)t +(
1
+
2
)]}
Es decir, el producto de dos sinusoides es la superposicin de 2 sinusoides cuyas frecuencias
son la suma y la resta (
1
-
2
y
1
+
2
), respectivamente, de las frecuencias de los dos
operandos (Figura 12.5). Esta
funcin resultante, en general,
tambin es una seal AC con
promedio cero, exceptuando la
situacin especial en la cual las
dos frecuencias coinciden,
1
=
2
, en cuyo caso (
1
-
2
) = 0,
con lo cual queda:
A
1
A
2
[cos(
1
-
2
) - cos(2t +
1
+
2
)]
El primer trmino coseno es una constante, ya que la variable t desapareci, que depende de la
diferencia de fase entre las dos seales (e.g. si
1
=
2
. esta constante resulta ser A
1
A
2
, ya
que cos (0) = 1). En cambio el segundo trmino es un sinusoide con frecuencia 2. Ahora,
consideremos lo que sucede al integrar estas funciones resultantes de una multiplicacin entre
sinusides (i.e. obtener el rea bajo la curva), lo cual podemos hacer separadamente para los
dos trminos. En el caso de frecuencias iguales para los dos multiplicandos, se trata de dos
sinusides, y en ambos casos la integral es cero porque, tratndose de una funcin peridica
centrada en cero, los valores positivos y negativos se anulan (reas sombreadas de la curva a
la derecha en la Figura 13.6). La situacin es diferente para el producto de dos sinusoides de
igual frecuencia: en este caso la integral del primer trmino arroja un valor no nulo (la del
segundo en cambio s); esto hace que el resultado total de la multiplicacin no sea cero.
Armados de este resultado, abordamos la descomposicin de una funcin cualquiera, F(t), la
cual, segn el teorema de Fourier, debe estar constituida por la suma de diversos componentes
sinusoidales (F(t) = f
1
(t) + f
2
(t) + f
3
(t)+...). Como identificarlos? Sencillamente multiplicando la
funcin F(t) por senos y cosenos de diferentes frecuencias (llamemos genricamente este
conjunto de funciones {X(t)}), e integrando. Para cada sinusoide del conjunto el producto con F
puede representarse como:
X(t)F(t) = X(t) (f
1
(t) + f
2
(t) + f
3
(t)....)
Por la propiedad distributiva de la multiplicacin, es lo mismo que:
X(t)F(t) = X(t)f
1
(t) + X(t)f
2
(t) + X(t) f
3
(t)...
Si la frecuencia del sinusoide X, es diferente a todas las que constituyen F, el resultado de la
integracin ser cero, como ya sabemos. En cambio, si X coincide con la frecuencia de algn
componente de F, podr arrojar un resultado no nulo; ms especficamente, debido a que
multiplicamos F tanto por seno como coseno de cada frecuencia, si uno de los dos productos
es nulo el otro necesariamente no lo es. Repitiendo el proceso con sinusoides X de muchas
frecuencias, podramos compilar una lista de cuales frecuencias estn representadas en F y
que tanto contribuyen.

Anlisis en el dominio temporal

Figura 12.5
54
Las consideraciones anteriores proporcionan
una justificacin de la prctica tan frecuente
de utilizar estmulos que varan de una
manera sinusoidal para caracterizar el
comportamiento de un sistema; esto recurre
en fsica, biologa, ingeniera y hasta en
ciencias econmicas. Es lcito preguntarse si
el otro acercamiento, aparentemente ms
intuitivo y natural, de mirar como las diferentes
variables cambian en el tiempo, es
intrnsicamente menos apropiado. Resulta
que no es as: el dominio temporal y el
dominio de frecuencia co-existen como
mundos paralelos, y ambos permiten extraer
la misma informacin. As como los estmulos
sinusoidales son crticos para el anlisis
dentro del dominio de frecuencia (porque
permiten descomponer una seal arbitraria),
en el caso del dominio temporal tambin hay tipos de estmulo que los hacen especialmente
tiles. Aqu el ms clave es el impulso, es decir, un estmulo que idealmente debera ser
infinitamente breve; en la prctica se busca algo cuya duracin simplemente sea muy corta en
relacin a la escala temporal de las medidas a efectuar y de la rapidez del sistema bajo estudio.
De nuevo, la lgica es la misma: un estmulo arbitrario que vare en el tiempo se puede
considerar como la sucesin de muchos impulsos breves que cambian en amplitud (Figura
12.6A); se trata de otra manera de descomponerlo. Si el sistema cumple las condiciones de
linealidad, y es invariante en el tiempo (i.e. la forma como el sistema responde a un estmulo
dado no vara con el tiempo) entonces al conocer su respuesta a un impulso estndar (Figura
12.6B) se puede reconstruir la respuesta ante un estmulo arbitrario como la suma de muchas
respuestas a impulsos de diferentes amplitudes, escalonadas en el tiempo. Por lo tanto, la
respuesta impulsiva de un sistema lo caracteriza totalmente, de la misma manera como lo hace
la funcin de transferencia de modulacin. De hecho, resulta que las dos entidades son
equivalentes en los dos dominios paralelos, y se puede pasar del uno a la otra por una cierta
transformacin matemtica (que resulta ser, una vez ms, la transformada de Fourier). Desde
el punto de vista analtico, la funcin de transferencia puede ser ms conveniente para
proporcionar una panormica inmediata de las capacidades del sistema, pero las condiciones
especficas de una medicin experimental determinan en ltima instancia cuando es preferible
un acercamiento o el otro. Estos argumentos explican porque un fisilogo, por ejemplo, muy a
menudo se cie al uso bien sea de estmulos muy cortos, o bien de estmulos sostenidos pero
modulados sinusoidalmente.

Falta solamente aadir una nota de sobriedad a estas consideraciones que parecen mostrar el
anlisis de sistemas lineales como una panacea universal: muchos sistemas (la mayora, muy
probablemente) no son lineales. Que hacer entonces? No es imprescindible abandonar por
completo este acercamiento: resulta que an para un sistema no lineal el cambio en el output
que se obtiene al modificar muy poco el input siempre guarda una relacin aproximada de
proporcionalidad entre estmulo y respuesta; por consiguiente, todava podemos proceder de la
misma manera, siempre y cuando los estmulos en cuestin cambien muy poco. Si eso fuera
inaceptablemente restrictivo, existen otras tcnicas matemticas de anlisis no-lineal, pero
notablemente ms complejas.

Figura 12.6
55
13. Anlisis de fluctuaciones
Hemos hablado de ruido, de relacin seal-ruido, y de la descomposicin de una seal en
sinusoides de diferentes frecuencias. Por ltimo tocaremos un tema muy recurrente en muchos
campos, desde la neurofisiologa celular a la biofsica de membranas, y que hace referencia a
todos esos conceptos. El tema surge de la necesidad de caracterizar eventos que son
reproducibles pero muy pequeos y tienden a perderse en el ruido de fondo, y/o ocurren
aleatoriamente con una recurrencia tal que se sobrelapan unos a otros. En ambas instancias el
resultado es una seal elctrica que flucta de una manera aparentemente azarosa e
ininterpretable, y nuestra misin es intentar extraer informacin sobre las caractersticas de la
familia de eventos elementales que dan origen a dicha seal. Esta meta parecera irrealista,
pero realmente se puede lograr, aunque sea de una manera indirecta (ya que los eventos
mismos no son en s visualizables). Ejemplos relevantes a la biologa incluyen la
caracterizacin de las corrientes elctricas que fluyen por canales inicos individuales a partir
de un registro global de la corriente de la membrana (que contiene cientos o miles de canales);
o entender las consecuencias de la absorcin de un solo fotn en una clula fotosensible de la
retina, pese a que los efectos puedan ser ms pequeos que el ruido elctrico de fondo.
Sorprendentemente, el anlisis de las variaciones irregulares en la seal puede proporcionar
valiosa informacin al respecto.
Extraccin de la amplitud de los eventos elementales
Supongamos que estuviramos estudiando una seal constituida por la suma de unas ondas
que son estereotipadas, y ocurren estocsticamente en el tiempo e independientemente unas
de otras. Para empezar, quisiramos estimar la amplitud de dichos eventos, la cual
desconocemos, y asumimos que realizamos nuestras observaciones en un estado estacionario
(i.e., pese a la variabilidad, no hay
ninguna tendencia sistemtica de
cambio en el tiempo, tal como un
progresivo aumento en la frecuencia
de ocurrencia de las ondas). En
general, los cambios en la seal
ocasionados por eventos elementales
tienden a contrabalancearse: mientras
uno est en su fase ascendiente, otro
que lo precedi ya est bajando, etc., y
por lo tanto la seal se mantiene
macroscpicamente un nivel estable.
Pero a nivel microscpico, el hecho de
que las transiciones elementales no
estn sincronizadas hace que la seal
constantemente experimente fluctuaciones (siempre hay algn desfase temporal entre el
evento que sube y otro que baja). Es intuitivamente obvio que para un determinado nivel
promedio, el tamao de las fluctuaciones ser mayor entre mas grande el tamao de los
eventos elementales: por ejemplo, si la seal fuera un registro de un potencial bioelctrico con
amplitud promedio 50 mV, y se debiera a la produccin continua de impulsos espontneos de
10 mV de amplitud, evidentemente con la ocurrencia de cada nuevo impulso el cambio en el
voltaje podra llegar a ser una fraccin considerable del valor promedio registrado: los brincos
seran muy notorios y la seal en su totalidad aparecer muy ruidosa e irregular (Figura 13.1A).
Ahora, otro potencial sostenido de la misma magnitud podra deberse a la superposicin de
impulsos similares pero 100 veces ms pequeos. Por supuesto, en este caso har falta 100
veces ms eventos/unidad de tiempo para llegar a totalizar el mismo valor promedio de voltaje.

Figura 13.1
56
Al ser los eventos elementales tan diminutos, las transiciones que ocurren cada vez que un
nuevo evento se dispara sern muy pequeas, respecto al nivel promedio; ms an, al darse
con una frecuencia tan alta ser ms probable que casi en todo momento tiendan a cancelarse
mutuamente: mientras uno est bajando, casi inmediatamente otro sube, ya que ocurren tan
seguidos, y as sucesivamente. En este caso el potencial bioelctrico, pese a tener la misma
amplitud promedio que en el caso anterior, tendr una apariencia mucho ms lisa y menos
ruidosa (Figura 13.1B). Esto nos da una idea: si el grado de variabilidad, relativa al valor
promedio, refleja el tamao de los eventos unitarios, entonces este parmetro debera poderse
estimar a partir de la relacin entre alguna medida de variabilidad y de la amplitud media. Los
detalles matemticos del asunto y su justificacin rigurosa exceden los propsitos de esta
introduccin elemental al tema, pero es suficiente presentar una descripcin que proporcione
un sentido intuitivo a este acercamiento analtico. En primer lugar, se determina la varianza de
la seal y el valor promedio. Tanto la varianza,
2
, como el promedio, , se estiman en el
tiempo (es decir, dentro del mismo trazo registrado):
= 1/TV(t)dt
(T siendo el intervalo de integracin). Es como sumar valores sucesivos del voltaje, el cual est
cambiando en el transcurso del tiempo, y promediarlos; solo que, tratndose de un continuo, no
podemos simplemente sumar y dividir por N (hay una infinidad de valores), sino tomamos la
integral del trazo de voltaje y dividimos por la medida del intervalo considerado. La varianza,
2
, es calculada como:
1/T (V(t) - )
2
dt])
Tal como en la definicin tradicional, restamos del valor del voltaje en cada instante el promedio
(para quedarnos solo con las fluctuaciones alrededor del promedio), elevamos al cuadrado el
resultado (evitando que luego al sumar se anulen mutuamente desviaciones positivas y
negativas), e integramos. El cociente entre
los dos parmetros estimados
proporcionara entonces informacin
respecto al tamao de los eventos
unitarios. De esta manera se obtuvieron
los primeros estimativos de la magnitud de
las corrientes elementales debidas al flujo
de iones a travs de protenas individuales
en la membrana de la clula.

Determinacin de la cintica de los
eventos elementales
Ahora, habiendo inferido la amplitud de los
impulsos, podramos preguntarnos acerca
de su curso temporal, para lo cual
acudimos nuevamente al anlisis en el
dominio de frecuencia. Eventos
elementales lentos, una vez los
descomponemos en componentes
sinusoidales, mostrarn una
predominancia de frecuencias lentas;
eventos rpidos necesariamente tienen
que estar constituidos por frecuencias
rpidas. Si los eventos elementales son lo

Figura 13.2
57
que dan origen a nuestra seal total, quiere decir que el contenido espectral de sta ltima
debe reflejar el de los eventos elementales. Lo que haramos por lo tanto es examinar el
espectro de frecuencias de la seal para determinar cuales frecuencias contribuyen
sustancialmente. Aqu la informacin de inters suele ceirse a la amplitud de dichos
constituyentes, no su exacta relacin de fase. Como tal, la medida ms tpica es el espectro de
potencia, tambin llamado la densidad espectral; conceptualmente, sta se estima sumando los
cuadrados de los productos de la funcin de inters con senos y cosenos de cada frecuencia.
Si una frecuencia dada est representada en nuestro trazo, el producto de ste con un
funciones sinusoidales (seno y coseno) de dicha frecuencia debe contener, como ya se ha
visto, un componente DC (un trmino no-peridico que solo depende de la diferencia de fase
entre los multiplicandos): si el sinuside presente en nuestro trazo est perfectamente en fase
con el seno, esta multiplicacin arrojar el mximo tamao del componente DC mientras que
en la multiplicacin con el coseno se anula (ya que habr un desfase de 90), y viceversa. Si el
desfase es parcial con respecto tanto al seno como al coseno (el caso ms general), ambos
productos contribuyen un componente DC, y se trata de usar el teorema de Pitgoras (el
cuadrado de la hipotenusa de un tringulo rectngulo es la suma de los cuadrados de los
catetos) para obtener la amplitud de esa frecuencia en nuestro trazo: la hipotenusa representa
dicha amplitud, y los catetos sus componentes ortogonales. Las unidades de medida
resultantes, por lo tanto, tambin sern al cuadrado (e.g. V
2
).

Consideremos un caso concreto. En la Figura 13.2 se muestran dos instancias en las cuales un
evento elemental estereotipado puede tener un curso temporal bien sea rpido o lento (panel
A). Podra tratarse, por ejemplo, del cambio de voltaje producido en la membrana de diferentes
clulas de la retina al absorber un fotn. Supongamos que dichos eventos ocurren
repetidamente en el tiempo, de una forma aleatoria (panel B); el efecto resultante ser la suma
de todos esos eventos, lo cual genera un trazo ruidoso (panel C). Sin embargo, es evidente
que las fluctuaciones del trazo de la izquierda, el cual representa la superposicin de eventos
breves, tienden a ser ms rpidas que en el trazo de la derecha. Esto se puede analizar
cuantitativamente extrayendo el espectro de potencia en los dos casos: el resultado (panel D)
muestra que el trazo de la izquierda efectivamente est constituido por muchos componentes
que se extienden hasta frecuencias bastante altas; la curva luego cae, indicando que no hay
representacin de frecuencias an mayores. El lmite superior se denomina frecuencia crtica (o
tambin frecuencia de roll-off) simbolizada como f
c
. Para el trazo de la derecha, la curva de
densidad espectral muestra un comportamiento cualitativamente similar, pero solo frecuencias
relativamente bajas contribuyen, y el valor de f
c
se encuentra por lo tanto significativamente
desplazado hacia la izquierda. Con este acercamiento es posible entonces inferir parmetros
de las caractersticas temporales de la respuesta unitaria.

Al final de cuentas, entre las dos estrategias habremos logrado derivar un estimativo tanto del
tamao como de la rapidez de los eventos elementales cuya superposicin ha dado origen a
una seal que aparentemente es irregular y azarosa. Este acercamiento ha sido valioso para
derivar informacin de un sinnmero de fenmenos microscpicos cuando su medicin directa
no era factible. Cabe recalcar, sin embargo, que padece de limitaciones: para poderse aplicar
es imprescindible tener un modelo inicial. Por ejemplo, hay que asumir que el ruido est
constituido por excursiones rectangulares que se superponen al azar, o que los eventos
elementales decaen en el tiempo segn una funcin exponencial, etc. Muchas veces
consideraciones tericas dan pie para proponer el modelo y respaldarlo con argumentos
convincentes. Entonces el anlisis de fluctuaciones arroja parmetros interpretables. Pero en
ausencia de un modelo, los parmetros que resultan del anlisis de ruido carecen de
significado.

Mdulo 2: ptica
Enrico Nasi: Introduccin a la Biofsica Mdulo de ptica
58
1. Introduccin
En este segundo mdulo se revisaran elementos bsicos de ptica y algunas de sus
aplicaciones. Una pregunta relevante concierne la relevancia de esta rama de la fsica a la
biomedicina. Desde el punto de vista del funcionamiento de clulas y organismos, los principios
pticos solo vienen al caso en relacin al ojo (contrariamente a la bioelectricidad, que es
ubicua). Con lo cual su aplicacin a temas fisiolgicos es ms bien especializada. Sin embargo,
en cuanto a tecnologa para observacin y monitoreo de funcin (y, en el caso de la medicina,
diagnstico e intervencin) hay una gran variedad de enfoques pticos de gran utilidad, lo cual
justifica el esfuerzo invertido en aprender por lo menos los principios ms fundamentales.

La ptica es un campo polifactico y complejo, y no constituye una disciplina conceptualmente
monoltica: al contrario, diferentes niveles de explicacin, principios y complejidades ocurren,
dependiendo de la escala de energas y de dimensiones espaciales que se estn
considerando. Por un lado, tenemos la ptica geomtrica, que es la ms simple y contempla el
anlisis de rayos que se propagan en lnea recta por un medio dado, y solo cambian direccin
al encontrar un medio distinto. Gran parte de los fenmenos relevantes al funcionamiento de la
visin slo requieren principios de ptica geomtrica. Pero para entender otros fenmenos cuya
escala de dimensiones es pequea (del orden de m o fracciones), o explicar el funcionamiento
de muchos instrumentos pticos, es necesario analizarlos en el marco de la ptica de ondas,
que es notablemente ms complicada y por lo tanto ser considerada solo de una manera muy
tangencial, haciendo ocasional referencia a sus principios ms bsicos. Para otras escalas de
dimensiones y energas, existe an otro marco terico, la ptica cuntica.

Naturaleza de la luz.
Parte de los motivos por los cuales la teora de la ptica tiene diferentes marcos conceptuales y
diferentes acercamientos, es que la materia prima de la cual trata, es decir la luz, es
concebida de dos maneras diferentes. Cada una de las propuestas proporciona una buena
aproximacin para una clase de fenmenos, pero falla en otros, por lo tanto las dos visiones
alternativas coexisten una al lado de la otra:
- Teora corpuscular: la luz es conceptualizada como un haz de partculas luminosas que
viajan a gran velocidad.
o Pro:
La propagacin de la luz procede en trayectorias rectas (en analoga con el principio
inercial de Galileo, que se aplica a cuerpos en movimiento).
Cuando un haz de luz choca contra la superficie lisa de un slido, rebota segn las
mismas leyes que gobiernan la colisin elstica de un cuerpo contra una pared rgida.
o Contra:
Las partculas luminosas no se chocan entre s: si dos rayos luminosos se cruzan,
ninguno de los dos altera su direccin, contrariamente a lo que ocurrira en una
colisin mecnica entre partculas
59
Si se intercepta un haz de luz con una pantalla opaca en la cual hay un pequeo
orificio, la hiptesis corpuscular contemplara que aquellas partculas que pasan por el
orificio seguiran derechas, las otras sern bloqueadas. Por consiguiente, si se
colocara un detector de luz directamente al frente del orificio, ste detectara la luz
(Figura 1.1A, detector verde), pero si se desplazara a un lado, nada le debera llegar
(detector rojo). En cambio, lo que se observa es que la luz emerge propagndose en
todas las direcciones, y un detector ubicado lateralmente tambin recibe luz (Figura
1.1B). Este fenmeno ha sido bautizado difraccin.

- Teora ondulatoria: la luz es conceptualizada como una onda que se propaga.
o Pro:
Explica la difraccin, la cual se verifica fcilmente con
otras ondas: por ejemplo, en la superficie de un liquido si
una onda cuyos frentes son rectos encuentra un dique
con una pequea apertura, al otro lado la onda emerge
con frentes concntricos
Explica la interferencia: si en el experimento de difraccin
se usan dos agujeros, la luz que emerge de cada uno,
propagndose en todas las direcciones, forma un patrn
de franjas claras y oscuras (lo podramos observar
colocando una pantalla). Viendo la luz como onda es fcil
imaginar que donde las dos ondas se superponen en fase (i.e. coinciden los picos,
como los puntos donde se interceptan los frentes de onda en la Figura 1.2) las
intensidades se sumarian, pero en las que estn fuera de fase se anularan.

o Contra:
Necesidad de un medio por el cual viaje la onda: como explicar propagacin de la luz
en el vaco? Un rayo de luz pasa perfectamente por un tubo evacuado de aire,
mientras tenga ventanas transparentes en los dos extremos. En cambio, eso es
imposible con otras formas de ondas conocidas, como las ondas acsticas. Si una
onda representa la perturbacin de medio por el cual se propaga (aire, agua, etc.),
ciertamente la persistencia de una onda en ausencia de todo medio es
conceptualmente problemtica. Intentos ad hoc de salvar el concepto propusieron la
existencia de un medio intangible, el ter, pero sin un fundamento verificable.

Si la luz se puede concebir como una onda oscilatoria, es
imprescindible entonces esclarecer que es lo que oscila. Debemos
a Maxwell la explicacin, segn la cual se trata de la oscilacin del
campo electromagntico. Aclaremos que quiere decir: en
electroesttica se propuso que un sistema de cargas fijas en el
espacio puede ejercer una influencia sobre otra carga arbitraria
colocada en cualquier punto del espacio, y denominamos esa
funcin vectorial el campo elctrico (cuya existencia es
independiente de la presencia o no de la carga de prueba). De la
misma manera, si tuviramos una o mas cargas que estn
oscilando, stas ejerceran una influencia fluctuante sobre otras
cargas elctricas distantes. Debido a las aceleraciones de las
cargas, dicha influencia incluye un componente magntico,

Figura 1.1

Figura 1.2
60
adems del componente elctrico, y decae linealmente con la distancia (contrariamente a las
interacciones electrostticas, que decaen con el cuadrado de la distancia); esta ltima
caracterstica hace que el campo electromagntico pueda influir a distancias mucho mayores.
Tratndose solamente de fuerzas electromagnticas oscilatorias ejercidas sobre una carga,
tales influencias se hacen sentir tambin a travs del vacio, obviando la necesidad de un medio
de propagacin. Estas interacciones no actan instantneamente, sino se propagan con una
velocidad finita, en una direccin perpendicular a las oscilaciones de las cargas. Decimos por lo
tanto que la radiacin electromagntica es una onda
transversal (lo opuesto, por ejemplo, a una onda
acstica, en la cual las molculas aire se desplazan
oscilando en la misma direccin que la direccin de
propagacin del sonido, es decir es una onda
longitudinal)

Polarizacin
Considerando la luz como onda transversal, se puede
analizar cual es la forma de esa oscilacin en el plano
ortogonal a la direccin de propagacin. Si, en un
espacio tri-dimensional, llamamos z la direccin de propagacin de un haz de luz, el plano de la
oscilacin del campo elctrico es el x-y. La Figura 1.3 muestra una fuente de luz no-polarizada
(la oscilacin transversal del vector elctrico se da en todas las direcciones en el plano x-y); al
pasar por un elemento llamado polarizador, solo se propagan ondas cuyo vector elctrico est
confinado a una direccin particular; diramos entonces que la luz es linealmente polarizada.
Hay otras posibilidades, sin embargo: por ejemplo, si la oscilacin es el resultado de dos
componentes que no estn necesariamente en fase, su forma en el plano x-y sera una elipse,
o un crculo. Debido a que un haz de luz puede volverse polarizado al cruzar un medio en el
cual hay una preponderancia de molculas alineadas en una cierta direccin, esto nos puede
servir para inferir propiedades estructurales de un material transparente; viceversa, al irradiar
una muestra transparente con luz polarizada (por ejemplo, una clula), se puede dar
transmisin diferencial por diferentes componentes, lo cual permite visualizar caractersticas
morfolgicas que de otra manera pasaran desapercibidas.

El Espectro Electromagntico
La luz visible slo representa la manifestacin de una minscula porcin de un fenmeno
llamado radiacin electromagntica. Distintas formas de esta radiacin difieren con respecto a
un parmetro, la frecuencia (vista como onda), o su contraparte, la energa (vista como
partcula). Hay una relacin directa, propuesta por Einstein, entre la frecuencia (, en unidades
de Hz o s
-1
) de una onda electromagntica y su energa cuntica (E, en unidades de ergs):
E = h (h es la constante de Planck = 6.6210
-27
ergsec)
Esta relacin nos permite pasar de un marco conceptual al otro con facilidad. Cuando se habla
de luz dentro del marco de la teora corpuscular, denominamos la partcula luminosa un fotn.

Ms a menudo, en lugar de la frecuencia se utiliza la longitud de onda () que es la distancia
que recorre una onda en el tiempo que demora un ciclo de oscilacin; en el vaco tenemos:
= c/ (c es la velocidad de la luz en el vaco, 310
8
ms
-1
,
la
frecuencia).
Figura 1.3
61
Contrariamente a la frecuencia, sin embargo, la longitud de onda no es una caracterstica
intrnseca de la radiacin, sino depende adems del medio por el cual se est propagando. Es
fcil ver que si la frecuencia de una onda se mantiene al pasar de un medio a otro, pero su
velocidad de propagacin cambia, la longitud de onda tambin cambiar: por ejemplo, si la
velocidad de propagacin en el nuevo medio es menor, la onda avanzar menos por cada ciclo
de oscilacin, y la longitud de onda habr disminuido de tal manera que en una distancia dada
cabrn ms ciclos (Figura 1.4). As que en un medio en el cual la velocidad de la luz fuera V,
tendramos:
= V/c
En el aire, la velocidad de propagacin de la luz es casi idntica a la del vaco, pero otros
medios transparentes de mayor densidad como el agua, el aceite, o el vidrio la enlentecen
significativamente. El ndice de refraccin (n) de un material es el cociente entre la velocidad de
la luz en el vaco y su velocidad en dicho medio (llammosla V):
n = c/V
ndices de refraccin (relativos al vaco, tomado como 1.0) de materiales transparentes
comunes, medidos a = 589 nm:
Aire: 1.0003
Agua: 1.33
Vidrio: 1.52-1.66 (segn la composicin)

A pesar de que en la longitud de onda se encuentran entremezcladas propiedades tanto de la
luz como del medio en el cual se propaga (mientras que la frecuencia s es una caracterstica
intrnseca de la luz solamente), lamentablemente en muchas reas de la ptica, y
especialmente en ptica fisiolgica, se ha adoptado preferencialmente el uso de la longitud de
onda como parmetro que caracteriza la luz, a menudo descuidando especificar el medio y su
ndice de refraccin.

Luz visible.
La porcin del espectro
electromagntico que es
visible (para los humanos)
comprende las longitudes de
onda entre 400 y 700 nm (1
nm = 10
-9
m)
aproximadamente. Hacia
longitudes de onda ms cortas
encontramos la radiacin
ultravioleta (UV, as su vez
dividida entre UV
A
y UV
B
),
luego los rayos X, los rayos
gamma (), y los rayos csmicos. Hacia longitudes
de onda ms largas, en cambio, tenemos radiacin
infrarroja (IR), micro-ondas, radio, etc. (Figura 1.5).
Este rango es supremamente amplio, y va desde
billonsimas de milmetro hasta kilmetros; por lo
tanto, lo que nosotros percibimos como luz es
realmente una franja minscula. Porque esta
limitacin? Considerando la energa de un cuanto
Figura 1.4
Figura 1,5
62
(E=h), el espectro visible es particularmente idneo para conllevar informacin, porque (i) los
cuantos son lo suficientemente energticos para sobresalir con respecto al ruido de fondo (e.g.
la agitacin trmica de toda materia), mientras que, por ejemplo, un fotn infrarrojo no tiene
mucha ms energa que la energa trmica de una molcula, especialmente a la temperatura
corporal de un mamfero, y al ser absorbido no hara gran diferencia; (ii) un cuanto visible es
capaz de desencadenar reacciones fotoqumicas inocuas (isomerizaciones, excitacin
electrnica que pueden iniciar el proceso de sealizacin), pero no tiene energa suficiente para
deshacer enlaces qumicos covalentes, lo cual podra causar daos a tejido biolgico (por
ejemplo, los efectos cancergenos de la luz ultravioleta y de los rayos X). Por lo tanto, la
capacidad de absorber esas otras longitudes de onda puede ser no muy til, o inclusive daina,
si el propsito es solamente extraer informacin del entorno.
63

2. Cuantificacin de la luz
Es imprescindible disponer de algn criterio para cuantificar la intensidad de un haz de luz, lo
cual requiere una aclaracin inicial: consideremos un haz de luz como un flujo de fotones.
Hemos hablado de la energa de fotones de diferentes frecuencias, pero eso se refera a un
fotn individual. Debemos adems considerar cuantos fotones fluyen por unidad de tiempo y
por unidad de rea, ya que en la energa total del haz de luz ambos factores estarn
implicados. De la misma manera, si pensamos en la luz como onda, adems de su frecuencia
(o su longitud de onda) habra que considerar su amplitud (es decir la amplitud de la oscilacin
del campo electromagntico).
En general, hay dos enfoques fundamentales para determinar la intensidad de la luz, que
originan sistemas diferentes de unidades de medida. Las tcnicas especficas sern
consideradas posteriormente:
Escalas radiomtricas
Podemos cuantificar la intensidad de la luz en trminos de sus caractersticas fsicas, lo cual
tpicamente hace referencia a algn parmetro de energa. Si una fuente puntual emite luz en
todas las direcciones, el flujo radiante es la energa total emitida por unidad de tiempo (ergs
-1

o W); similarmente, la intensidad radiante es el flujo
restringido a un steradian de ngulo slido, lo cual se
define como un cono con el vrtice en la fuente, tal que a
1 m de distancia la base subtiende una superficie de 1 m
2

(Figura 2.1). Alternativamente, es 1/4 del total del flujo
radiante, ya que la superficie total de una esfera es 4r
2
.
Las dos medidas anteriores hacen referencia a la luz
emitida por una fuente; tambin se puede pensar en la luz
que llega a un objeto. La irradiancia es la intensidad de
radiacin que incide sobre una superficie por unidad de
rea (W/m
2
). A medida de que una fuente de luz se aleja
de la superficie que ilumina, la irradiancia decrece con el
cuadrado de la distancia: consideremos una fuente
puntual de luz y una superficie cuadrada sobre las cual
inciden los rayos. Si los rayos divergen y viajan en lnea recta, a una distancia del doble estarn
incidiendo sobre un cuadrado del doble de lado, es decir es cudruple en cuanto a rea: por lo
tanto, el flujo de fotones por unidad de rea habr disminuido segn el cuadrado de la distancia
de la fuente luminosa (entonces, porque no nos parece que los objetos mas distantes sean ms
tenues que los cercanos?). Debido a que los fotones pueden tener energa diferente, uno
podra obtener la misma energa con un haz que consiste de pocos fotones (por segundo) pero
muy energticos (longitud de onda corta) o con un haz de muchos fotones por segundo, pero
de baja energa (longitud de onda larga); los efectos de los dos rayos podran ser radicalmente
diferentes. Por lo tanto, en muchas instancias, saber la energa total de una luz sin conocer su
longitud de onda no es suficiente; adems, la luz puede ser policromtica (i.e. compuesta por
una mezcla de varias longitudes de onda) y uno podra necesitar aclarar como estn
distribuidas las intensidades de las varias longitudes de onda que la conforman. Para lograrlo,
hara falta pasar el rayo de luz por un monocromador, en el cual una rejilla de difraccin rebota
los rayos de luz a un ngulo distinto segn la longitud de onda, separndolos (algo similar al
prisma de Newton que descompona la luz blanca del sol en un arco iris). Alternativamente, se
pueden utilizar filtros de banda (los cuales solo dejan pasar longitudes de onda selectas, como
veremos mas tarde). Luego, mediramos separadamente la intensidad (energa) en cada
banda. La intensidad de la luz en funcin de la longitud de onda determina el espectro de la luz

Figura 2.1
64
(o, ms tcnicamente, la irradiancia espectral) Debido a que conocemos la energa de un fotn
en cada banda de longitud de onda, tambin podramos convertir tales medidas de energa en
nmero de fotones, lo cual suele ser mucho ms informativo, especialmente para propsitos
fisiolgicos. Las complejidades implicadas en cuantificaciones de luz policromtica, indujeron la
CIE (la comisin internacional que establece criterios estndar de medicin en ptica) a
proponer como punto de referencia para muchas aplicaciones el iluminador estndar A, el cual
consiste en un cuerpo negro calentado a 2854K, ya que se conoce exactamente la
composicin de su emisin luminosa.
Consideremos un ejemplo prctico, en el cual se pretende cuantificar el flujo de fotones con el
cual estamos iluminando continuamente un objeto. Para este propsito interceptaramos el rayo
de luz con el sensor de un radimetro, el cual reporta la potencia de la luz que recibe, es decir,
la energa por unidad de tiempo (e.g. Joules/seg, es decir, Watios); supongamos que la lectura
arrojara el resultado 40 W. Si queremos saber cuntos fotones por segundo por cm
2

representa esa intensidad, es preciso saber la energa por fotn, lo cual solamente est
definido si la luz es monocromtica: la relacin de Einstein nos dice que E = h = hc/. El valor
de h, la constante de Planck es h= 6.626210
-34
JHz
-1
(o Jseg), y c (la velocidad de la luz en
el vaco) es 2.99810
8
ms
-1
. Si se tratara de una luz de 500 nm, entonces:
E = 6.626210
-34
Jseg 2.99810
8
ms
-1
/50010
-9
m = 3973.110-22 J
Con eso podemos concluir que nuestros 40 W = 4010
-6
Js
-1
corresponden a:
4010
-6
Js
-1
/3973.110
-22
J 10
14
fotones/seg
Ahora se necesita ulterior informacin, porque podra tratarse de un rayo estrecho e intenso, o
la misma cantidad de fotones podra estar distribuida en un rea mayor (con lo cual la
intensidad del rayo resultara menor): es decir, necesitamos conocer la densidad del flujo de
fotones por unidad de rea. Si se trata de una rayo ancho, del cual slo una porcin fue
captada por un sensor de rea 0.5 cm
2
,
la densidad del flujo de fotones por unidad de rea
(cm
2
) ser 10
14
/0.5 = 210
14
fotoness
-1
cm
-2
. Alternativamente, podra tratarse de un rayo
estrecho, menor que el tamao del sensor, por ejemplo de 5 mm
2
(0.05 cm
2
); en este caso el
parmetro relevante es el rea de seccin del rayo, no la del sensor, y obtendramos 10
14
/0.05
= 210
15
fotoness
-1
cm
-2
. Finalmente, si en lugar de iluminacin continua se tratara de un
destello de duracin finita, podramos saber el nmero total de fotones en el destello
multiplicando el flujo por la duracin.
Escalas fotomtricas
Alternativamente, podemos cuantificar la luz en trminos de los efectos sobre un observador (lo
cual, por supuesto, depende de su sensibilidad). La fuente de luz utilizada para determinar la
sensibilidad de los humanos era la candela (una vela fabricada con ciertas especificaciones,
cuya intensidad o flujo luminoso se defini como 4 lumens). Esta fuente fue luego
reemplazada por un emisor negro calentado a la temperatura de fusin del platino, 2042K).
Una serie de unidades de medida fotomtricas han sido desarrolladas, que son homlogas a
sus contrapartes radiomtricas: por ejemplo, la iluminancia es el equivalente fotomtrico de la
irradiancia, etc. De all se establecieron equivalencias de efectividad de estimulacin a distintas
longitudes de onda, segn lo percibido por un observador estndar (con todos los caveats
variaciones entre individuos, y las diferencias entre visin diurna o fotpica y visin nocturna o
escotpica...). La jungla de unidades derivadas es impenetrable para el novato: lumen,
candelas, trolands, lamberts, etc.).
65
3. Absorcin de la luz
La primera forma de interaccin entre luz y materia a ser considerada es la absorcin. Cuando
un rayo atraviesa un medio y la intensidad del rayo que emerge es menor que la del rayo
incidente, parte de la luz ha sido absorbida. Si consideramos una capa delgada de material
parcialmente absorbente, y denotamos con
o
la intensidad de la luz incidente, la magnitud del
cambio al atravesar el medio es proporcional a (i) la intensidad, (ii) una constante k,
caracterstica del medio y denominada el coeficiente de absorcin, y (iii) el espesor de la capa
de material por la cual pasa el rayo, x:
= -k x /x = -k.
(el signo negativo es debido a que la intensidad de la luz va disminuyendo al pasar por un
medio absorbente). Tomando el lmite cuando la capa se hace infinitesimalmente delgada,
obtenemos:
d/dx = -k.
Esta ecuacin diferencial tiene como solucin la funcin:
(x) =
o
e
-kx
Esta relacin se conoce como la Ley de Lambert. Notar que lo que se pierde en intensidad es
la suma de las prdidas a lo largo del camino, pero es errneo pensar que entonces uno podra
sencillamente considerar que para cualquier cuerpo arbitrariamente espeso la absorcin es
proporcional a su espesor: esto se debe a que si en la primera capa se absorbe una cierta
fraccin de la luz incidente, le llega menos luz a la segunda capa; si la misma fraccin de luz es
absorbida por la segunda capa, la prdida representa un cambio absoluto menor que en la
capa anterior. An menos luz llega a la tercera capa, as que la cantidad que se absorber
decrece ulteriormente, y as sucesivamente. La Figura 3.1A ilustra este proceso asumiendo que
cada 2 capas laminares del medio absorbente se pierde la mitad de los fotones (las cruces
verdes representan los fotones que dejan de existir al ser absorbidos, las flechas rojas los que
sobreviven y siguen adelante). De all la necesidad de calcular por separado en cada capa
delgada, integrando la ecuacin diferencial (d/dl = -k): el resultado que se obtiene nos dice
que la cantidad de luz que emerge (o su complemento, la que ha sido absorbida) no se
relaciona linealmente sino exponencialmente con el espesor del medio que la luz ha de
atravesar (Figura 3.1B).

A su vez, la absorcin de un medio depende de la absorcin
caracterstica de las molculas individuales que estn
absorbiendo luz, es decir, el coeficiente molar de extincin, .
Por supuesto que entre mayor el nmero de dichas molculas
por unidad de volumen, mayor la absorcin; as que la absorcin
depende, adems, de la concentracin de las molculas
absorbentes, C. Juntando estas dos consideraciones,
obtenemos la Ley de Beer: K = C, y combinando las dos leyes,
obtenemos una expresin general para la absorcin por un
medio en el cual la luz es absorbida por molculas con
coeficiente de extincin , presentes a una concentracin C:
(x) =
o
e
-Cx

M
-1
cm
-1
, para que el trmino exponencial resulte sin
dimensin. Este enunciado se conoce como la ley de Beer-
Lambert. De esta ley se desprende que, conociendo y el
Figura 3.1
66
camino ptico, x, uno puede calcular la concentracin de una sustancia:
/
o
= e
-Cx
ln(/
o
) = -Cx, i.e. C = -ln(/
o
)/x.
Por ejemplo, supongamos que una sustancia tuviera = 10000 M
-1
cm
-1
, y, medida en una
cuveta de 1 cm, la luz disminuyera al 10% de la intensidad incidente. Entonces:
C = -ln(1/10)/(100001) = 2.3/10000 M = 230 M.
Viceversa, midiendo la absorbancia de una sustancia, podramos averiguar el coeficiente de
extincin conociendo su concentracin. Por consiguiente, un instrumento capaz de medir la
absorcin (un fotmetro) es de gran utilidad en un laboratorio bioqumico.

En general, la absorcin no es igual para toda longitud de onda, , y por lo tanto no es un
simple nmero, sino una funcin de , i.e. (). La variacin del coeficiente de extincin con la
longitud de onda da origen al espectro de absorcin, una representacin grfica de la absorcin
(en el eje Y) en funcin de la longitud de onda (en el eje X). Su contraparte es el espectro de
transmisin, el cual se obtiene graficando la fraccin de luz transmitida (i.e. 1-fraccin
absorbida) en funcin de la longitud de onda. El espectro
de absorcin es caracterstico para distintas molculas,
lo cual lo hace muy til para identificar la presencia de
una cierta sustancia en un compuesto. Por ejemplo, la
grfica de la Figura 3.2 ilustra el espectro de absorcin
de la hemoglobina, la molcula que transporta oxgeno
en la sangre (los dos trazos corresponden a la forma
oxigenada y de-oxigenada, respectivamente). La
identificacin de esos picos caractersticos en el
espectro de absorcin obtenido de una muestra puede
permitir detectar la presencia de sangre en dicha
muestra.

Un medio que selectivamente absorba ciertas longitudes de onda hace que la composicin
espectral de la luz que lo atraviese se altere. Por ejemplo, si la luz incidente es blanca (i.e.
compuesta por una mezcla balanceada de todas las longitudes de onda visibles) y el medio
absorbe solamente ondas menores que un cierto lmite, digamos 580 nm, lo que emerge es un
rayo que se percibe como rojo (>580 nm). Este es el principio por el cual se genera luz de
colores con los tipos ms comunes de filtros cromticos.

En lo que se ha discutido, el coeficiente de extincin y la cantidad de luz absorbida se han
presentado como variables continuas. Sin embargo, hay que recalcar que la absorcin de un
fotn es un evento del todo-o-nada: si el material por el cual transita absorbe el fotn, ste deja
de existir y toda su energa es transferida a la molcula que lo absorbi; si no, el fotn sigue sin
haber perdido nada de su energa. Pero tampoco se trata de un evento determinista, sino
aleatorio: a una cierta longitud de onda hay una cierta probabilidad de que un fotn sea
absorbido (los que lo son, dejan de existir, los que no siguen su existencia).
Macroscpicamente, segn que tan alta o baja sea esta probabilidad en diferentes materiales,
obtenemos un continuo de valores posibles para el coeficiente de extincin, pero ste
representa el promedio de un gran nmero de eventos del todo-o-nada.

Efectos de la luz absorbida
La absorcin es esencial para toda instancia en la cual la luz ha de ejercer un cierto efecto
sobre la materia. Esto incluye todo acercamiento para cuantificar la luz: sin la absorcin que
Figura 3.2
67
transfiera la energa del fotn al medio por el cual transita, no habra rastro de su paso o de su
existencia, y sera imposible detectarla. Por lo tanto, todo medidor de energa radiante debe
poder absorber la luz a las longitudes de onda de inters; en general, sera deseable que la
absorcin fuera total, con lo cual el problema de la medicin se reducira a determinar cuanta
energa ha sido transferida al instrumento. Pero en la prctica el detector tiene su caracterstico
espectro de absorcin, y uno ha de proceder por bandas limitadas, midiendo cuanta energa ha
sido absorbida en cada banda, corrigiendo luego por la fraccin que no ha sido absorbida.
Los efectos de los fotones absorbidos se manifiestan de distintas formas, dependiendo de su
energa y de la naturaleza de las molculas que los absorben. Estos efectos dan origen a
diferentes maneras de detectar la luz, y de cuantificar su intensidad.
Mediciones bolomtricas. Si la energa de los fotones incidentes es demasiado baja para
desencadenara cambios qumicos en el material que los absorbi, la energa transferida se
ha de convertir en calor (es decir, manifestarse en una mayor agitacin trmica de las
molculas, bien sea en forma de vibraciones o rotaciones). Entonces, una manera de medir
la radiacin es tener un cuerpo negro, i.e. cuya absorcin sea total a todas las longitudes de
onda, y determinar los cambios de temperatura que sufre al ser expuesto a la luz. Este
instrumento, que se conoce como termopila, permite mediciones de gran precisin, y es
especialmente idnea para luz de longitudes de onda relativamente largas. Algunos
organismos que son sensibles a luz infrarroja (ciertas serpientes del desierto y escarabajos
que viven en cuevas) la detectan debido a la exquisita sensibilidad de algunas de sus
clulas a diminutos cambios de temperatura.
Deteccin fotoqumica. Por otra parte, los fotones absorbidos podran tener suficiente
energa para gatillar algn cambio estructural: la mayora de los organismos biolgicos
utilizan una deteccin fotoqumica, mediada por molculas cuyas caractersticas son
alteradas por la luz de una manera que las haga propensas a sufrir ciertas reacciones
qumicas, pero sin llegar a ser ionizadas (i.e. sin la prdida de un electrn). En el caso del
ojo la luz es absorbida por un fotopigmento llamado rodopsina, cuyo coeficiente de
extincin es muy alto (40000 M
-1
cm
-1
), y est presente en alta concentracin (>10
8

molculas/clula). En los bastones, el fotopigmento absorbe luz particularmente a
max
500
nm (lo que un observador humano llamara luz verde). Cabe mencionar que la rodopsina es
una molcula protica, y las protenas de por s no
absorben luz en el rango visible: para adquirir esa
capacidad, la parte protica de la molcula, llamada
opsina, se liga a otra molcula no protica, un grupo
prosttico que absorbe luz visible y se denomina el
cromforo. El panel superior de la figura 3.3
representa esquemticamente la opsina como un
manojo de 7 cilindros, que representan los dominios
que cruzan la membrana formada por una bi-capa
lipdica. En el centro de la protena se encuentra el
cromforo (constituido por un anillo aromtico y una
cadena de hidrocarbono), En el caso del ojo, el
cromforo es un derivado de la vitamina A (aldehdo
de vitamina A, llamado 11-cis-retinal); la absorcin de un fotn por el cromforo altera su
conformacin (lo foto-isomeriza, cambindolo a 11-trans-retinal; ver panel inferior de la
Figura 3.3) lo cual inicia una series de eventos bioqumicos que sealizan la recepcin de la
luz. Posteriormente, otro ciclo complejo devuelve el fotopigmento a su conformacin inicial,
permitindole estar listo para responder nuevamente a la llegada de otro fotn.

Figura 3.3
68
Mediciones fotoelctricas. Finalmente, una forma alternativa de detectar luz es utilizando
materiales que sufran un cambio ms drstico al absorber fotones, y pierden un electrn,
quedando por lo tanto en estado ionizado. Este el efecto fotoelctrico (descubierto por
Einstein), y por supuesto es ms propenso a ocurrir con radiacin electromagntica de alta
energa. Sin embargo, hay materiales (compuestos de cesio-antimonio, principalmente) en
los cuales los electrones en los orbitales externos estn dbilmente asociados con sus
respectivos ncleos; el impacto energtico de un fotn absorbido, an de longitud de onda
visible, los puede liberar. Esto se puede utilizar de diferentes maneras. En un caso, el
material en cuestin se mantiene a un potencial negativo (fotoctodo) respecto a otra placa
cuyo potencial es ms positivo (nodo) y que va a atraer los electrones liberados. Midiendo
la corriente elctrica constituida por el fluir de estos electrones se tiene una medida de los
fotones incidentes. La eficiencia del proceso de absorcin y liberacin de electrones se
conoce como el coeficiente de eficiencia cuntica. Usualmente, an con una relacin
fotn:electrn ptima (1:1), el efecto es insuficiente para observar corrientes conspicuas:
por ejemplo, una luz de mediana intensidad puede tener 10
14
fotoness
-1
cm
-2
, as que, si un
fotoctodo de 1 cm
2
la absorbiera con eficiencia del 100% la corriente sera de 10
14

electrones/segundo. Puesto que hay 6.24 10
18
cargas elementales en 1 Coulomb, quiere
decir que la corriente generada sera 16 A (millonsimas de Amperio) en el ms
favorable de los casos. Por consiguiente, especialmente cuando la luz es tenue, es
deseable interponer algn estadio de amplificacin para poderla detectar confiablemente.
Para este propsito, el electrn desplazado por el fotn incidente es acelerado por un
campo elctrico, colisiona con una segunda placa (dnodo) en la cual, gracias a la energa
adquirida por el fotn acelerado, el
impacto libera varios electrones
secundarios, que a su vez son
acelerados por un campo elctrico
y colisionan con otro dnodo, y as
sucesivamente, generando una
corriente final considerablemente
agrandada. Este aparato,
ampliamente utilizado en fsica y
biomedicina, se denomina
fotomultiplicador, y se ilustra en la
Figura 3.4. En otros sensores
fotoelctricos, en cambio, se
explota el hecho de que los electrones desplazados por la llegada del fotn dejan atrs una
carga electropositiva. Si se deja acumular esta carga durante un cierto tiempo de
exposicin a la luz (el intervalo de integracin) y luego se mide el potencial resultante, se
tiene una determinacin de la cantidad de luz que ha incidido. Este principio (y variaciones
sobre el tema) se ha utilizado ampliamente en la fabricacin de sensores para cmaras
digitales (e.g. CCD).
Figura 3.4
69

4. ptica Geomtrica
Adems de la absorcin, existen otras dos formas de interaccin entre luz y materia, la
reflexin y la refraccin, las cuales son relevantes a los tpicos que trataremos en esta revisin.
A diferencia de la absorcin, stas no implican la aniquilacin del fotn, sino solamente un
cambio en su direccin, sin prdida de energa.
Reflexin
sta se da cuando un rayo de luz que se propaga por un cierto medio encuentra la interfase
con un medio diferente y no lo penetra, sino que rebota. Fenomenolgicamente, se puede
hacer una distincin entre dos clases de superficies reflectivas: reflexin especular ocurre
cuando la superficie en la cual rebota el haz de luz es muy lisa, i.e. tiene irreguaridades que
son pequeas, comparadas con la longitud de onda de la luz
utilizada. Si un rayo llega a una superficie plana reflectiva,
rebota con una trayectoria que forma un ngulo, con respecto
a la normal de la superficie, que es igual al ngulo que forma
el rayo incidente:
r
=
i
(Figura 4.1A). Un espejo es el
ejemplo tpico. Si en cambio la superficie fuera spera, cada
uno de los rayos paralelos en el haz se choca con una
superficie cuya orientacin local es distinta (a escala
microscpica), y por lo tanto el ngulo de reflexin va a ser
distinto para distintos rayos; la dispersin que resulta hace
que la luz rebotada sea difusa (por ejemplo, una hoja de
papel). Se puede demostrar que en un difusor perfecto la
intensidad de la luz que rebota es mxima en la direccin
normal a la superficie, sin importar el ngulo de incidencia, y
decrece en otras direcciones con el coseno del ngulo con la
normal (Figura 4.1B). Cuando la reflexin no se da de manera
igual para todas las longitudes de onda, sino que alguna
banda selecta es reflejada preferencialmente, el material adquiere caractersticas cromticas: el
color que vemos en cualquier objeto opaco (no transparente) es precisamente debido a que,
pese a ser iluminado con una luz blanca, solo rebota ciertas longitudes de onda, mientras que
absorbe las otras. El principio de conservacin de energa exige que podamos dar cuenta de lo
que le sucedi a la totalidad de la luz incidente: si no toda la luz rebota de un objeto, debe ser
que una parte bien sea ha sido absorbida o bien ha sido transmitida por ese objeto.

El principio de distancia mnima
El comportamiento de la reflexin especular (es decir, la
igualdad de los ngulos
r
y
i
) se puede predecir asumiendo
que la trayectoria de todo rayo reflejado que viaje de un punto
A hasta un punto B utiliza un recorrido cuya longitud es la
menor entre todas las posibles trayectorias rectilneas que
reboten del espejo. Esto se puede deducir de una simple
construccin geomtrica ilustrada en la Figura 4.2:
consideremos un rayo que emana del punto A, dirigido hacia
el punto P, el cual se encuentra en la superficie de un reflector
plano. Por la ley del espejo su trayectoria al rebotar lo llevar
al punto B (
r
=
i
). Hagamos la reflexin de este segmento PB
con respecto al plano horizontal, obteniendo el segmento PB,
de idntica longitud. Este es co-lineal con la continuacin del

Figura 4.1

Figura 4.2
70
rayo incidente, AP, debido a que + = 90, por lo tanto 2+
r
+
i
= 180. Ahora consideremos
cualquier otra trayectoria alternativa que fuera de A hasta B, rebotando por otro punto P en la
superficie del espejo; el tramo PB tendra la misma longitud que su reflexin, PB. Pero
evidentemente AP y PB no son co-lineales, y, como la distancia menor entre dos puntos es la
lnea recta, esta nueva trayectoria entre A y B necesariamente ser ms larga que la original
que pasaba por P. Es decir, la ms corta es aquella para la cual se cumple que
r
=
i
.

Formacin de imgenes por espejos curvos
Si, en vez de un plano, la superficie de un reflector especular es curva, distintos rayos se
chocan contra la superficie con un ngulo diferente, y por lo tanto sern desviados en
direcciones diferentes. Si la forma del reflector fuera una parbola, todos los rayos de un haz
paralelo (colimado) seran enfocados en un solo punto, el cual se encuentra a una distancia f
del espejo. Desde el punto de vista del principio de distancia mnima se puede considerar el
haz de rayos paralelos como si emanaran de un solo punto al infinito. La parbola es el lugar
geomtrico de todos los puntos equidistantes de una lnea (llamada la directriz) y un punto
(llamado el foco); es fcil demostrar que si se toma una
lnea arbitraria paralela a la directriz, entonces para
cualquier punto sobre la parbola las distancias que lo
separan del foco y de la lnea suman una constante;
imaginando el caso particular en el cual la lnea L
perpendicular al haz pasa por el foco (F, en la Figura
4.3A), todos los rayos llegaran hasta esta lnea habiendo
recorrido la misma distancia desde la fuente. Puesto que
el camino faltante hasta la parbola y el tramo final desde
rebotar de la parbola hasta el punto focal tambin es
igual para todos, todos los caminos seran equivalentes en
distancias (i.e. todas son trayectorias viables). Esto se ve
porque el rayo axial R
1
rebota del punto P
1
y vuelve a F
habiendo recorrido una distancia 2a. El rayo (arbitrario)
R
2
llega al punto P
2
sobre la parbola, el cual dista x+a de
la lnea directriz (L) y por lo tanto tambin del foco (por
definicin de una parbola). El recorrido desde la lnea L
al punto P
2
es a-x (x siendo la distancia entre P
2
y la
tangente al pex de la parbola (lnea slida); por lo tanto,
la suma de los dos recorridos es de nuevo 2a ([a+x] + [a-
x]). Este razonamiento indica que todas esas trayectorias
son equivalentes en cuanto a distancia, y por lo tanto
igualmente viables. Si los rayos que inciden sobre el espejo parablico no son paralelos
(colimados) sino emanan de un punto y por lo tanto son divergentes, tambin se enfocarn en
un punto luego de haber rebotado del espejo, pero este punto se encontrar a una distancia tal
que:
1/d
o
+ 1/d
i
= 1/f
Donde d
o
= distancia del espejo al objeto, d
i
= distancia de la imagen al espejo, segn ilustra la
Figura 4.3B. Si el punto luminoso (el objeto) no esta en el eje central del espejo parablico (el
eje ptico) su imagen se formar en el mismo plano pero desplazada lateralmente. Puesto que
un objeto puede considerarse como una coleccin de puntos, de cada uno de los cuales emana
luz, si la luz proveniente de cada uno de los puntos del objeto es enfocada en algn punto en el
mismo plano (el plano focal), se forma una imagen del objeto. Este es el principio por el cual
funciona un telescopio astronmico.
Figura 4.3
71
Aunque solo un espejo perfectamente parablico cumplira estrictamente el requisito de enfocar
un haz colimado en un punto, el mismo comportamiento aproximado se obtiene con un espejo
esfrico (el cual es mucho ms fcil de fabricar), siempre y cuando uno se pueda ceir a los
rayos cercanos al eje central del espejo (rayos paraxiales), mientras los de la periferia se
desvan significativamente. En este caso podemos enunciar la ley de formacin de imgenes
por un espejo curvo como:
1/d
o
+ 1/d
i
= 2/r , donde r es el radio de curvatura del espejo
Refraccin
Naturaleza de una interfase refractiva. Si el material al cual llega la luz no es reflectivo sino
transparente, entonces el rayo no rebota sino penetra el nuevo medio, pero la trayectoria podr
verse alterada (i.e. no sigue necesariamente la misma recta, como hara un rayo que se
propaga por un medio homogneo). La figura 4.4 muestra un rayo incidente (flecha negra a la
izquierda) que incide oblicuamente sobre la superficie de un material transparente, y su ruta se
desva del camino rectilneo (lnea puntuada). El cambio de trayectoria est descrito
cuantitativamente por la ley de Snell (matemtico holands):
Sin(
i
)/ Sin(
r
) = N
21
=
1
/
2
Donde
i
y
r
son los ngulos que forma la direccin del rayo incidente y el rayo refractado,
respectivamente, con respecto a la normal a la interfase entre los dos medios (es decir la
perpendicular al plano, lnea roja). El nmero N
21
es
el ndice relativo de refraccin, y refleja la velocidad
relativa de propagacin de la luz en los dos medios.
Notar que si el rayo se propaga de un medio menos
denso (refractivo) a uno ms denso, el ngulo de
propagacin se alterar hacia la direccin de la
normal, y viceversa. Consideremos unos casos
representativos para desarrollar un sentido intuitivo
del comportamiento de un rayo refractado. En la
Figura 4.5 se presentan tres instancias de rayos de
luz que inciden sobre la interfase con un medio de
mayor ndice de refraccin, bien sea
perpendicularmente o con un ngulo
progresivamente ms oblicuo. En el caso de
un rayo perpendicular a la superficie de la
interfase con el nuevo medio (panel A), el
rayo seguir derecho sin alterar su rumbo (si
i
= 0 entonces Sin(
i
) = 0 pero Sin(
i
) =
N
21
Sin(
r
) Sin(
r
) = 0 i.e.
r
= 0). Si el rayo
incidente en cambio forma un ngulo de
aproximadamente 50 con respecto a la
normal de la interfase, el rayo refractado se
desviar significativamente de la trayectoria
rectilnea, y formar un ngulo de 30 (panel
B). En el panel C, el ngulo de incidencia es
an mayor (75), y el grado de desviacin es
tambin ms pronunciado.

Figura 4.4
Figura 4.5
72
Principio de Fermat de tiempo mnimo
Si consideramos el punto inicial y el punto final del rayo de luz en la Figura 4.6, evidentemente
el recorrido, al no ser rectilneo, no es el camino ms corto entre los dos puntos; en otras
palabras, no se cumple el principio de distancia mnima que se observa en un espejo. Sin
embargo, hay una consideracin que abarca ambos casos: el fsico y matemtico Fermat
demostr que el
comportamiento de un rayo
refractado se puede predecir
postulando que el camino que
la luz toma al propagarse por
dos medios distintos es aquel
que minimiza el tiempo de
propagacin. Esto implica una
optimizacin, en la cual se
acorte el recorrido por el medio
que enlentece ms la luz, a
costas de un recorrido ms
largo por el medio en el cual la
velocidad de propagacin sea
mayor. El postulado de Fermat
realmente tambin incluye al
de la distancia mnima
previamente enunciado para espejos, ya que, si un rayo rebota de un reflector (y por lo tanto
sigue propagndose por el mismo medio), la trayectoria que minimiza la distancia tambin
minimiza necesariamente el tiempo de viaje. Cuantitativamente, el principio de tiempo mnimo
predice exactamente la ley de Snell, la cual se puede igualmente derivar de las ecuaciones de
Maxwell, pero su derivacin excede el propsito de estas notas.

Refraccin y el principio de Huygens
A continuacin se presenta una explicacin ms fcil de comprender intuitivamente, la cual
est basada en ptica de ondas. Existe un principio formulado por el fsico y matemtico
holands Huygens, que ha sido de gran utilidad para comprender una variedad de fenmenos
pticos (por ejemplo, la difraccin). Segn su enunciado, la propagacin de una onda luminosa
se puede reconstruir considerando cada punto individual de un frente de onda como el origen
de una onda esfrica, y formando el nuevo frente de
onda tomando la envolviente de dichas miniondas.
En la Figura 4.7 se muestra un haz de luz cuyos rayos
paralelos estn representados por flechas negras;
desde la teora ondulatoria se puede pensar en unas
ondas planas, cuyos frentes (las crestas, indicadas
por las lneas verdes) son paralelos entre s, y
perpendiculares a la direccin de propagacin. El
perfil de las oscilaciones est indicado por la curva
sinusoidal a un lado. En cada frente, cada punto puede
considerarse como el origen de una onda esfrica; en
el diagrama se consideraron unos pocos puntos y se
ha dibujado la onda que se irradia desde esos puntos,
habiendo recorrido un ciclo de oscilacin. La tangente
a esos crculos forma el nuevo frente. La separacin
entre stos, es decir, la distancia entre las lneas

Figura 4.7

Figura 4.6
73
verdes, depende de que tanto las ondas elementales hayan avanzado durante el intervalo
necesario para completar un ciclo de oscilacin. Este haz de luz incide oblicuamente sobre la
superficie plana de un medio transparente en el cual la velocidad de propagacin es menor
(mayor ndice de refraccin). Consideremos las ondas elementales que emanan de cada punto
de incidencia de los diferentes rayos en la interfase. El rayo A, teniendo que recorrer menos
camino para alcanzar la interfase, llega antes que los otros. En el tiempo de un ciclo, cuando el
rayo B tambin llega a la interfase, se ha por lo tanto generado una onda esfrica en el nuevo
medio, pero sta es de menor dimetro debido a la reducida velocidad de propagacin. Un ciclo
ms tarde sta habr avanzado al segundo crculo concntrico, mientras se ha completado el
primer crculo para el rayo B y simultneamente el rayo C alcanza la interfase. Y as
sucesivamente. Ahora tomemos la tangente a estos crculos para cada ciclo, formando los
frentes de onda que se propagan en el nuevo medio. Debido al menor dimetro de las ondas
esfricas, estos frentes tienen una diferente inclinacin respecto a los que avanzaban por el
medio original. La direccin de propagacin, la cual es perpendicular a los frentes, muestra por
lo tanto el cambio de rumbo del haz, es decir la refraccin.

Lentes
En lugar de usar una superficie plana para refractar la luz por un medio como el vidrio, se
puede arreglar una curvatura de la superficie de tal manera que distintos rayos que emanan de
un punto dado al llegar al vidrio encuentren un ngulo de incidencia distinto, que los haga
doblar diferencialmente. Esta es la esencia de un lente. La Figura 4.8 muestra tres ejemplos; en
cada caso los rayos del haz paralelo que se dirigen al centro del lente (el eje ptico) inciden a
90 y por lo tanto siguen derecho sin ser desviados, pero los que llegan a la periferia
encuentran una superficie ms y ms oblicua, segn la
distancia desde el centro, y por consiguiente sufren
desviaciones progresivamente mayores. Con una cierta forma
de la superficie curva, el resultado es que todos los rayos que
emergen al otro lado del lente llegan a cruzarse en un mismo
punto (el punto focal) cuya distancia desde el lente se
denomina la longitud focal de lente y se simboliza con la letra
f. Entre mayor la curvatura del lente, ms cerca el punto
donde convergen los rayos (menor la distancia focal f). Esto
define el poder refractivo (o diptrico) de lente. Las
trayectorias de los rayos de luz no tienen una direccionalidad
intrnseca (la ley de Snell es simtrica); por lo tanto,
invirtiendo la direccin, podemos decir que la longitud focal
tambin representa la distancia del lente a la cual, si se
coloca una fuente luminosa puntual, los rayos emergen
paralelos al otro lado (i.e. forman un rayo colimado).

Si el objeto puntual no se coloca a la distancia focal, sino a una distancia mayor que f los rayos
no emergen paralelos al otro lado, sino se enfocan en un punto, como ilustra la figura 4.9B y C.
Para un lente delgado (el caso ms simple), la relacin se puede cuantificar de la siguiente
manera:
1/d
o
+ 1/d
i
= 1/f
Donde d
o
= distancia del lente al objeto, d
i
= distancia de la imagen al lente. Notar que, puesto
que los recprocos de la distancia al objeto y la distancia a la imagen deben siempre sumar el
recproco de la distancia focal (que es una constante para cada lente), si d
o
crece d
i
debe
decrecer, y viceversa. Las dos distancias sern iguales (d
o
= d
i
= d) si d = 2f. Los dos casos

Figura 4.8
74
lmite se dan cuando bien sea d
o
o d
i
(uno de los
dos) es igual a f, en cuyo caso el otro es infinito (los
rayos sern paralelos). Posteriormente
consideraremos que pasa si uno acerca el objeto al
lente a una distancia an menor que f.

Debido a que el enfocar un punto-objeto a un
punto-imagen se aplica para cada uno de los
puntos en un plano ubicado a una distancia dada
del lente, se puede formar al otro lado del lente (el
plano focal conjugado) una imagen de un objeto.
En estas condiciones la imagen es invertida,
respecto al objeto, y se suele llamar una imagen
real (si uno interpusiera una pantalla en ese plano, uno efectivamente vera la imagen
proyectada sobre la pantalla). La magnificacin de la imagen (el tamao de la imagen, relativo
al del objeto que representa) est dada por el cociente entre la distancia lente-imagen y la
distancia al lente-objeto:
M = (d
i
f)/f = d
i
/d
o

Estas dos relaciones pueden fcilmente deducirse de un razonamiento geomtrico, ilustrado en
la Figura 4.10. Consideremos un objeto, representado por la flecha roja a la izquierda.
Sabemos que de cada punto del objeto emanan rayos en todas las direcciones, slo algunos
de los cuales sern captado por el lente. En el panel superior de la figura tomamos en cuenta
solamente el rayo axial que emana del extremo inferior del objeto; ste incide en el lente
perpendicularmente (por estar en el eje
ptico) y por lo tanto no sufre desviaciones en
su trayectoria. Ahora, de la punta de la flecha
consideremos dos de los rayos (i) el que es
paralelo al eje ptico y que por lo tanto, al
emerger al otro lado del lente se dobla,
cruzando el eje a una distancia f (por
definicin de distancia focal de un lente!). (ii)
el que pasa por el punto focal del lente al
mismo lado, y que por lo tanto debe emerger
paralelo al eje ptico (de nuevo, debido a la
definicin de distancia focal). El punto en el
cual estos dos rayos se interceptan est
necesariamente en el plano focal de la
imagen (ese es el lugar donde rayos que
emanan de un mismo punto vuelven a re-encontrarse al otro lado del lente). Los dos tringulos
rectngulos con el ngulo marcado son similares (si dos de sus ngulos son iguales, el
tercero necesariamente lo ser tambin). El cateto a lo largo del eje ptico del tringulo de la
izquierda tiene longitud f , el de la derecha tiene longitud d
i
- f ; su tamao relativo, por lo tanto,
es (d
i
- f)/f. Ese debe ser tambin el tamao relativo de los dos catetos verticales (por ser
tringulo similares), y puesto que el de la izquierda tiene la misma longitud que el objeto (el
rayo superior es paralelo al eje ptico) quiere decir que lo mismo se aplica a la imgen con
respecto al objeto, lo cual, por definicin, es la magnificacin. Alternativamente, podemos
considerar el panel de abajo de la Figura 17 y notar que los dos tringulos con el ngulo
marcado tambin son similares, y que la razn entre la longitud de sus catetos horizontales es
d
i
/d
o
. Por el mismo razonamiento, ese ser tambin el tamao relativo de la imagen con

Figura 4.9
Figura 4.10
75
respecto al objeto, es decir la magnificacin. Notar que al seguir las trayectoria de los rayos
que se originan de dos puntos diferentes del objeto se entiende porque una imagen real el
invertida.

Consideremos un par de aplicaciones: a partir de la relacin 1/d
o
+1/d
i
= 1/f, es evidente que al
conocer el valor de dos de las tres variables, la tercera se despeja fcilmente. Por ejemplo, si
d
o
y d
i
se conocieran, entonces para encontrar f primero encontraramos el mnimo comn
denominador del lado izquierdo:
(d
o
+d
i
)/ d
o
d
i
= 1/f f = d
o
d
i
/ (d
o
+d
i
)
Por ejemplo, si d
o
= 50 mm y d
i
= 150 mm, entonces f = 7500/200 = 37.5 mm. Un lente con esta
distancia focal enfocara perfectamente a las distancias prescritas. La imagen resultar
magnificada por un factor M = d
i
/d
o
= 150/50 = 3

De una manera similar, si en cambio nos dijeran que d
o
= 20 mm y f = 4 mm, entonces para
encontrar d
i
:
d
i
= d
o
f / (d
o
- f)
d
i
= 204/(20-4) = 80/16 = 5 mm. M = d
i
/d
o
= 5/20 = 0.25

Estrictamente hablando, estos clculos sencillos se basan en la suposicin de que el lente en
cuestin es delgado. Si en cambio su grosor fuera considerable las reglas se tornan ms
complejas, y habra que tomar en cuenta elementos adicionales (e.g. los planos principales`
del lente), pero para nuestros propsitos el acercamiento simplificado brinda un nivel de
comprensin suficiente.

Como empalma el principio de tiempo mnimo de Fermat con el hecho de que con un lente se
puede enfocar un punto luminoso en un punto-imagen? Evidentemente, en este caso para ir de
un punto al otro, los rayos de luz toman muchos caminos, no uno solo (de lo contrario no habra
muchos rayos que nacen del mismo punto y vuelven a converger a un mismo punto). Por lo
tanto debe ser que los distintos recorridos requieren exactamente el mismo tiempo, lo cual los
hace todos igualmente viables: el rayo que viaja desde el objeto puntual pasando por el centro
de un lente convexo tiene menos recorrido en el aire, pero luego debe cruzar la porcin ms
espesa del lente, por el cual se propaga ms lentamente. Los rayos que emanan del mismo
punto pero se dirigen a la periferia del lente tienen en cambio un recorrido mayor por el aire,
pero este se compensa luego por tener que atravesar solo la parte ms delgada del lente Si
no hay un camino ms rpido que escoger entre los dos puntos, la luz los toma todos!` Si
calculramos los tiempos totales para los distintos caminos, tomando en cuenta las varias
distancias y la velocidad de propagacin en el aire y en el vidrio, llegaramos exactamente a la
misma conclusin que se desprende de la ley de refraccin: al disear un lente que iguale el
tiempo de viaje para todos los distintos rayos,
ste resulta teniendo la misma forma que se
deriva de la aplicacin de la ley de Snell.

Imgenes virtuales
Al colocar un objeto puntual ms cerca al lente
que la distancia focal, los rayos divergen al
cruzar el lente, con trayectorias como si
provinieran de una imagen del objeto ubicada al
mismo lado que el objeto mismo (imagen

Figura 4.11
76
virtual); esta imagen no es invertida. Es decir, no se forma una imagen verdadera, sino que un
observador ubicado al otro lado del lente (respecto al objeto) vera el objeto mismo como si
estuviera a una distancia diferente a su posicin real (lo mismo ocurre si uno utiliza un lente
cncavo, que se suele llamar lente divergente). La Figura 4.11 muestra esta situacin. Un
ejemplo familiar es la impresin que puede dar una piscina de ser ms panda que su verdadera
profundidad: los rayos que emanan del fondo de la piscina divergen ulteriormente al cruzar la
interfase agua-aire, y un observador vera el fondo como si estuviera ms cerca de la superficie
de lo que realmente es.

Dioptras
Como ya se discuti, para un lente convexo (convergente) a mayor curvatura de la(s)
superficie(s), mayor la desviacin de los rayos y por lo tanto menor la distancia focal. En ptica
fisiolgica se suele utilizar, en lugar de la distancia focal, otra medida para indicar el poder
refractivo de un lente: este es el recproco de la distancia focal medida en metros, y su unidad
es la dioptra. Por lo tanto, un lente que tuviera distancia focal f = 50 cm (= 0.5 m) tendra un
poder de 1/0.5 = 2 dioptras. Las dioptras son las unidades comnmente utilizadas en
optometra. Si el lente fuera divergente, el valor sera negativo.

Sistemas pticos complejos
Rara vez un aparato ptico est
constituido de un solo lente. A veces se
trata de varios lentes o hasta decenas de
lentes. Como manejar esa situacin?
Simplemente considerndolos uno por
uno. Miremos la Figura 4.12; si un objeto
estuviera colocado a una distancia d
o
del
primer lente del sistema, calcularamos
donde se formara la imagen
(obviamente, basndonos en la distancia
focal del primer lente). Luego
consideraramos el segundo lente, y donde formara la imagen de la imagen (es decir, tomando
la primera imagen como si fuera el objeto); y as sucesivamente. A travs de mltiples
aplicaciones de la misma frmula, llegaramos a determinar donde se formara la imagen final y
cual sera su magnificacin (esta ltima viene siendo el producto de las magnificaciones
individuales). Este mismo razonamiento se aplica cuando en un sistema ptico una imagen se
forma a una distancia del lente siguiente que es menor que su distancia focal. En este caso la
imagen siguiente ser virtual. Como se examinara ms tarde, esta situacin ocurre en un
instrumento muy familiar, el microscopio de luz.

Profundidad de campo
Dos lentes pueden tener la misma curvatura, pero diferente dimetro. Por supuesto, la distancia
focal ser la misma, pero los dos lentes diferirn en un aspecto importante: para un objeto
puntual ubicado a una distancia d
o
, el cono de rayos que emanan del objeto y que sern
captados por el lente es necesariamente ms estrecho si el dimetro es menor. La apertura
numrica (N.A.) de un lente que enfoca un objeto se define como N.A. = Nsin, N siendo el
ndice de refraccin del medio y es del ngulo de aceptacin de los rayos de luz que se
originan de un punto. Para una distancia dada del objeto, N.A. depende evidentemente del
dimetro del lente. Una mayor apertura numrica confiere al lente mayor luminosidad, ya que
implica una fraccin ms grande de luz captada. La apertura numrica tambin repercute en lo

Figura 4.12
77
que sucede con la imagen de objetos que se
encuentren ms cerca o ms lejos del plano al cual
se est enfocando. La Figura 4.13 ilustra este
concepto: dos objetos puntuales, o
1
y o
2
se
encuentran a diferentes distancias de un lente
(mayor que la longitud focal del lente para que
ambas imgenes sean reales); sus respectivas
imgenes, por lo tanto, tambin se formarn a
diferentes distancias al otro lado del lente (i
1
y i
2
).
Supongamos que el plano imagen de inters
(donde interceptamos la imagen, poniendo un
pantalla, o el sensor de una cmara) fuera i
2
donde
se enfoca el objeto o
2
. Nos preguntamos como se
ver en ese plano la imagen del objeto que no est
en foco (i.e. o
1
). En la parte superior de la figura se
examina el caso de un lente de gran apertura numrica, en la inferior el de un lente de la misma
distancia focal pero menor apertura numrica (menor dimetro). En ambos casos los rayos que
emanan de o
2
(lneas rojas) convergen a un punto, mientras que los de o
1
(lneas azules) han
convergido prematuramente (por estar el objeto ms lejos del lente, recuerden la relacin 1/f =
1/d
o
+ 1/d
i
) y por consiguiente en el plano de i
2
los rayos estn de nuevo divergiendo. Pero hay
una diferencia: si el cono de los rayos desenfocados es estrecho (i.e. los captados por el lente
de pequea apertura numrica) entonces su rea de seccin en el plano imagen ser pequea
(disco azul del panel inferior), y por lo tanto no se ver muy borroso. En cambio, cuando la
apertura numrica es grande el cono converge y diverge ms abruptamente, y por consiguiente
al interceptar la imagen no en su punto focal se generar un disco ms grande (disco azul del
panel superior), es decir, una imagen ms difusa y desenfocada. La conclusin es que
alterando la apertura numrica (como por ejemplo, manipulando el diafragma del objetivo de
una cmara fotogrfica) se puede variar la profundidad de campo, que es el grado en el cual
objetos ms cercanos o ms lejanos del plano que se est enfocando todava retengan una
buena nitidez. Esto lo saben muy bien los fotgrafos, y cuando desean resaltar un sujeto con
respecto al fondo abren mucho el diafragma del objetivo, haciendo que solo el sujeto est bien
enfocado y lo dems se torne difuso; viceversa, cuando se quiere tener razonablemente bien
enfocados varios objetos que se encuentren a diferentes distancias, se cierra el objetivo lo ms
posible.

Aberracin esfrica
La curvatura de un lente que est diseado para enfocar exactamente todos los rayos de un
haz colimado en un solo punto est descrita por una funcin de cuarto orden. A menudo, la
fabricacin de lentes, al igual que en el caso de espejos, utiliza una aproximacin esfrica, la
cual provee un desempeo excelente para rayos
paraxiales, pero los rayos perifricos no son
enfocados en el mismo plano, y por lo tanto
contribuyen, en el plano focal, una luz difusa que
degrada la calidad de la imagen. Este fenmeno
se denomina aberracin esfrica y ocurre
frecuentemente en elementos pticos de sistemas
biolgicos, donde la forma del lente es a menudo
esfrica, por estar determinada por la isotropa del
campo de fuerzas que lo moldean durante el
desarrollo (por ejemplo, lo mismo ocurre con la

Figura 4.14

Figura 4.13
78
tensin superficial de una gota, o con la agregacin de material rodeado por un medio lquido).
La Figura 4.14 muestra lo que sucede con un lente cuya curvatura en ambas caras se asemeja
a una porcin de la superficie de una esfera. Los rayos centrales (flechas negras) se enfocan
todos en el mismo punto, pero a medida que los rayos se alejan del eje ptico (flechas grises
oscuras y claras) encuentran un ngulo de incidencia ms y ms pronunciado que lo necesario,
y son desviados hacia puntos progresivamente ms cercanos. Una posible estrategia para
corregir la aberracin esfrica consiste en limitar la luz utilizada a los rayos paraxiales,
mediante una apertura o un diafragma (por supuesto, a costa de la luminosidad de la imagen),
el cual debe colocarse cerca del plano del lente (no el plano-imagen), para rechazar los rayos
perifricos.

Aberracin cromtica
Otro problema que altera la calidad de la imagen
deriva del hecho que el ndice de refraccin
normalmente manifiesta una cierta dependencia
con respecto a la longitud de onda. Es por este
fenmeno que una luz blanca (como la del sol)
que pasa por un prisma de cristal se
descompone en un arco iris: distintas longitudes
de onda son refractadas por un ngulo diferente,
y por lo tanto se separan una de otra. Para el
caso de un lente, esto implica que rayos de una
cierta longitud de onda se enfocan en un plano,
pero para otra longitud de onda el plano imagen
se ubicara a una distancia ligeramente diferente.
En particular, para una fuente puntual de luz
blanca, los distintos componentes espectrales (por ejemplo, rojo, verde, azul, etc.) llegaran a
concentrarse en un punto a distintas distancias del lente. Por consiguiente, uno observara, en
el plano focal apropiado para una longitud de onda particular, un punto de ese color rodeado de
un halo ms difuso de otros colores (ver Figura 4.15). El fenmeno se denomina aberracin
cromtica, y en la fabricacin de elementos pticos se logra corregir en buena medida
utilizando lentes constituidos por varias capas de vidrios de distintas propiedades, los cuales se
compensan mutuamente (lentes acromticos). En aplicaciones en las cuales el color puede no
ser importante (por ejemplo, fotografa en blanco y negro, y ciertas aplicaciones de
microscopa), una forma sencilla de
eliminar de raz el problema es utilizando
luz monocromtica (i.e. de una sola
longitud de onda), interponiendo un filtro
que solo transmita una estrecha banda
de longitudes de onda y absorba o
refleje las dems.

El lmite de difraccin
An con un lente de forma ideal y
perfecta correccin cromtica, resulta
que la imagen de un punto proyectada
en el correspondiente plano focal (o,
equivalentemente, lo que se observa en
el plano de la distancia focal de un lente

Figura 4.16

Figura 4.15
79
sobre el cual incide un rayo colimado), no es un punto perfecto (i.e. infinitamente pequeo),
sino una mancha diminuta pero algo difusa, rodeada por una serie de anillos luminosos
progresivamente ms tenues, que se denomina el disco de Airy. Para explicar el origen y la
naturaleza de este fenmeno no es posible basarse en ptica geomtrica, en la cual
conceptualizamos la luz como rayos que viajan en forma rectilnea, sino se requiere analizar la
luz como ondas electromagnticas tri-dimensionales que se propagan y que pueden interferir
unas con otras en forma constructiva (cuando dos frentes de onda al encontrarse estn en fase
y se suman) o destructivamente (cuando estn fuera de fase y se anulan mutuamente). Una
discusin detallada del tema excede las metas de esta revisin, pero podemos esbozar un
argumento intuitivo de la siguiente manera. Consideremos un lente ideal que est enfocando un
objeto en su imagen, lo cual implica que forma unos frentes de onda esfricos cuyo centro es el
punto-imagen (recordar que si los tiempos de viaje son iguales, por el principio de Fermat,
entonces en el punto-imagen as como en cualquier conjunto de puntos equi-distantes de l, el
campo electromagntico estar oscilando en sincrona). Acudamos al principio de Huygens,
segn el cual cada punto en un frente de onda se puede considerar el origen de una nueva
onda que se propaga en todas las direcciones; tomemos las ondas originadas en dos puntos
distintos sobre el mismo frente y consideremos la direccin de propagacin bien sea hacia el
foco (Figura 4.16 A) o hacia un punto lateral al foco, pero en el mismo plano (B). Para llegar al
foco, la distancia recorrida por las dos ondas es la misma, por lo tanto llegan en fase e
interfieren constructivamente, sumndose. En cambio, para llegar al otro punto las distancias
son diferentes, lo cual implica un desfase, que crece al aumentar la distancia del foco. En
regiones aledaas habra parcial cancelacin de las ondas
que llegan, y por consiguiente menor intensidad de la luz,
pero donde la diferencia de distancia implique un desfase de
180, la interferencia destructiva sera total: las dos ondas se
aniquilaran, i.e. no habra luz en ese punto. En el plano del
foco, entonces, habr una regin brillante que desvanece
gradualmente a los lados, hasta la oscuridad; ms an, en
regiones an ms lejanas, donde la diferencia de fase se
aproxime a 360, de nuevo vuelve a ocurrir una interaccin
constructiva; esto implica que se formarn anillos concntricos
alrededor de la regin luminosa. El disco de Airy tiene por lo
tanto un perfil de intensidad de iluminacin con forma de
campana, rodeado de anillos ulteriores de luz cada vez ms
tenues. El panel superior de la Figura 4.17 ilustra su
apariencia, mientras que en el panel inferior de la misma
figura se muestra el perfil de intensidad a lo largo de una lnea
que pase por el centro del disco de Airy.

Estas dimensiones finitas de la imagen de un punto impone
un lmite mximo (el as llamado lmite de difraccin) a la
resolucin ptica de una imagen: dos puntos solo podrn
resolverse si sus respectivas imgenes son separadas, es decir, si sus respectivos discos de
Airy no estn sobrelapados. El dimetro del disco de Airy (r) es proporcional a la longitud de
onda () e inversamente proporcional al dimetro del lente o, ms especficamente, a la
apertura numrica del lente: r /N.A.. Por lo tanto, manteniendo constante los dems factores,
entre mayor la apertura numrica, mayor la capacidad de resolucin, ya que los discos de Airy
correspondientes a dos objetos puntuales cercanos uno al otro sern ms pequeos, y por lo
tanto tendern a no superponerse. Tambin, debido a la misma relacin, es posible mejorar la
resolucin utilizando longitudes de onda ms cortas (e.g. luz azul: de all la carrera para
producir lseres de diodo con emisin azul para usar en lectores de CDs y DVDs la as

Figura 4.17
80
llamada tecnologa Blue Ray - ya que, siendo capaces de enfocar la luz en un punto ms
pequeo, permiten empacar ms informacin por unidad de rea del disco, respecto a un lser
convencional rojo).

Reflexin total interna y sus aplicaciones
Hasta ahora se ha enfatizado la refraccin en situaciones en las cuales la luz viaja de un medio
de menor a mayor ndice de refraccin, como es el caso de un lente. Sin embargo hay casos
importante en los cuales sucede lo contrario. Consideremos la ley de Snell, Sin(
1
)/ Sin(
2
) =
N
21
, aplicada a una instancia en la cual la luz viaja de un medio de menor velocidad de
propagacin (mayor ndice de refraccin, llammoslo Medio 2) a otro de mayor velocidad de
propagacin (menor ndice de refraccin, Medio 1), como por ejemplo de vidrio a aire. En este
caso sabemos que, a medida que aumente el ngulo de incidencia del rayo sobre la interfase,
mayor ser la desviacin del rayo refractado, respecto a la trayectoria rectilnea, y esta
desviacin ocurrir en la direccin que lo aleja de la normal (es decir, el rayo refractado tiende
a acostarse hacia la superficie de la interfase vidrio-aire). Esto implica que, con un cierto
ngulo incidente, el rayo refractado podra quedar paralelo a la interfase:
1
= /2 (90) y por lo
tanto sin(
1
) = 1. La ley de Snell en este caso se reduce a 1/ Sin(
2
) = N
21
y por lo tanto Sin(
2
)
= 1/N
21
= N
12
; el ngulo de incidencia al cual este fenmeno ocurrir ser
2
= arcsin(N
12
), y se
conoce como el ngulo crtico. A ngulos de incidencia an mayores, la luz rebota de la
interfase; el fenmeno se denomina reflexin interna total.

Fibras pticas. La luz, como se dijo al comienzo de estas notas, viaja en lnea recta
(contrariamente a la electricidad, que sigue la trayectoria del conductor). En algunas
situaciones esto llega a complicar la aplicacin de iluminacin, o la coleccin de luz en sitios de
difcil acceso. Existe una manera de obviar esta dificultad, haciendo que un haz de luz se
propague a lo largo de una fibra que puede dar curvas, de la misma manera como una
corriente elctrica fluye por un cable. La reflexin interna total se ha utilizado para guiar la
transmisin de luz por caminos no rectilneos, haciendo uso de un conducto slido de material
transparente (vidrio, plstico etc.) rodeado de aire u otro medio de menor ndice de refraccin
que el conducto mismo. El artefacto se llama fibra ptica y asegura que, mientras el rayo viaje
internamente incidiendo sobre las paredes de la fibra formando un ngulo mayor que el ngulo
crtico (respecto a la normal de la pared), proceder
hacia adelante rebotando mltiples veces sin
escapes laterales. La Figura 4.18A muestra
esquemticamente la situacin. Notar que si se
doblara la fibra de una manera pronunciada, rayos
de luz podran encontrar un ngulo de incidencia con
la pared de la fibra por debajo del lmite crtico, en
cuyo caso el rayo saldra de la fibra (panel B de la
misma figura). Usualmente, las fibras pticas se
pueden fabricar en dimetros desde 0.02 hasta 2
mm, y se suelen juntar en un manojo que puede
contener muchos cientos o miles de fibras, con un
dimetro total de unos 2-8 mm; por supuesto, es
imprescindible que las fibras estn separadas una de
otra por un material de bajo ndice de refraccin,
para que la luz quede confinada dentro de cada fibra separadamente. La versin ms
sofisticada de fibra ptica contempla un conducto transparente en el cual el ndice de refraccin
es mximo en el centro y disminuye radialmente hacia la periferia; de esta manera los rayos de
luz curvan gradualmente y son guiados a lo largo de la fibra, usualmente sin llegar y tener que

Figura 4.18
81
rebotar de la superficie del cilindro (fibras indexadas). Las aplicaciones ms comunes
conciernen iluminadores de varios tipos, que permiten traer un haz de luz a sitios poco
accesibles (por ejemplo, un campo de ciruga, un microscopio), ya que (i) el conducto de fibras
pticas suele ser flexible, (ii) su cabeza terminal es mucho ms pequea que un iluminador
(constituido por una lmpara, colector, etc.), y (iii) el conducto de fibras pticas no transmite
sino una mnima fraccin del calor que genera la
lmpara.

Aplicaciones a endoscopia. En un conducto de
fibras pticas, normalmente no se preserva
ningn orden espacial, i.e. distintas fibras se
cruzan de un lado al otro a lo largo del camino. La
luz queda completamente revuelta, lo cual, para
propsitos de iluminacin, puede tener ciertas
ventajas, como asegurar uniformidad espacial del
la intensidad de luz, ya que toda heterogeneidad local viene mezclada al azar. Pero es posible
tambin fabricar un conducto en el cual la disposicin espacial de las fibras individuales se
preserve punto-a-punto a lo largo del conducto. La Figura 4.19 muestra este arreglo, que se
denomina un conducto de fibras pticas coherentes: fibras selectas individuales han sido
marcadas (A, B y C), para recalcar como sus respectivas posiciones se mantienen. Unas
fibras pticas coherentes permiten que, si se proyecta o enfoca una imagen sobre un extremo
del conducto, la imagen se mantiene y se transmite hasta el otro extremo. Debido al pequeo
tamao del conducto y su flexibilidad, es posible utilizarlo, en conjuncin con algn elemento
ptico (un objetivo) montado en uno de los dos extremos, para insertarlo dentro del organismo
(e.g. esfago, estmago, intestino, etc.) y obtener de una manera mnimamente invasiva una
imagen.

Figura 4.19
82
5. Fluorescencia
Fenmeno bsico. Existe un ulterior fenmeno ptico de gran relevancia a las ciencias
biomdicas, que consiste en que cierta clase de molculas, cuando se les irradia con luz,
emiten luz a su vez. La absorcin de un fotn implica que su energa (E = h) debe haber sido
transferida a la molcula en cuestin y puede llevar un electrn a saltar a un orbital ms alto.
Este incremento en el nivel energtico dura poco (por lo general billonsimas de segundo), y
tiende a disiparse en movimientos moleculares como vibraciones y rotaciones, lo cual
simplemente se traduce en calor. Pero molculas cuya estructura es muy rgida (por ejemplo,
cuando contienen anillos aromticos) no se prestan para descargar con movimientos toda esa
energa absorbida, debido a su limitada flexibilidad. Entonces, solo una pequea fraccin de la
absorcin inicial se disipa en calor, el resto en un brinco abrupto de vuelta a un estado
energtico ms bajo, cuando el electrn retorna a su orbital original. Esta diferencia de energa
no puede simplemente desvanecer (de lo contrario se violara la primera ley de la
termodinmica, el principio de conservacin de energa), sino se debe manifestar en algo. Este
algo es la emisin de radiacin electromagntica (i.e. otro fotn). Puesto que, antes de
lograrlo, la molcula en cuestin inevitablemente
ya habr perdido alguna fraccin de la energa
adquirida, el camino no es totalmente reversible
y por lo tanto la energa del fotn emitido es
menor que la del fotn absorbido. Es decir, por la
relacin de Einstein, la longitud de onda de la luz
emitida es necesariamente mayor que la de la
luz absorbida (tambin llamada de excitacin);
esta discrepancia entre la longitud de onda de la
luz de excitacin y la de emisin se llama el
desplazamiento de Stokes. La Figura 5.1
muestra esquemticamente este proceso.
Molculas capaces de emitir luz luego de ser
irradiadas se conocen como fluorforos (por ejemplo, la fluorescena, o la rodamina).
Espectros de excitacin y de absorcin. El fenmeno de la fluorescencia es sumamente
verstil, y ha generado una enorme variedad de aplicaciones en ciencias bio-mdicas. En
primer lugar, la absorcin y la emisin de luz de cada fluorforo tienen caractersticas
especficas en cuanto a longitud de onda. Esto se puede determinar utilizando diferentes filtros
que dejen pasar solo una longitud de onda particular, e interponindolos en el camino del rayo
de excitacin, y en el camino de la emisin. Por
ejemplo, se puede mantener un filtro fijo al frente del
detector, y medir la intensidad de la emisin mientras
se vara la longitud de onda de excitacin; la
representacin grfica de esta relacin define el
espectro de excitacin de la molcula en cuestin.
Alternativamente, se puede excitar el fluorforo con una
longitud de onda fija y variar en cambio la longitud de
onda del filtro de emisin (tambin llamado filtro de
barrera). La determinacin de cmo distintas longitudes
de onda contribuyen a la fluorescencia emitida se llama
el espectro de emisin. La Figura 5.2 ilustra los
espectros de absorcin (lnea punteada) y de emisin
(lnea contnua) de un compuesto fluorescente. La
eficiencia con la cual una molcula fluoresce depende de dos parmetros crticos: el primero es
su capacidad de absorber la luz de excitacin, es decir, su coeficiente de extincin molar; el
Figura 5.1

Figura 5.2
83
segundo se conoce como la eficiencia cuntica, y representa la probabilidad de que un fotn
absorbido produzca la emisin de otro fotn (en lugar de disiparse la energa trmicamente).
Aplicacin de la fluorescencia al marcaje de molculas. Puesto que estas curvas suelen tener
una forma y un pico mximo caractersticos para diferentes
molculas, al examinarlas se deriva informacin sobre la
presencia de dichas sustancias en una muestra. Ciertos
fluorforos tienden a combinarse especficamente con otra
molcula, la cual puede ser de inters biolgico, permitiendo as
detectarla; este es el caso del bromuro de etidio, que se intercala
con el ADN, de tal manera que cuando la muestra es irradiada
con luz ultravioleta el bromuro de etidio emite luz anaranjada y
se puede facilmente visualizar. La Figura 5.3 muestra un ejemplo
de ADN separado electroforticamente en un gel de agarosa
(banda brillante a la derecha); en el carril de la izquierda se
encuentran marcadores de diferentes tamaos como referencia.
En otras aplicaciones se puede conjugar un fluorforo a un anticuerpo que reconozca alguna
protena particular, lo cual permite establecer su localizacin en un tejido.
Uso de fluorescencia para monitorear funcin celular.
Otra aplicacin muy importante de la fluorescencia concierne la medicin de cambios en la
concentracin de sustancias de inters biolgico. Un reto particularmente complejo concierne
mediciones en el interior de la clula, por ser un compartimiento de difcil acceso y diminutas
dimensiones, el cual por lo tanto suele estar fuera del alcance de mtodos bioqumicos
convencionales. La fluorescencia, en cambio, hace posible realizar mediciones mnimamente
invasivas en clulas vivas y en tiempo real. Este acercamiento requiere el uso de alguna
molcula reportera fluorescente la cual cumpla con las siguientes condiciones: (i) sea capaz de
establecer un enlace reversible con la sustancia de inters (ii) exista alguna diferencia en sus
propiedades de fluorescencia entre el estado libre vs. cuando se liga al sustrato. Las
alteraciones inducidas por la interaccin entre el reportero (o indicador) y el sustrato pueden
implicar (a) cambios en la intensidad de la emisin fluorescente (b) cambios en la absorcin de
la luz de excitacin (c) un desplazamiento del espectro de excitacin (d) un desplazamiento del
espectro de emisin. Por supuesto, la lgica que subyace a este tipo de medicin es que la
concentracin del sustrato determina la cantidad de complejos (sustrato-indicador) que se
forman. Consideremos el caso ms simple, una reaccin bi-molecular en la cual una molcula
de indicador (I) se une reversiblemente a una molcula de sustrato (S):

I+S IS

Este esquema cintico es muy conocido y lo resumiremos brevemente (aunque el tema debera
resultar familiar a todos). La rata de cambio en la concentracin del complejo, [IS], se
representa como:
d[IS]/dt = [I][S] - [IS]
Si la reaccin es rpida en comparacin con la velocidad de los cambios en la concentracin
del sustrato, se puede considerar que en todo momento estar prcticamente en equilibrio, en
cuyo caso d[IS]/dt = 0, y por lo tanto:
[I][S] - [IS] = 0 (*)
Considerando que en el sistema se ha introducido una cantidad total fija de indicador,
llammosla I
T
, entonces podemos reducir el nmero de variables libres tomando en cuenta que:

Figura 5.3
84
[I] = [I
T
] -[IS]
Esto simplemente denota que la cantidad de molculas de indicador libre es igual a la cantidad
total menos las que se han unido al sustrato. Entonces, re-escribimos la expresin (*) como:
([I
T
] -[IS] )[S] - [IS] = 0
Ahora como variables slo tenemos la concentracin de sustrato libre, [S], y la del complejo
[IS]. Queremos despejar [IS] en funcin de [S]:
[I
T
][S] -[IS][S] - [IS] = 0
[I
T
][S] = [IS][S] + [IS]
[I
T
][S] = [IS]([S] + )
[IS] = [I
T
][S] /([S] + )
Dividiendo tanto el numerador como el denominador por y representando / como K
D
(la
constante de equilibrio de disociacin), finalmente obtenemos:
[IS] = [I
T
][S] /([S] + K
D
)
Esta es la muy familiar hiprbola rectangular
conocida como Michaelis-Menten o Iso-terma
de Langmuir: si se grafica la concentracin del
complejo en funcin de la concentracin del
sustrato libre, como se ilustra en la Figura 5.4,
se obtiene una curva negativamente acelerada
que empieza en 0 y tiende asintticamente
hacia I
T
a medida que [S] incrementa; esta
deduccin se desprende ms fcilmente
dividiendo tanto el numerador como el
denominador del lado derecho de la ecuacin
por [S], con lo cual queda:
[IS] = [I
T
] /(1 + K
D
/[S])
Cuando [S] coincide con el valor K
D
, entonces [IS] = [I
T
]/2.
Consideremos primero el caso ms simple, el comportamiento de un indicador que no fluoresce
del todo cuando est libre, y slo manifiesta un cierto nivel de fluorescencia cuando se une al
sustrato. Entonces la emisin fluorescente aumentar en funcin de la concentracin del
sustrato, siguiendo la misma relacin de Michaelis-Menten. Por lo tanto, esta seal ptica en
principio puede reportar cambios de concentracin del sustrato. Si en cambio ambas formas del
indicador (libre y ligada) fluorescen, pero de una manera cuantitativamente diferente, el mismo
acercamiento vale, pero (i) habr siempre un nivel de fluorescencia basal (ii) los cambios en la
fluorescencia al cambiar la concentracin del sustrato sern ms modestos. Es fcil ver que en
este caso la fluorescencia ser:
A[IS] + B[I]
Donde las constantes A y B reflejan la fluorescencia del indicador unido al sustrato, y el
indicador libre, respectivamente.
Hay dos consideraciones muy importantes para el uso efectivo de este acercamiento. En primer
lugar, el indicador debe tener una afinidad para el sustrato que sea del mismo orden de las
concentraciones de sustrato libre que se pretenden medir: si en cambio la afinidad es muy alta
en relacin a las concentraciones de sustrato, la gran mayora de las molculas de indicador

Figura 5.4
85
estarn ligadas a todas horas, y todo cambio ulterior en [S] producir una alteracin
despreciable en la concentracin del complejo. Por lo tanto, la fluorescencia no variar de una
manera significativa en funcin de las fluctuaciones en [S]: el indicador se encontrar saturado
(Figura 5.4). As que es imprescindible disponer de antemano de alguna informacin acerca del
rango de concentraciones que se pretende monitorear, y elegir un indicador cuya K
D
no sea
menor que dichos valores. De hecho, para simplificar la interpretacin de las observaciones
puede ser deseable que la afinidad sea tal que las concentraciones esperadas de sustrato libre
se mantengan en el rango inferior de la curva de Michaelis-Menten, donde [IS] guarda una
relacin casi lineal con respecto a [S] (Figura 5.4); en estas condiciones, la fluorescencia se
puede considerar sencillamente proporcional a la concentracin de sustrato.
Por otra parte, si la afinidad es muy baja respecto a la concentracin de sustrato (i.e. si K
D
>>
[S]), el nmero de complejos que se forman ser muy pequeo y por lo tanto la seal de
fluorescencia lo ser tambin, dificultando su deteccin. Por supuesto, para incrementar la
seal de fluorescencia se podra incrementar la concentracin del indicador, pero esto presenta
otros problemas, que es preciso esclarecer a continuacin. El hecho de que la sustancia
reportera necesita ligar una fraccin de las molculas de inters inevitablemente implica reducir
la poblacin de sustrato libre. Como tal, la medicin misma estara alterando justamente la
variable a ser medida. Ms an, al equilibrarse la interaccin sustrato-indicador, este ltimo
ejercer una accin de tamponamiento (buffer), que atena los cambios que de otra manera
deberan ocurrir. Este efecto buffer es mayor entre ms grande la fraccin de sustrato que se
ha unido al indicador. Es el mismo efecto que ejerce un tampn de pH (como Tris, HEPES,
MOPS etc.): lograr minimizar las fluctuaciones en la concentracin del sustrato (en este caso,
protones) cuando el sistema es retado con la introduccin de un cido o una base. Solo que en
el caso presente el investigador no pretende fijar el nivel del sustrato: todo lo contrario, se
quiere monitorear sus cambios con la mnima interferencia. Miremos el problema con un poco
ms de detenimiento. De la ecuacin (*):
/ = K
D
= [S][I]/[SI]
y por lo tanto el cociente entre la concentracin del sustrato unido al indicador y el sustrato libre
es:
[IS]/[S] = [I]/K
D

Si nos encontramos en la porcin casi lineal de la curva (Figura 30) quiere decir que:
[IS] << [I
T
]
Por consiguiente, [I], el indicador libre, se puede aproximar con la constante I
T
, lo cual quiere
decir que el cociente entre sustrato ligado y libre es tambin prcticamente constante (este
parmetro se conoce como la capacidad de tamponamiento o buffering capacity). Si hay que
formar muchos complejos para detectar la fluorescencia, este cociente, llammoslo B, es
grande. Supongamos que B fuera = 9, es decir el 90% del sustrato est ligado. Pero entonces,
al introducir el indicador en tan alta concentracin, la concentracin del sustrato libre ha bajado
drsticamente con respecto al valor original (al 10%). No solamente esto perturba la lnea de
base; pensemos que pasa si luego el sustrato aumentara por una cantidad X (por ejemplo al
aplicar algn estmulo): puesto que B permanece prcticamente constante, slo 1/10 de este
aumento se ver reflejado en la concentracin libre, y estaremos seriamente interfiriendo con la
fisiologa del sistema. Es imprescindible, por lo tanto, mantener esta contaminacin al mnimo,
si se quiere evitar que nuestra medicin sea invasiva.
Con el debido entendimiento de las variables implicadas y el uso de las precauciones
necesarias, de todos modos este acercamiento se ha revelado muy poderoso, y en las ltimas
dos dcadas ha permitido por primera vez proporcionar un registro de una variada gama de
86
iones intracelulares de inters biolgico: protones (pH), calcio, sodio, cloruro, o zinc. Ms an,
conjugando un fluorforo a molculas que liguen sustancias orgnicas ms complejas, tales
como el mensajero interno AMP cclico (cAMP) se torna posible seguir en tiempo real la
dinmica de diferentes procesos de sealizacin celular. La Figura 5.5 ilustra un ejemplo en el
cual una clula fue cargada con el indicador de calcio Oregon Green (el cual incrementa su
fluorescencia cuando se une a calcio). Al aplicar
estimulacin que despolariza la membrana y
causa la apertura de canales inicos calcio-
selectivos, el influjo de calcio (y por consiguiente
la elevacin de su concentracin citoslica)
produce un aumento significativo en la
fluorescencia, medida por medio de un
fotomultiplicador. Es asombroso que se logra
monitorear cambios en la concentracin de calcio
que son del orden de pocas millonsima de
molar y ocurren en una sola clula cuyas
dimensiones son de una decena de micras, el
todo mientras la clula sigue desempeando sus
funciones normales.

Indicadores cociente-mtricos (ratiometric). Conociendo las caractersticas del indicador
(tales como su coeficiente de extincin, , su eficiencia cuntica, QE, y K
D
, la afinidad para
ligarse al sustrato) ser posible derivar una medida cuantitativa de la concentracin del sustrato
a partir de un registro de fluorescencia? En principio, uno pensara que esto no debera poner
mayor dificultad, siempre y cuando uno conociera una serie de parmetros adicionales que
conciernen las condiciones bajo las cuales se efecta la medicin:
la intensidad absoluta de la luz de excitacin (L)
la concentracin total del indicador ([I
T
])
el volumen muestreado (V)
(este ltimo parmetro es indispensable debido a que la luz emitida refleja el total de fluorforos
excitados, y este nmero a su vez es el producto de concentracin volumen).
Cuantitativamente, la intensidad de la fluorescencia, F, es aproximadamente:
F = LQEV [IS] LQEV [I
T
] /(1 + K
D
/[S])
De esta expresin se puede despejar [S], la concentracin absoluta del sustrato libre.
Lamentablemente, la concentracin del indicador y el volumen pueden ser difciles de estimar
en ciertas situaciones, particularmente cuando se trata de mediciones intracelulares: el primero
porque pocas tcnicas permiten
monitorear con precisin la cantidad de
indicador introducido al interior de una
clula; el segundo porque la geometra
celular puede ser muy compleja. Sin
embargo, existe un acercamiento que ha
proporcionado una avenida muy til en
este respecto, el cual se basa en
comparar dos mediciones de
fluorescencia. Supongamos que un cierto
indicador fluoresce tanto en el estado libre
como en complejo con el sustrato, pero su

Figura 5.5

Figura 5.6
87
espectro de emisin se desplaza a lo largo de la abscisa; la Figura 5.6 ilustra el ejemplo del
indicador de calcio Indo-1 (el hecho de que los dos espectros difieran adems en su amplitud
es irrelevante). Consideremos dos longitudes de onda: una (
1
) que coincide con el punto
donde las dos curvas se cruzan (conocido como un punto isosbstico) y otra (
2
) donde las dos
curvas difieren considerablemente. La luz emitida a la longitud de onda
1
slo depende de la
cantidad total de indicador (i.e. concentracin y volumen muestreado), sin importar su estado
(libre o ligado) y por lo tanto es independiente de la concentracin de sustrato. En cambio, la
luz emitida a la longitud de onda
2
depende adems de la fraccin de indicador que se
encuentra libre vs. ligado: obviamente, si gran parte del indicador est en complejo con el
sustrato (como se espera cuando [S] aumenta), en el ejemplo de la Figura 5.6 el total de luz
emitida ser menor, puesto que a
2
el complejo fluoresce menos que el indicador libre (si
escogiramos
2
entre 400 y 440 nm, lo opuesto ocurrira). Podemos ahora calcular el
cociente de la fluorescencia registrada a las dos longitudes de onda:
F
2
/ F
1

El valor obtenido ya no depende de la intensidad de la luz de excitacin, ni de la concentracin
del indicador, ni del volumen, ya que todos stos factores han sido normalizados al dividir por la
fluorescencia medida en el punto isosbstico: el cociente slo refleja cual fraccin del indicador
se ha unido al sustrato, lo cual reporta la concentracin del sustrato. Es posible entonces
construir una escala cuantitativa de calibracin, y derivar informacin sobre concentraciones
absolutas. Lo mismo se podra obtener con un indicador fluorescente cuyo espectro de emisin
permaneciera constante pero cuyo espectro de excitacin sufriera un desplazamiento entre las
conformaciones libre y ligada (otro popular indicador de calcio celular, llamado Fura-2, funciona
de esta manera).
Seguimiento ptico de cambios de voltaje. El monitoreo de cambios de concentracin de
diferentes sustancias no es la nica aplicacin de la fluorescencia a la fisiologa y la biofsica
celular: teniendo en cuenta que la emisin de fluorescencia es sensible al coeficiente dielctrico
del entorno del fluorforo (i.e. si el entorno es hidroflico o hidrofbico) se abren ulteriores
puertas. Una de ellas es construir molculas que se insertan en la membrana y, al poseer
grupos cargados, se hunden ms o menos segn el potencial elctrico de la membrana. Si
estos cambios de posicin desplazan el fluorforo de un medio lipdico (la membrana
plasmtica) a uno acuoso (bien sea el citoplasma o el medio extracelular) o viceversa, las
variaciones resultantes en la
fluorescencia reportarn el voltaje de la
membrana celular sin necesidad de un
microelectrodo interno, es decir de una
manera mnimamente invasiva. La
Figura 5.7 ilustra esquemticamente la
lgica de este acercamiento. Ms an,
si se utiliza una cmara como detector,
se tiene el potencial de permitir el
seguimiento del voltaje de membrana
de muchas clulas al mismo tiempo, lo
cual es particularmente ventajoso, por
ejemplo, para estudiar redes
interconectadas de clulas neuronales o el propagarse de la ola de despolarizacin en tejido
cardaco. Este tipo de medicin resultara muy complicada usando un acercamiento elctrico, el
cual necesitara un gran nmero de micro-electrodos.
Figura 5.7
88
Medicin de cambios conformacionales de protenas. Se puede tambin aprovechar la
sensibilidad de la fluorescencia al coeficiente dielctrico del entorno para monitorear posibles
cambios en la conformacin de una protena de membrana. Este acercamiento puede
aprovechar la presencia de aminocidos aromticos nativos (e.g. triptfano) que son
intrnsecamente fluorescentes, Alternativamente, se puede conjugar un fluorforo a un
aminocido particular de la protena, lo cual tpicamente implica manipulaciones de ingeniera
gentica: usualmente se sustituye, si es necesario, el aminocido de inters por una cistena,
cuya cadena lateral es muy reactiva, y presenta un grupo sulfidrilo que se presta para acoplar
otras molculas mediante un puente disulfuro. Al expresar la protena mutada en alguna lnea
de clulas en cultivo (y habiendo eliminado o inactivado otras cistenas que pudieran existir en
dicha protena), se introduce el fluorforo (el cual se liga al sitio especfico), y se monitorea la
fluorescencia. Si, al aplicar estimulacin (e.g. neurotransmisores, cambios en el voltaje de
membrana, etc.) se induce una transicin conformacional de la protena tal que los aminocidos
marcados se sumergen en los lpidos o se asoman al medio de alto coeficiente dielctrico (bien
sea extracelular o citoplasmtico) se produce un cambio en la fluorescencia.

FRET. Finalmente, existe un fenmeno, llamado transferencia de energa por resonancia de
fluorescencia (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer, tambin conocida como
resonancia de Frster) que permite monitorear cambios en la proximidad entre molculas de
diferente clases. Este se basa en que si el
espectro de emisin de una molcula fluorescente
(designada como el donante) sobrelapa con el
espectro de excitacin de otra molcula (el
aceptor), entonces al estimular el donante se
puede transferir la energa absorbida al aceptor, el
cual fluoresce a su caracterstica longitud de onda.
Esta transferencia de la energa de excitacin
ocurre directamente por resonancia
electromagntica, sin emisin de un fotn, y
depende fuertemente de la separacin entre
donador y aceptor. La eficiencia del FRET decae
con la sexta potencia de la distancia, por lo tanto el
fenmeno ocurre solamente cuando los dos
fluorforos estn en estrecha proximidad, del orden de angstroms, tal como se espera cuando
dos protenas estn interactuando (e.g. un ligando y su receptor). La Figura 5.8 ilustra el
concepto: notar que la luz de excitacin para el donante (flecha morada) lo hace fluorescer (la
flecha azul representa la emisin), pero no es capaz de inducir fluorescencia en el aceptor, el
cual requerira una longitud de onda ms larga (panel superior). En cambio, cuando el aceptor
recibe la energa de excitacin que el donante le transfiere por resonancia (lo cual requiere
estrecha proximidad espacial entre los dos), el aceptor produce una emisin a la longitud de
onda caracterstica de su propia fluorescencia (flecha verde-amarilla). Es decir, en condiciones
en las cuales donante y aceptor se acercan, al irradiar con una longitud de onda apropiada para
excitar al donante, se observa en cambio fluorescencia de longitud de onda del aceptor. En la
mayora de las aplicaciones se utilizan molculas que han sido conjugadas artificialmente a
fluorforos que funcionen como partners para FRET; una de las parejas ms utilizadas son
CFP (Cyan Fluorescent Protein) como donante y YFP (Yellow Fluorescent Protein) como
aceptor y emisor. Por ejemplo, si se quiere averiguar si cuando se activa la protena A, sta
interacta con la protena B, acoplaramos un donante y un aceptor fluorescentes a las dos
protenas; se esperara que en condiciones basales la irradiacin con luz que excite el
fluorforo de la protena A resultara en emisin de su fluorescencia caracterstica. Pero bajo
condiciones de estimulacin que lleven a que las dos protenas se junten, la misma luz aplicada

Figura 5.8
89
causara la transferencia de la excitacin de A a B, y sta ltima emitira luz fluorescente de
otra longitud de onda. De esta manera se puede corroborar cuando dos molculas llegan a
interactuar.
90
6. Elementos de microscopia
Habiendo revisado los principios ms elementales de la ptica, en las secciones siguientes de
estas notas se considerar la aplicacin de dichos principios primero a la instrumentacin en
bio-medicina, y luego a la fisiologa del ojo. En primera instancia nos enfocaremos en el
microscopio, instrumento que tiene la dudosa distincin de ser tal vez el ms ubicuo y al mismo
tiempo el ms abusado: al introducir una descripcin elemental pero sistemtica del
microscopio se espera establecer las bases para su uso correcto: de nada sirve una invertir una
cuantiosa suma para adquirir un instrumento de calidad si luego, al desconocer los principios,
se utiliza de una manera falaz y se obtienen imgenes de mediocre calidad, que an un
instrumento de juguete podra producir! Ms an, se quiere tambin mostrar la existencia de
una mirada de acercamientos que proporcionan nuevos horizontes para la observacin, y
enfatizar que la tecnologa de la microscopia no es un libro cerrado, sino un campo en perenne
desarrollo, en el cual nuevos retos y acercamientos creativos originan constantemente
novedosos diseos de instrumentos que pueden proporcionar informacin insospechada.
Diseo bsico de un microscopio. En una gran cantidad de ramas de las ciencias bio-mdicas,
se trabaja con objetos de dimensiones minsculas (clulas, por ejemplo) y en muchas
instancias es preciso poderlos visualizar. Uno de los instrumentos ms ubicuos es el
microscopio de luz, cuyo propsito es generar imgenes altamente magnificadas que revelen
finos detalles del espcimen. Ya sabemos que, debido al lmite de difraccin, la resolucin que
se puede alcanzar depender de la longitud de onda utilizada y de la apertura numrica del
sistema ptico; para luz visible, en la prctica esto quiere decir que se podrn resolver detalles
de poco menos de una micra (10
-6
m o una milsima de milmetro), lo cual es adecuado para
clulas y algunas estructuras sub-celulares. Si se requiere una resolucin ms fina, hay que
utilizar radiacin de menor longitud de onda, y eso precluye el uso de de la luz visible; para
aplicaciones de esa ndole hay que acudir al microscopio electrnico.

El diseo del microscopio de luz contempla dos estadios, de all el nombre microscopio
compuesto. En primer lugar, el objeto (la muestra) es enfocado por el objetivo. En lo que sigue
consideraremos el objetivo como si estuviera constituido por un solo lente delgado; en la
realidad se trata de un sistema complejo de hasta ms de una docena de lentes, designados
para corregir las varias aberraciones, pero este acercamiento simplificado nos permite extraer
la esencia bsica del como esta construido un microscopio. El objetivo se designa por su
magnificacin (10, 20, 40 etc), pero realmente sabemos que un lente (convergente) puede
producir cualquier magnificacin (dependiendo de que tan lejos est del plano-objeto y del
plano-imagen). En este caso, la magnificacin queda fijada al establecer una distancia estndar
entre objetivo e imagen; tradicionalmente los microscopios (derechos o upright) prescriben una
distancia de 160 mm (los invertidos 210
mm). Por lo tanto, si un objetivo esta
designado como 40, quiere decir que la
imagen que se ha de formar 160 mm
atrs del objetivo debe ser 40 veces ms
grande que el espcimen, lo cual implica
que la distancia entre el frente del objetivo
y el espcimen debe se 40 veces menor
que 160 mm, i.e. 4 mm. Debido a la ley
1/f = 1/d
1
+ 1/d
2
, esto es lo mismo que
especificar para ese objetivo una
distancia focal tal que 1/f = 1/160 + =
41/160 f 3.9 mm. La imagen

Figura 6.1
91
generada por el objetivo se denomina imagen intermedia, y es a su vez magnificada
ulteriormente antes de ser registrada por el observador o una cmara. En la Figura 6.1 el
primer lente a la izquierda representa el objetivo del microscopio (el cual en realidad est
constituido por un sistema de muchos lentes, para corregir aberraciones). Un segundo
elemento ptico, el ocular, se encarga de esta segunda fase. La imagen intermedia se
encuentra a una distancia del ocular que es menor que la distancia focal de ste; por lo tanto,
una imagen virtual se forma al mismo lado que la imagen intermedia, desplazada an ms
hacia del objetivo. La magnificacin de la imagen virtual obedece tambin la regla M = d
i
/d
o
; por
lo tanto, si el ocular tuviera una magnificacin de 10x, la imagen virtual se formara a una
distancia diez veces mayor respecto al ocular. Un observador la visualizara manteniendo el ojo
relajado, como si estuviera mirando un objeto relativamente distante (unos 25-30 cm). La
magnificacin total viene siendo el producto de las dos magnificaciones (la del objetivo y la del
ocular). Notar que uno podra obtener la misma magnificacin total con distintas combinaciones
de objetivos y oculares: por ejemplo, bien sea con objetivo 40 y oculares 5 o con objetivo 10
y oculares 20, se genera una magnificacin final de 200; sin embargo, debido a que el
objetivo de menor magnificacin suele tener menor apertura numrica, produce un disco de
Airy ms grande (y por lo tanto menor resolucin de la imagen intermedia), y los oculares solo
agrandarn esa imagen, sin recuperar detalles. Por eso es importante no confundir la
magnificacin (que solamente hace referencia al tamao de una imagen respecto a la del
objeto que representa) con la resolucin (que determina el nivel de detalle que se podr
discernir en la imagen). Agrandar una imagen sin derivar ulterior detalle se suele llamar
magnificacin vaca. El arreglo de elementos pticos descrito anteriormente se llama el tren
ptico de la imagen.
Un aspecto igualmente importante concierne el haz que ilumina la muestra, y se llama el tren
ptico del iluminador. Este se origina en una fuente de luz y una serie de elementos cuyo
propsito es optimizar la uniformidad de la iluminacin de la muestra, el contraste e inclusive la
resolucin de la imagen que se obtiene. Khler cre el sistema ms utilizado para este
propsito, ilustrado en la Figura 6.2. Los elementos bsicos del sistema de iluminacin son: (i)
la lmpara (ms exactamente, el filamento del bombillo) (ii) el colector (un(os) lente(s)
colocados al frente del bombillo) (iii) el condensador (iv) el diafragma de campo (v) la apertura
(otro diafragma). El colector forma una imagen
del filamento al nivel del plano focal del
condensador; por lo tanto, los rayos que
emanan de cada punto de esta imagen, al
encontrarse a la distancia f
c
respecto al
condensador, dan origen a un haz paralelo (la
figura muestra uno solo de ellos) lo cual permite
iluminar uniformemente el espcimen.
(Necesariamente se forma una segunda imagen
del filamento en el plano focal posterior del
objetivo, la cual es proyectada por los oculares
sobre la entrada del ojo, el cual queda tambin
uniformemente iluminado).
El diafragma de campo limita la apertura del
colector, y se encuentra en un plano conjugado
al del objeto: en otras palabras, el condensador
proyecta la imagen de este diafragma en el
plano del espcimen, de tal manera que al
abrirse y cerrarse el observador ve un disco
iluminado netamente definido cuyo tamao se
Figura 6.2
92
agranda o se achica, sin alterar su nivel de
luminosidad; este efecto se ilustra en los dos
paneles superiores de la Figura 6.3. En cambio,
el segundo diafragma, la apertura, est ubicado
en el plano de la imagen del filamento (que no
es conjugado al del espcimen, sino al objetivo
y la entrada del ojo). Al abrirse y cerrarse no
cambia por lo tanto la regin iluminada, sino
cambia el grado de iluminacin,
simultneamente disminuyendo o aumentando
el contraste (a costa de una prdida de
resolucin); esto se puede apreciar en los dos
paneles inferiores de la Figura 6.3. En la
prctica, el diafragma de campo se mantiene
abierto apenas un poco ms que el campo
visual, ya que abrindolo ulteriormente slo se aade reverberacin de luz que degrada la
calidad de la imagen. La apertura del condensador se abre o cierra lo que hace falta para
obtener el balance deseado entre contraste y resolucin.

Los microscopios de luz transmitida se fabrican en dos versiones, derechos, e invertidos. Tanto
el tren ptico de la imagen como el del iluminador son esencialmente idnticos en los dos
casos, la nica diferencia concierne la direccin del haz de luz respecto a la muestra: en el
microscopio derecho, ste ilumina al espcimen desde abajo, mientras que en el invertido lo
hace desde arriba. La Figura 6.4 ilustra los dos tipos de microscopio. Existen unas ventajas del
microscopio invertido cuando se trabaja con una muestra biolgica como clulas en cultivo: al
encontrarse el espcimen en el fondo (preferiblemente de vidrio delgado) de la cmara, se
puede acercar mucho al objetivo, lo cual es especialmente valioso cuanto se trata de objetivo
de gran apertura numrica y magnificacin, que suelen tener una distancia de trabajo reducida
(la distancia entre el lente frontal del objetivo y la muestra). De lo contrario, si el objetivo
estuviese arriba (como en un microscopio derecho), podra no lograrse la corta distancia
necesaria para enfocar la muestra, o tocara utilizar objetivos especialmente diseados para
sumergirlos en el
medio acuoso
(objetivos de
inmersin, ver ms
adelante). Una
segunda ventaja es
disponer de un mejor
acceso a la muestra
para manipulaciones
fisiolgicas durante la
visualizacin (por
ejemplo, para insertar
microelectrodos), ya
que la separacin
entre muestra y
condensador es
mucho mayor y deja
considerable espacio
libre.

Figura 6.4

Figura 6.3
93
Objetivos de inmersin. El diseo de un microscopio busca optimizar la resolucin de la
imagen, y ya sabemos que una consideracin crtica concierne la apertura numrica del
objetivo. Sin embargo, en la mayora de las
aplicaciones biolgicas se presenta un
problema: el espcimen (tejido, clulas) se
encuentra en un medio lquido y/o cubierto
por una capa de vidrio, la de la lmina cubre-
objetos. Sabemos que la finura de la
resolucin ptica requiere que el objetivo
colecte el cono ms ancho posible de los
rayos de luz que emanan de cada punto del
espcimen, pero lograr una gran apertura
numrica del objetivo puede no cumplirse en
estas condiciones de observacin: los rayos
provenientes de la muestra han de viajar por
lquido y/o vidrio, y luego cruzar el espacio de
aire (cuyo ndice de refraccin es menor que
el vidrio y/o el agua) que lo separa del lente
frontal del objetivo. Los rayos que cruzan esa
interfase oblicuamente sufren una desviacin
que los hace divergir ulteriormente del eje
ptico, por lo tanto slo un cono estrecho
realmente alcanza a entrar por el objetivo,
pese a que ste tenga una alta apertura numrica. Es ms, los rayos ms oblicuos pueden
acostarse y propagarse por la interfase, o inclusive rebotar del todo; la Figura 6.5A muestra
este fenmeno, que es una consecuencia de la ley de Snell. Una forma de evitar este problema
es interponiendo entre el vidrio cubre-objetos y el lente frontal del objetivo un medio
transparente cuyo ndice de refraccon fuera similar al del vidrio; acites especiales (y, en otros
casos, agua o glicerina) se utilizan para ste propsito. Al tener un ndice de refraccin
homogneo en los tres medios (cubre-ojetos, acite, y lente) los rayos de luz no se desvan al
cruzar las interfases, y se logra efectivamente una alta apertura numrica (Figura 6.5B). Los
objetivos especialmente designados para este uso (y solamente esos!) se conocen como
objetivos de inmersin, y requieren siempre el uso de una gota de un medio lquido especfico.
Por supuesto, si los rayos de luz no encuentran un cambio de ndice re refraccin al encontrar
la superficie del lente del objetivo, tampoco sern refractados: la refraccin en un lente de
inmersin ocurre en la superficie posterior del lente (la frontal suele ser plana), donde el rayo, al
emerger del vidrio, se encuentra en el aire.

A la luz de estas consideraciones y lo discutido
anteriormente, es evidente la importancia de las
caractersticas de los objetivos a ser utilizados en una
aplicacin dada. Se debe por lo tanto prestar suma
atencin a los cdigos inscritos en cada objetivo, los
cuales incluyen:
- La magnificacin
- La apertura numrica
- La necesidad de un medio entre el
espcimen y el lente frontal
(ninguno/agua/aceite/glicerina)

Figura 6.5
Figura 6.6
94
- La necesidad de un vidrio cubre-objetos y su espesor (e.g. 0.17 indica un cubre-
objetos de 170 m, es decir #1)
- La correccin cromtica (ninguna/acromatica/apocromtica/neofluar)
- La correccin de distorsin de campo (plan)
La Figura 6.6 ilustra los diferentes parmetros marcados en un objetivo.

Aumento de contraste
En la descripcin anterior, el observador visualiza el objeto por medio de un haz de luz que
pasa a travs de la muestra (microscopa de luz transmitida). Esto implica que la imagen
necesariamente refleja que tanto distintas partes del objeto absorben diferencialmente la luz
que lo atraviesa. Muchas clulas
y tejidos son bsicamente
transparentes y adems, por la
ley de Lambert, la absorcin de
luz crece exponencialmente con
el espesor del medio, y el
trayecto a travs de una clula es
sumamente corto. Por
consiguiente, en la imagen que
se forma es difcil reconocer
estructuras o detalles, ya que
todos los rayos de luz, sin
importar por donde pasen, tienen
casi la misma intensidad. El panel
A de la Figura 6.7 muestra grficamente este problema.Una estrategia en uso desde los
comienzos de la histologa pretende obviar esta limitante tiendo los tejidos o clulas con
colorantes de muy alto coeficiente de extincin que diferencialmente adhieren a distintas
estructuras (por ejemplo al ncleo, o a la membrana); debido a que un colorante absorbe luz,
es posible entonces discernir clulas individuales o algunas de sus caractersticas. En el panel
B de la Figura 6.7 se puede comparar una misma preparacin de clulas en cultivo sin y con un
colorante que las haga visibles. En muchos casos esas tinturas son nocivas y por lo tanto se
suelen aplicar solo a tejidos muertos preservados con un fijativo (por ejemplo, formaldehido).
Esto ha estimulado el desarrollo de mtodos alternativos que se pudieran aplicar de una
manera no invasiva a clulas vivas, para incrementar el contraste de la imagen y poder
visualizar detalles que sera imposible discernir con base en la simple intensidad de la luz que
pasa por la muestra. La mayora de estos mtodos explotan una de las dos siguientes
caractersticas de la luz y su interaccin con la materia:
El comportamiento de la luz polarizada al pasar a travs de estructuras constituidas
por elementos alargados y alineados en forma sistemtica o repetitiva, que por lo
tanto transmitan luz diferencialmente, segn la direccin de la polarizacin.
La diferente velocidad de propagacin de la luz por diferentes medios (i.e. las
diferencias en el ndice de refraccin de la solucin acuosa extracelular, el
citoplasma, organelos, etc.). Esto ha dado origen, entre muchas otras, a la tcnica de
microscopa de contraste de fase, inventada por Zernike (quin recibi el Premio
Nobel para la Medicina por esa contribucin) y la de contraste de interferencia
diferencial (DIC), inventada por Nomarski. A continuacin se describir brevemente la
segunda, por ser un mtodo ms moderno y simple de explicar:

Figura 6.7
95
Microscopa de Nomarski. Primero que todo, aclaremos de que forma las diferencias en ndice
de refraccin entre el espcimen y su entorno (y las diferencias entre distintos puntos del
espcimen) pueden utilizarse para generar diferencias en la intensidad de luz. En la Figura 6.8
se ilustran dos rayos colimados y coherentes (i.e. paralelos, con la misma frecuencia de
oscilacin y fase). Uno de ellos (el de
arriba) solo pasa por el medio en el
cual se encuentra el objeto de inters,
sin atravesarlo, el otro en cambio pasa
por el espcimen, que asumimos tiene
un mayor ndice de refraccin). El
segundo rayo por lo tanto se retrasa al
transitar por un medio de menor
velocidad de propagacin de la luz, y
cuando emerge est desfasado con
respecto al primero. Si a este punto los
dos rayos interactuaran, habra
interferencia destructiva y por consiguiente una disminucin de la amplitud de la onda
resultante (menor intensidad). Este principio sugiere que podramos crear algn arreglo que
nos permitiera convertir cambios locales en ndice de refraccin en cambios de intensidad de
luz, pese a que el objeto mismo, al ser transparente, no ha absorbido luz alguna. La esencia de
la microscopa de Nomarski se ilustra en la Figura 6.9A, y consiste en pasar un rayo de luz
linealmente polarizado por un prisma (prisma de Wollaston) que lo descompone en dos rayos
tambin polarizados pero perpendicularmente el uno al otro, y separados ligeramente. Cuando
este par de rayos cruzan el espcimen (e.g. una clula) pueden bien sea pasar por medios
similares (pares de rayos #1 y #3 en la figura 6.9B), o pueden encontrar distintas estructuras
que difieren en trminos de ndice de refraccin (par de rayos #2). En este ltimo caso, uno de
los dos rayos se retarda respecto al otro, y su oscilacin electromagntica se desfasa. Al
emerger del espcimen, los dos rayos son re-combinados por otro prisma de Wollaston llamado
el analizador, e interactan: si estn en fase (i.e. si ninguno se atras respecto al otro) lo harn
de una manera constructiva
(se sumarn), mientras que si
estn desfasados (por
haberse retardado
diferencialmente) lo harn
destructivamente (el caso
lmite es un desfasamiento
de 180, en cuyo caso se
cancelarn). Por lo tanto se
crearn diferencias en la
intensidad de luz que emerge
de la muestra (que el ojo
puede percibir), a partir de
diferencias en el ndice de
refraccin de distintas
estructuras (que el ojo no
podra percibir directamente).
Esto permite revelar detalles
que de otra manera seran
invisibles. La Figura 6.10
muestra como ejemplo una
micrografa de Nomarski de unas clulas de neuroblastoma en cultivo: notar la apariencia en

Figura 6.9

Figura 6.8
96
relieve (mientras que bajo microscopa
convencional de campo claro estas clulas
apareceran prcticamente transparentes), e
inclusive la deteccin del contorno del ncleo y el
nuclolo en lagunas clulas.

Microscopa de contraste de fase. Esta tcnica de
aumento de contraste fue la primera a ser
desarrollada. Hemos postergado la presentacin
de este acercamiento porque, pese a su
antigedad y uso muy comn, la explicacin es
un poco ms compleja. En este mtodo una
mascara al frente del iluminador bloquea gran
parte de haz de iluminacin, exceptuando una
regin anular. Este elemento, llamado diafragma anular consiste en una pantalla negra y
opaca con slo un anillo transparente, y se coloca antes del condensador, a una distancia que
corresponde justamente a la longitud focal del condensador (ver Figura 6.11). Como tal, la luz
que emana de cada punto del anillo transparente (y que sea captada por el condensador) se
convierte en un haz paralelo. Al entrar al objetivo del microscopio, cada haz colimado se vuelve
a enfocar en un punto, lo cual ocurre en el plano focal posterior del objetivo (por definicin de
distancia focal). En dicho plano, por lo tanto, se forma una imagen del anillo de iluminacin
(mientras que cuando atraviesa el plano del espcimen la luz pasa de una manera difusa, lo
cual garantiza una iluminacin espacialmente homognea). El plano donde se ha de formar la
imagen de espcimen se encuentra, por supuesto,
ms lejos que la distancia focal posterior del objetivo, y
a este nivel el haz de iluminacin anular se ha vuelto a
desenfocar. La Figura 6.11 aclara todas estas
relaciones. Ahora introducimos un elemento adicional,
llamado placa de fase (Figura 6.12); ste se coloca
tambin en el plano focal posterior del objetivo, es
decir, a la misma altura donde se forma la imagen
enfocada del anillo de iluminacin (la placa de fase
suele estar incorporada en el mismo objetivo). La
placa de fase est construida con un material
transparente, pero contiene una regin anular hecha
de un material cuyo ndice de refraccin es menor que
el resto de la placa; el resultado es que la luz que pase
por este anillo sufre un retardo menor que la que pasa
por el resto de la placa, la diferencia siendo de de
longitud de onda (/4 o 90). Este anillo tiene
exactamente las mismas dimensiones y la misma
posicin en el plano x-y que la imagen del anillo de
iluminacin. En ausencia de una muestra en la platina
del microscopio, el haz de iluminacin anular pasa
enteramente por el anillo de fase, y prosigue,
desenfocndose progresivamente, hasta el plano de la imagen donde produce una regin de
iluminacin difusa. En otras palabras, mientras no exista espcimen la placa de fase no altera
el patrn de luz, slo su fase. Ahora supongamos que se ponga una muestra en el plano focal
del espcimen. Al llegar al objeto, algunos de los rayos sern refractados, y por lo tanto su
trayectoria se desviar, con la consecuencia de que al llegar a la placa de fase ya no pasarn
por el anillo sino bien sea por la regin interna o externa a l. Una propiedad de la luz
Figura 6.10

Figura 6.11
97
refractada (cuya explicacin trasciende el propsito de estas
Notas) es que adems de sufrir una alteracin en la direccin,
se retardada su fase por de . Los rayos refractados por
cada punto del objeto se enfocarn en el plano-imagen (ya que
se trata de planos focales conjugados), donde llegarn
desfasados por 180 con respecto a los rayos no refractados
(90 debido a la refraccin y otros 90 por pasar fuera de la
regin anular). Por lo tanto se crear una interferencia
destructiva, con la consiguiente disminucin de la intensidad de
la luz en ese punto: el objeto se ver oscuro sobre un campo
claro. Dependiendo del grado de refraccin por distintos puntos
del objeto, habr una gradacin de oscuridad, as que se
percibirn matices. La Figura 6.13 muestra una imagen en
microscopa de contraste de fase de unas neuronas del
mesencfalo de rata mantenidas en cultivo primario. Puesto
que solo unos pocos sufren una desviacin, el anillo de fase
(por donde han de pasar la mayora de los rayos, que no son
refractados) se construye con un material parcialmente
absorbente que atene la intensidad de la luz, logrando hacerla
ms parecida a la de los pocos rayos refractado. De esta
manera se optimiza la interferencia en el plano-imagen, y la
posibilidad de visualizar el objeto con buen contraste. De hecho,
si se examina un objetivo de fase en contra-luz, es fcil discernir
la presencia de un pequeo anillo de color gris. Hace falta
recalcar que la viabilidad de esta tcnica requiere una coincidencia espacial exacta entre la
imagen del anillo de luz y el anillo en la placa de fase. Por eso en un condensador de fase
usualmente estn disponibles varios diafragmas anulares (identificados como Ph1, Ph2, Ph3)
cuyo tamao hace que la imagen del anillo
luminoso justamente tenga las mismas
dimensiones que el anillo que est incluido en un
objetivo de fase (el cual tambin se identifica con
el mismo cdigo, bien sea Ph1, 2 etc.). Adems, la
posicin espacial debe ajustarse con exactitud
para que los dos anillos sobrelapen; esto se logra
con dos tornillos que desplazan el diafragma
anular en el condensador en el plano x/y. Para
monitorear ese ajuste, el observador tiene que
poder visualizar el plano posterior del objetivo, lo
cual no se puede hacer en la configuracin normal
del microscopio (donde lo que se enfoca es el
plano del espcimen); esto se logra re-emplazando
el ocular con un elemento especial llamado
telescopio de fase, que tiene una longitud focal
diferente (alternativamente, uno puede
simplemente quitar el ocular y mirar directamente
dentro del microscopio). Notar que en ningn
momento se asumi que el espcimen absorbe
luz: se trata por lo tanto de un objeto transparente.
Este acercamiento permiti en la primera mitad del
siglo XX observar por primera vez clulas que no

Figura 6.12

Figura 6.13
98
se hubieran podido visualizar por simple luz transmitida.

Microscopa de fluorescencia
Hay otra tcnica de microscopa que no pretende incrementar el contraste, sino visualizar
muestras o localizar molculas, aprovechando el fenmeno de la fluorescencia, descrito
anteriormente. Las molculas fluorescentes
pueden ser intrnsecas de la muestra, o pueden
haber sido aadidas por el observador (por
ejemplo, anticuerpos conjugados a un
fluorforo, que han sido generados para
reconocer una protena especfica).
Usualmente se utiliza un arreglo en el cual el
rayo de excitacin se aplica a la muestra por el
mismo objetivo (microscopa de epi-
fluorescencia, ver Figura 6.14). Para lograrlo, el
haz proveniente de la fuente de luz de
excitacin (colocada perpendicular al tren
ptico de la imagen), rebota contra un reflector
dicrico (un espejo de interferencia colocado a
45, el cual refleja la luz de ms corta que un
cierto valor crtico pero deja pasar la luz de
ms larga que el valor crtico). As que el haz
de excitacin (flecha azul) se mete por el objetivo, e irradia la muestra excitando el fluorforo.
La luz fluorescente emitida por la muestra es colectada por el objetivo pero, siendo de longitud
de onda ms larga (por el desplazamiento de Stokes descrito anteriormente), al llegar al espejo
dicrico pasa derecha y puede ser visualizada. Para incrementar la especificidad de la
observacin, es decir la confianza de que la fluorescencia observada se debe especficamente
a la molcula en la cual uno est interesado, se acostumbra limitar la luz que irradia la muestra
de tal manera que contenga solamente longitudes de onda a
las cuales el fuorforo en cuestin responde de una manera
ptima; esto se logra con un filtro interpuesto en el haz de epi-
iluminacin, llamado el filtro de excitacin, el cual deja pasar
una banda limitada de longitudes de onda, seleccionada con
base en el espectro de absorcin del fluorforo.
Sin embargo, esto no garantiza que en la muestra no estn
presentes otras molculas fluorescentes que tambin sean
excitadas por esas mismas longitudes de onda; pero si stas
emiten luz a otra longitud de onda (flecha amarilla) entonces
uno puede limitar tal contaminacin interponiendo un segundo
filtro, el filtro de barrera, ubicado antes del detector o de los
oculares, con lo cual la recoleccin de luz se cie a una banda
estrecha que represente solamente al espectro de emisin del
fluorforo de inters (flecha verde). En la Figura 6.15 se ilustra
un ejemplo: clulas de una lnea tumoral (HEK 293) fueron
trasfectadas con un plasmido que codifica la protena amarilla
fluorescente (YFP, la cual en realidad emite luz verde, pese al
nombre) fusionada a otra protena de inters. Bajo un
microscopio de fluorescencia equipados con filtros de
excitacin y de emisin idneos para la YFP, las clulas en la
cuales hubo expresin heterloga del constructo emiten luz de una manera muy clara.
Figura 6.14

Figura 6.15
99

Microscopa confocal
El uso de la microscopa de fluorescencia ha sido sumamente til para visualizar estructuras
celulares, co-localizar molculas, monitorear cambios en la concentracin de iones como el
calcio, etc. Una limitacin de esta tcnica es la interferencia de la fluorescencia que se origine
en planos por encima o por debajo del plano focal, y que contribuyen un halo difuso que
degrada la calidad de la imagen. Esto se debe a que molculas fluorescentes ubicadas en otras
posiciones a lo largo del eje z tambin son irradiadas por el haz de excitacin, como ilustra el
panel de la izquierda de la Figura 6.16, en el cual se muestra solo el camino de la luz de
excitacin. Para simplificar el anlisis, solamente estn indicados dos fluorforos, uno en el
plano enfocado y otro por debajo (puntos rojos). Al emitir luz, las molculas ubicadas fuera del
plano focal (O
2
) contribuyen una luz desenfocada; el camino de la luz emitida est
representado en el panel de la derecha
de la Figura 6.16, el cual muestra este
efecto (los rayos emitidos por el objeto
en foco y por el objeto fuera de foco se
colorearon de lila y de azul,
respectivamente, para distinguirlos);
notar que, debido a que la posicin del
punto O
2
est fuera del plano focal, los
rayos que emanan de l convergen
prematuramente en un punto-imagen, y
vuelven a desenfocarse al llegar al
detector. Inevitablemente, la presencia
de un fondo difuso de fluorescencia
disminuye el contraste de la imagen.
Uno de los acercamientos que permite obviar este problema es la as llamada microscopa
confocal, representada esquemticamente en la Figura 6.17. En esta tcnica el camino de epi-
iluminacin solo permite paso de luz por un diminuto agujero en un plano ptico conjugado al
de la muestra. Como tal, slo se ilumina un punto de la muestra. En el tren ptico de la imagen
hay un segundo agujero, tambin en un plano conjugado, as que la imagen del primero es
proyectada sobre el segundo y la luz de la emisin fluorescente puede por lo tanto pasar y
llegar a un detector muy sensible, como un foto-multiplicador. Miremos ahora que sucede con
la fluorescencia que se origina en otros planos pticos: en primer lugar, puesto que el rayo de
excitacin est enfocado para
concentrarse en un punto en un cierto
plano, a distancias menores o mayores
este haz estar distribuido sobre un rea
mayor (es decir, los rayos bien sea no
habrn convergido o bien habrn
convergido prematuramente y estarn
nuevamente divergiendo). Por
consiguiente, la
densidad del flujo de fotones
(fotones/unidad de rea) ser menor que
en el plano focal, y la excitacin de
molculas fluorescentes tambin ser
menor. Pero adems, cada punto
fluorescente en otros planos proyectarn
su imagen a una distancia que no

Figura 6.16

Figura 6.17
100
corresponde a la posicin del segundo agujero, y por lo tanto llegarn desenfocados,
distribuidos sobre un rea ms grande, y sern en gran medida bloqueados, ya que pocos de
los fotones coincidirn con el agujero. En conclusin, tanto la excitacin de la muestra como la
deteccin de la emisin de la fluorescencia son mucho ms eficientes en el plano focal que en
otros planos, y por lo tanto la fluorescencia fuera de foco queda en gran medida eliminada.
Aunque en esta descripcin y en el diagrama de la Figura 6.14 se presentan dos agujeros
separados (para claridad didctica), en la prctica la misma meta se logra con un solo agujero
apropiadamente colocado (entre el reflector dicrico y el objetivo), el cual cumple ambas
funciones. Este tipo de diseo de un microscopio, por supuesto, implica que se excita y se
observa solo un punto a la vez, y para crear una
imagen es preciso efectuar un barrido punto-por-punto
de todo el campo de inters en el plano X-Y, y re-crear
computacionalmente la imagen con base en la
intensidad de luz medida secuencialmente en cada
localidad. Inevitablemente, la toma de una imagen es
ms demorada que con microscopa convencional,
pero la ventaja es poder aislar una seccin ptica
sumamente delgada (alrededor de 1 m). El ejemplo
de la Figura 6.18 ilustra este efecto: el soma de una
neurona del mesencfaclo fue incubado con
anticuerpos contra un tipo de canal de sodio voltaje-
dependiente, y marcados con una sustancia
fluorescente; esta protena se ubica estrictamente en la membrana celular. La micrografa
confocal de fluorescencia muestra una rodaja ptica a travs de la mitad de la clula, en la cual
solamente el borde (es decir, la membrana) fluoresce, sin mayor contribucin por parte de la
membrana de las caras superior e inferior, ya que stas, pese a contener tambin la protena-
blanco, se encuentran por pocas micras fuera del plano focal. Contrariamente a creencias
populares, la resolucin lateral en el plano imagen (x-y) no es mejor que la de un microscopio
convencional: el terreno donde este instrumento brilla es la resolucin en el eje z (la
profundidad). Por consiguiente, espcimenes de por s muy delgados no revelan mas detalles
en un microscopio confocal, comparado con uno convencional; en cambio con espcimenes de
espesor ms significativo (a nivel micrioscpico!), se puede obtener informacin
considerablemente ms detallada. Adems, se puede repetir el proceso a varias posiciones a lo
largo del eje z, con lo cual uno luego dispone de una pila de imgenes (stack) que muestran
rodajas del objeto a varias profundidades, y pueden ser manipuladas para generar la
reconstruccin tri-dimensional del objeto.

Microscopa multifotnica
En aos recientes se han desarrollado otras modalidades de microscopa cuyo objetivo
principal es tambin la reduccin de la profundidad de campo, para obtener una rodaja ptica
del espcimen, minimizando la contaminacin de fluorescencia que se origine de otros planos
focales. Una de ellas, muy en auge hoy en da, se denomina microscopa multi-fotnica, y se
basa en el siguiente principio: para excitar un fluorforo hace falta un fotn de una cierta
longitud de onda, i.e. de una cierta energa (Figura 6.19, panel superior). Sin embargo, el
mismo efecto debera poderse lograr con dos fotones de la mitad de energa cada uno (por lo
tanto, el doble de longitud de onda), siempre y cuando stos fueran absorbidos
simultneamente por el fluorforo de tal manera que transferiran la misma cantidad total de
energa necesaria para elevar un electrn a un orbital ms alto (Figura 6.19, panel inferior). Por
ejemplo, si el pico de absorcin del fluorforo fuera de 380 nm, se podra excitar tambin con
dos fotones simultneos de 760 nm (en el infrarrojo). Por supuesto, para lograr que una
molcula-blanco absorbiera dos fotones al mismo tiempo hara falta un flujo de fotones no

Figura 6.18
101
solamente supremamente intenso, sino
adems concentrado en un brevsimo
instante. Algunos tipos de lser (por ejemplo,
lser de titanio-zafiro) pueden proporcionar
pulsos de luz muy intensos, cuya duracin
puede ser de nanosegundos o inclusive
decenas de picosegundos (1ps = 10
-12
s).
Como tal, si la densidad de fotones es lo
suficientemente alta para propiciar que una
molcula blanco pueda absorber dos fotones,
se garantiza la simultaneidad de los dos
eventos, de tal manera que sus efectos se
sumen. Cuales ventajas se derivan de
producir excitacin (y la consecuente emisin
de fluorescencia) por medio de absorcin
multi-fotnica? Pensemos en enfocar el haz
de luz en un punto diminuto, as como se
hace en microscopa confocal, usando un
objetivo de muy alta apertura numrica (ya
sabemos que en realidad ese punto tiene
dimensiones finitas, dictadas por el lmite de
difraccin). En planos ms arriba o ms
abajo, el cono de iluminacin se ensancha
progresivamente, con un radio proporcional a la distancia desde el punto focal. Por lo tanto, la
densidad del flujo de fotones, siendo inversamente proporcional al rea de seccin transversal
del cono, disminuir al alejarse del foco. La probabilidad de excitar molculas en planos
diferentes al plano focal evidentemente ser menor (pero no nula), y stas contribuiran una luz
difusa, la cual como ya se discuti, el microscopio confocal logra eliminar. Pero si se requiere
que para excitar un fluorforo han de absorberse dos fotones, la probabilidad de una doble
absorcin ser el producto de las probabilidades individuales (i.e. el cuadrado) y por lo tanto
decrementar mucho ms abruptamente al disminuir la densidad de del flujo de fotones,
comparado con el caso de excitacin por un solo fotn. Se obtiene por lo tanto un efecto
excitatorio limitado a un plano muy delgado de la muestra, y no hace falta preocuparse tanto
por la emisin desenfocada en otros planos, ya que sta ser despreciable. En la figura 6.20 se
compara la excitacin de un solo fotn vs. de dos fotones del compuesto fluorescente Fluorene
3. Por el objetivo de la izquierda se ilumina la cuveta con pulsos de luz lser de 380 rm, cerca
del pico de absorcin de este fluorforo:
se observa un cono de fuerte emisin
fluorescente cuyo vrtice se encuentra
en el punto focal. Por la derecha, en
cambio, se ilumina la muestra con pulsos
de luz de 760 nm: en este caso solo
fluoresce un diminuto punto en el plano
focal del objetivo (flecha roja), ya que
solo donde el rayo de luz se concentra
alcanzando su densidad mxima existe
una probabilidad significativa de que
molculas individuales absorban
simultneamente dos fotones y por lo
tanto fluorezcan. Al barrer el punto
luminoso sobre la muestra, se puede por

Figura 6.20

Figura 6.19
102
consiguiente generar la imagen de una rodaja ptica, sin necesidad de limitar la coleccin de
luz a la que pase por un agujero en un plano focal conjugado; esto hace el diseo del
instrumento ms sencillo. Pero hay otras dos ventajas fundamentales: (i) la densidad de
energa incidente alcanza un nivel muy alto solamente en el plano focal, por lo tanto el dao
fotoqumico (tal como la produccin de radicales libres txicos debidos a la luz absorbida) es
mucho menor respecto a un confocal tradicional. Esto hace posible observacin prolongada del
espcimen mientras se preserva su integridad fisiolgica. (ii) El uso de longitudes de onda ms
largas, usualmente en el infrarrojo, hace que el rayo incidente sufra menos dispersin al
penetrar un medio heterogneo, y permite por lo tanto obtener imgenes de capas ms
profundas de un tejido, en lugar de tener que ceirse a los estratos superficiales.

Microscopa de fluorescencia con reflexin interna total (TIRF).
En una seccin anterior se describi el fenmeno de reflexin total interna, que puede ocurrir
cuando un rayo que se propaga por un medio de alto ndice de refraccin incide oblicuamente
sobre la interfase con un medio de menor ndice re refraccin. Analizando desde el marco de
ptica de ondas lo que ocurre cuando el ngulo de incidencia de un rayo alcanza o excede el
nivel crtico, se ha podido concluir que realmente la luz invade el medio de menor ndice de
refraccin, aunque sea muy ligeramente: de hecho, con el ngulo crtico la onda viaja paralela a
la interfase, pero en el otro medio, penetrndolo por una profundidad diminuta, del orden de
nanmetros. Esta consideracin llev a desarrollar una nueva forma de microscopia de
fluorescencia (TIRF, tambin conocida como microscopa de onda evanescente), cuyo
propsito es lograr imgenes de una seccin ultra-fina del espcimen, notablemente ms
delgada de lo que se puede obtener con un microscopio confocal. Este acercamiento permite
por lo tanto discernir estructuras y procesos que normalmente quedaran abrumados por la
presencia de fluorescencia fuera de foco. La figura 6.20 ilustra el diseo bsico del microscopio
TIRF, que contempla un rayo lser dirigido oblicuamente a un prisma acoplado a la superficie
de vidrio sobre la cual se encuentra la muestra (usualmente una clula). Debido a que (i) el
ndice de refraccin del vidrio es mayor que el del lquido que rodea la clula, y (ii) el ngulo de
incidencia excede el ngulo crtico, en la interfase ocurre reflexin total interna. En el proceso,
sin embargo, la onda evanescente (ver recuadro ampliado) alcanza a iluminar una capa
supremamente delgada de la muestra, y excitar un fluorforo, el cual emite luz (flechas rojas).
Por supuesto, contrariamente al microscopio
confocal, no es posible visualizar ningn
objeto que se encuentre alejado de la
superficie del vidrio, pero de todas formas
este acercamiento ha sido valioso para
examinar en detalle fenmenos de membrana
como la exocitosis, o la adherencia de la
clula al sustrato durante su crecimiento y
movimientos.

Figura 6.20
103
Superando el lmite de difraccin.
Aunque se ha presentado el disco de Airy como el lmite supremo a la resolucin de un
instrumento ptico, existen acercamientos que, combinando ptica y computacin, han
permitido exceder esta barrera, especialmente con microscopa de fluorescencia. Una de las
formas, conocida como STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) consiste en
utilizar destellos de luz de excitacin tan tenues que solamente muy pocas de las molculas
fluorescentes presentes en la muestra llegan a ser estimuladas. El resultado sera una imagen
constituida por unos pocos discos de Airy (en el mejor de los casos) desparramados
aleatoriamente en el campo visual. Ahora, uno sabe que en estas condiciones cada mancha
luminosa realmente refleja una sola molcula fluorescente, y que su aparente extensin
espacial slo se debe a los efectos de la difraccin; entonces, se puede reemplazar cada una
de las manchas por un punto luminoso
arbitrariamente pequeo. Al repetir el destello de
iluminacin y tomar una segunda imagen,
probabilsticamente los pocos fotones aplicados
caern en nuevas posiciones, excitando un
conjunto diferente de fluorforos; de nuevo, se
pueden reemplazar sus respectivas imgenes
por unos puntos diminutos. La figura 6.21
muestra este proceso de una manera
esquemtica. Replicando muchas veces el
proceso se obtendr en cada instancia una
imagen formada por un conjunto diferente de
puntos; si el nmero de ensayos es muy grande,
uno llega a muestrear toda (o casi) la poblacin
de fluorforos. Combinando esas imgenes se
obtiene una imagen final que muestra todas las estructuras fluorescentes del espcimen, pero
formadas por puntos ms pequeos que el tamao de un disco de Airy, es decir, una imagen
cuya resolucin espacial puede llegar a dimensiones moleculares.

En el internet existen varios portales patrocinados por fabricantes de microscopios, en los
cuales se puede acceder a material didctico y, especialmente, programas interactivos de
simulacin del uso de microscopio. En ellos se puede visualizar el efecto de manipular cada
uno de los controles de un microscopio de luz, y constituyen un ejercicio muy til. Los ms
recomendables son:
http://www.olympusmicro.com/primer/lumbrar
http://www.microscopyu.com/

Figura 6.21
104
7. Imagenes Digitales
La importancia creciente de tcnicas de adquisicin y procesamiento de imgenes por
computador, especialmente en el rea de microscopa, justifica el esfuerzo de esclarecer
aunque sea los principios subyacentes ms fundamentales de este tema. Pero antes de
enfrentar las tareas directamente pertinentes a las imgenes digitales, es preciso introducir
una breve descripcin del problema de empalmar una cmara al microscopio, tema que se
descuida con frecuencia y que lleva a registrar imgenes degradadas y de calidad marginal
(cuando no del todo inutilizables).
Acoplamiento microscopio-cmara. Retomando el diseo tradicional de un microscopio
compuesto, hay que recordar que el objetivo proyecta una imagen real del espcimen, y que
sta, encontrndose ms cerca del ocular que su distancia
focal, forma a su vez una imagen virtual ulteriormente
magnificada. El campo que tpicamente se visualiza por el
microscopio tiene unas dimensiones, a nivel de la imagen
intermedia, del orden de 20-25 mm; si se acopla la cmara al
puerto lateral del microscopio, sta necesitara poder enfocar
un objeto del tamao de una moneda ubicado a una distancia
de unos 20-30 cm, tarea que requiere un objetivo tele-macro. Si
en cambio tratramos de utilizar el lente convencional de una
cmara (e.g. 50 mm para el formato de pelcula de 35 mm), a
esa distancia se abarcara un campo mucho mayor: por
consiguiente el rea de inters se vera diminuta, al centro de
un gran fondo negro, un fenmeno conocido como vignetting
(Figura 7.1). Una de las consecuencias es que solo una
pequea porcin del sensor de la cmara se utilizara para
visualizar el espcimen, resultando en una seria degradacin
de la resolucin de la imagen, como se discuti anteriormente.
Por lo tanto, el uso (lamentablemente, muy comn) de cmaras
convencionales para tomar directamente una imagen desde un
microscopio delata desconocimiento de los principio de ptica y
de diseo del microscopio! Lo que hace falta es un ocular
especial, llamado lente de proyeccin, tal que su punto focal
est ms cerca que la imagen intermedia, permitiendo as
proyectarla sobre el sensor de la cmara.
Resolucin espacial. El primer punto a tener en cuenta es que una imagen digital est
compuesta por un nmero finito de puntos. Esto resulta bien sea de haber sido adquirida por un
sensor constituido por una matriz de elementos discretos fotosensibles (e.g. el chip CCD de
una cmara digital), o bien digitizando la salida de un sensor anlogo (e.g. por medio de una
tarjeta de conversin anlogo-digital para TV o videos). En lo que sigue asumiremos que la
adquisicin original fue digital, que es el caso ms frecuente. Se acostumbra llamar pixel
(picture element) tanto a cada punto de la imagen misma como (impropiamente) a cada
elemento de un sensor digital. La resolucin de una imagen digital depende fundamentalmente
de dos factores cuya relevancia es obvia:
- La resolucin ptica del instrumento con el cual fue obtenida (e.g. el
microscopio)
- El nmero de pixels

Figura 7.1
105
Menos trivial es la importancia de como stos dos factores interactan: ya sabemos que el
lmite de resolucin ptica est determinado por el tamao del disco de Airy, y que dos puntos
del objeto podrn discriminarse solamente si sus respectivos
discos de Airy en el plano-imagen no estn sobrelapados. Para
preservar esta resolucin en la imagen digital es imprescindible
que en el sensor las imgenes de dos puntos apenas
separables pticamente caigan sobre pixeles diferentes En la
Figura 7.2 se muestran las imgenes de dos puntos apenas
separables opticamente. En un caso (panel superior) la matriz
del sensor est compuesta de pixels finos, y los dos discos de
Airy estimulan pixels separados; la imagen digital mostrar la
presencia de dos puntos distintos. En el otro caso (panel
inferior) la misma imagen ptica es colectada por una matrix de
elementos ms grandes, y los dos discos de Airy ocupan el
mismo pixel; la imagen digital reportar un solo punto. Es fcil
imaginar condiciones en las cuales este requisito no se cumple,
por ejemplo cuando la magnificacin ptica de la imagen es
insuficiente para el tamao del sensor: consideremos un
microscopio equipado con una cmara digital de alta resolucin,
digamos 2400x2400 pixels (5.7 Mpixels), cuyo sensor tiene una
superficie de rea de 1 cm
2
. Si la imagen del objeto en ese
plano fuera mucho ms pequea, por ejemplo un disco de 2
mm de dimetro (como por ejemplo cuando se magnifica una
clula de 20 m de dimetro con un objetivo de 100), se
estara utilizando solamente el 3% de la superficie del sensor, es decir aproximadamente 173
mil pixels. La imagen efectiva no podra llamarse de alta resolucin, y muchos detalles finos se
perderan ya que no quedaran registrados por pixels separados. Por lo tanto, para obviar el
problema, se debera bien sea magnificar ulteriormente la imagen por medio de un lente, antes
de proyectarla sobre el sensor, o bien tener un sensor de esa misma resolucin pero de
dimensiones mucho ms pequeas.
Profundidad de pixel. Otra consideracin igualmente
importante, para establecer diferencias finas entre
distintas regiones de la imagen, concierne el nmero
de niveles de intensidad de luz codificados por cada
pixel. Si la cmara fuera de 8 bits, quiere decir que el
nmero binario que representa la intensidad de luz
en cada pixel admite 256 valores posibles (2
8
). Si se
tratara de una cmara de 12 bits, seran 4096
niveles, etc. Claramente, la posibilidad de discernir
detalles mejorar al aumentar la cantidad de bits, ya
que permitir distinguir puntos de la imagen que,
aunque pticamente separable, tienen intensidades
parecidas; en cambio, una codificacin capaz de
establecer solamente pocos niveles de intensidad
podra asignar el mismo valor a dichos puntos.
Nuevamente, las especificaciones nominales no
quieren decir que ese desempeo se realiza en la
prctica. Por ejemplo, supongamos que en una
cmara de 8 bits el mximo de luz que puede recibir
un pixel durante el intervalo de exposicin fuera de
Figura 7.2

Figura 7.3
106
20000 fotones; es decir, esa intensidad representa el valor mximo (11111111 binario o 256
decimal), ms all del cual estaramos en saturacin. Si en la imagen adquirida los diferentes
pixels hubieran sido expuestos a un rango entre 1 y 500 fotones, esto representara solamente
unos 6 niveles (de los 256 posibles), y por lo tanto diferencias de intensidad entre pixels
menores de un 15% no podran discernirse, porque seran asignadas a los mismos nmeros;
sera como trabajar con una cmara de solo 3 bits. La Figura 7.3 ilustra este problema: la
imagen de la misma neurona fue tomada a la misma resolucin espacial, pero con direferente
profundidad de bits: sin lugar a duda la imagen A, codificada con 64 diferentes matizes de gris
entre negro y blanco, proporciona informacin mucho ms detallada que la imagen B, en la cual
slo se permiten 5 niveles de intensidad. Para dar un ejemplo prctico, pensemos en un
estudio de inmuno-fluorescencia para determinar si hay o no una segregacin de la expresin
una cierta protena-blanco en diferentes regiones de una clula. Si efectivamente existiera un
patrn de distribucin espacial diferencial pero, una vez digitizada la fluorescencia, los distintos
niveles de marcaje aparecieran comprimidos, asignndosele el mismo nmero a los diferentes
pixels, se llegara a la conclusin errnea de que la expresin es uniforme. Nuevamente, la falla
radica en un mal uso del instrumento, que impide extraer la informacin pertinente.
Tamao de archivo y compresin. Juntando los conceptos anteriores, podemos ahora
formarnos una idea de los requerimientos de memoria para almacenar imgenes digitales. En
primer lugar, si la imagen es monocromtica, se necesita un nmero binario para cada pixel, el
cual consiste de cierto nmero de bits; multiplicando esta cantidad por el nmero de pixels se
obtiene el total de bits (o, dividiendo por 8, el nmero de bytes). Por ejemplo, una cmara de
12801024 a 8 bits genera imgenes que requieren 1.3 MBytes de memoria. Si la cmara
fuera de colores, en cada pixel habra 3 sensores distintos (para rojo, vede y azul), cada uno de
los cuales codifica separadamente la intensidad de luz en esa banda espectral; hara falta
entonces el triple de memoria para almacenar la imagen. A esto hay que agregar un
encabezamiento del archivo, el cual contiene informacin crtica para que el computador pueda
decodificar y mostrar la imagen en la pantalla (es decir, la resolucin, modalidad, profundidad
de bits, etc.). Existen diversas estrategias para reducir el tamao del archivo que contiene una
imagen, y se conocen como algoritmos de compresin, las cuales pueden ser ms o menos
efectivas segn las caractersticas de cada imagen. A continuacin describimos un ejemplo
muy simple, conocido como codificacin de longitud de carrera. Consideremos una imagen
monocromtica sencilla, que consiste en la silueta de una rana, ilustrada en la Figura 7.4. En
principio, su representacin debera consistir en una lista de nmeros que representan,
secuencialmente, la intensidad de cada pixel
en cada hilera, repetido para todas las
hileras. Supongamos que solo hay blanco y
negro. Si hubiera solamente 32 pixel por
hilera (una imagen de bajsima resolucin) y
lo mismo por columna, se necesitaran 3232
= 1024 bytes para representar dicha imagen.
Pero si la misma intensidad se repite a
menudo en pixels contiguos, existe una
estrategia ms ventajosa: indicar el nivel de
intensidad y cuantas veces se repite. Por
ejemplo, el la primera lnea de la imagen
ejemplo, todos los pixels son blancos, y
digamos que el blanco est codificado por ek
numero 0. En lugar de hacer una lista de 32
nmeros, todos con el valor 0, podemos
utilizar solamente dos nmeros, uno para

Figura 7.4
107
indicar el valor del pixel (0) y otro para indicar cuantas veces ocurre consecutivamente en la
hilera (32). Otra hilera de la imagen, en una regin donde se encuentra el sujeto, requiere
informacin ms elaborada: por ejemplo, que hay 5 pixels blancos (valor 0), seguidos de 11
negros (valor 1), otrs 2 blancos, 4 negros, y 10 blancos (ver figura). An as, para esta hilera
de pixels ms compleja, slo hicieron falta 10 nmeros para representarla, en lugar de 32. En
otras palabras, estamos logrando presentar la misma informacin contenida en una lista
completa de los valores de intensidad de todos los pixels, utilizando solo un nmero reducido
de bits. Faltara aadir alguna informacin ulterior para decodificar la imagen (por ejemplo,
donde termina cada lnea), pero de todas manera el ahorro de memoria puede ser enorme.
Naturalmente, entre ms largas las carreras de nmeros repetidos, ms dramtica la
compresin; por otra parte, si las intensidades cambiaran muy a menudo a lo largo de la hilera
(lo que en un captulo anterior hemos denominado altas frecuencias espaciales; ver seccin
sobre sistemas lineales), entonces la ganancia podra ser marginal. En este ejemplo, la
totalidad de la informacin de la imagen original es retenida, pero otros esquemas de
compresin optan por lograr una mayor compresin sacrificando aspectos de importancia
relativamente secundaria, para que las prdidas no sean visualmente notorias; sin embargo,
para cierto tipo de anlisis cuantitativo podra no sea aceptable descartar informacin alguna,
as que sera preciso tener conocimiento del algoritmo a ser empleado.
Histograma de intensidad. Ahora consideremos un anlisis global de la imagen. Una primera
descripcin sencilla concierne como estn distribuidos los diferentes niveles de intensidad; esto
se obtiene creando un histograma de frecuencia: simplemente se tabula, para cada uno de los
valores de intensidad permitidos, el nmero de pixels en la imagen que tienen esa intensidad, y
se representa grficamente la informacin en un histograma que muestra en el eje X la escala
de valores de intensidad, y en el eje Y la frecuencia con la cual stos recurren. El panel de la
derecha de la Figura 58A ilustra un ejemplo en el
cual no hay pixels con intensidades ni menores que
50 ni mayores que 150, y que entre 50 y 150 la
distribucin es aproximadamente en forma de
campana (curva azul). Por supuesto, el rea bajo la
curva (la suma de #pixels en cada intensidad) debe
coincidir con l total de pixels.

De que nos sirve lo anterior? En primer lugar, nos
informa sobre el rango dinmico de la imagen, es
decir, cual porcin del abanico de niveles permitidos
se ha utilizado. Esto, a su vez, indica el contraste de
la imagen, que refleja la diferencia entre el nivel ms
oscuro y el ms claro de la imagen (lo
desparramado que es el histograma en el eje
horizontal). Tambin, el acumularse de unos conteos
muy altos en el lmite superior del histograma nos
puede sugerir que una o ms regiones de la imagen
probablemente han alcanzado el nivel de saturacin
(de la misma manera, la acumulacin de valores en
0 indica saturacin en el extremo opuesto).
Informacin sobre la distribucin de intensidades es
esencial para poder optimizar la exposicin: si la
distribucin de pixels tiene intensidades que se cie
principalmente al rango inferior los niveles posibles,
es deseable incrementar la duracin de la exposicin

Figura 7.5
108
o aumentar la iluminacin; viceversa, indicios de saturacin piden decrementar la exposicin. El
histograma es tambin una gua para procesar y transformar la imagen misma despus de la
adquisicin; para este fin hay que entender el uso de funciones de transferencia de la
intensidad, lo cual hace referencia simplemente a una regla para alterar la intensidad de los
pixels; esta regla es representable en una grfica en la cual la abscisa (x) indica los valores de
intensidad, y la ordenada (y) la manera como stos sern modificados. Si no se aplica cambio
alguno, la funcin de transferencia sera una simple lnea recta con una pendiente de 45, es
decir y = x, como se ilustra en el panel abajo a la derecha en la Figura 7.5A. Imaginemos que la
imagen tuviera una apariencia demasiado oscura; entonces quisiramos aclararla
incrementando la intensidad de todos los pixels por una cierta cantidad fija; la funcin de
transferencia sera simplemente la lnea y = x+c donde c es el incremento arbitrario de
intensidad que se aplica a toda la imagen: se tratara de desplazar hacia arriba toda la lnea
(panel gris de la Figura 7.5B). El efecto de la manipulacin se puede fcilmente apreciar en el
histograma de distribucin intensidades, el cual sufrira un desplazamiento horizontal hacia la
derecha. Si quisiramos en cambio aumentar el contraste, incrementaramos la pendiente de la
lnea que representa la funcin de transferencia (por supuesto, sujeto a la restriccin de que al
llegar al mnimo o mximo, tendra que permanecer en saturacin). Esto hara que pixels que
diferan poco en intensidad en la imagen original diferirn mucho ms en la imagen
transformada. Al aumentar el contraste, el histograma de intensidades se expandir
horizontalmente, ocupando una mayor porcin de la abscisa (Figura 7.5C). Tambin podramos
enfatizar selectivamente diferencias entre pixels de baja luminosidad, y de-enfatizar las
diferencias entre niveles muy altos de intensidad (por ejemplo, para revelar detalles de las
zonas ms oscuras de la imagen); viceversa, se pueden incrementar selectivamente las
diferencias entre pixels de altos niveles de luminosidad. Esta forma de expandir selectivamente
el contraste bien sea en el rango inferior o
superior de intensidades se conoce como
la correccin (gama), se logra
imponiendo una curvatura a la funcin de
transferencia. En el histograma de
intensidades, este tipo de transformacin
se revelara como una expansin
horizontal, pero solamente ceida bien
sea a la porcin de la izquierda o la de la
derecha de la distribucin. Los paneles A
y B de la Figura 7.6 ilustran la aplicacin
de una curvatura negativamente
acelerada. La foto en cuestin muestra el
embrin de un pez cebra, la cual contiene
zonas muy oscuras y prcticamente
indiferenciadas (por ejemplo, el ojo, visible a la derecha); al incrementar el valor de de 1.0 (i.e.
funcin de transferencia rectilnea) a 1.6, se enfatizan las diferencias entre pixels de poca
luminosidad, sin que se alteren los pixels ms claros. Viceversa, se podra exagerar
selectivamente las diferencias entre los pixels de alta intensidad utilizando una funcin de
curvatura positiva. La Figura 7.6C muestra una seccin histolgica de retina de pez cebra
adulto: aqu el problema es que no se distinguen bien las diferencias entre pixels muy claros,
pero al usar un valor de de 0.5 la pendiente de la funcin de transferencia se incrementa
especficamente para el rango intensidades ms altas, con el resultado de que se empiezan a
vislumbrar detalles en el tejido (Figura 7.6D).
Finalmente, se puede tambin establecer un umbral de intensidad por debajo del cual todo
pixel quedara reducido a cero: esto requiere que la funcin de transferencia sea plana con un
valor = 0 entre la intensidad mnima y un cierto nivel (el umbral), y creciera de all en adelante;

Figura 7.6
109
esta manipulacin puede ser til para suprimir el fondo de una imagen y hacer resaltar el
sujeto. Este caso es como eliminar la porcin del histograma de intensidades por debajo de
cierto valor de la abscisa. En todas estas manipulaciones, un constante monitoreo del
histograma de intensidad permite evaluar que las transformaciones produzcan una distribucin
deseable de intensidades, evitando la saturacin.

Filtros espaciales. As como es posible mejorar significativamente una imagen ya digitizada
alterando la intensidad de los diferentes pixels, tambin se puede reducir el ruido de la imagen
o, viceversa, mejorar la nitidez del enfoque; ambas modificaciones hubieran sido inconcebibles
antes del desarrollo de las imgenes digitales. En este tipo de manipulacin las reglas para
modificar intensidades tienen en cuenta no solamente el valor de cada pixel individual (como
era el caso de la funcin de transferencia para aplicar cambios de luminosidad, de contraste, o
de gama), sino tambin los valores de los pixels que lo rodean. Es decir, el nuevo valor de
intensidad de cada pixel de la imagen ser el resultado de alguna operacin en la cual se
combinan su valor original con los valores de otros pixels en el vecindario. La manera
especfica como se efecta esta combinacin determina el resultado. Por ejemplo, si se
cambiara cada pixel por el promedio de los valores de una matriz de 3x3 pixels (centrada en
l), inevitablemente se reduciran fluctuaciones locales de intensidad: dos pixels contiguos que
difirieran significativamente en sus respectivas intensidades quedaran mas similares por el
efecto de promediar; en cambio, pixels contiguos que de por s se asemejan no se veran
afectados (porque sus valores ya se parecen al promedio). Se tratara entonces de un filtro que
rechaza selectivamente transiciones locales abruptas: en jerga tcnica diramos que elimina
altas frecuencias espaciales, mientras deja pasar bajas frecuencias espaciales (el equivalente
espacial de lo que un filtro pasa-bajos hace en el dominio temporal). En la prctica, resulta ms
efectivo no llevar a cabo un simple promedio, sino un promedio ponderado que asigne
diferentes pesos a diferentes pixels, segn su distancia del pixel central.
La Figura 7.7 muestra tres ejemplos de matrices de coeficientes,
que se conocen como el kernel de un filtro y representan los
factores por los cuales se multiplicara el valor de intensidad de
cada pixel, antes de sumarlos y colocar el resultado en el pixel
central, reemplazando el valor original. El panel A muestra un
ejemplo en el cual se promedia una matriz de 3x3 (i.e. se suman
los 9 valores y se divide el resultado por 9; equivalentemente, se
multiplica primero cada valor por 1/9 y se hace la suma), mientras
que el panel B ilustra el caso de un promedio ponderado en una
matriz que atribuye mas peso al pixel central (notar que la suma
de los coeficientes es siempre =1, con lo cual no se est
alterando la luminosidad general de la imagen, slo sus
caractersticas espaciales). Los ejemplos anteriores tenderan a
desenfocar una imagen porque suavizan linderos ntidos y bien
demarcados (el precio que se paga por reducir ruido); a veces se
busca en cambio acentuar linderos para hacer resaltar objetos en
la imagen. Esto se puede lograr con un filtro que tienda a enfatizar transiciones locales
abruptas, y es simplemente el resultado de cambiar la matriz de coeficientes (es decir, el
kernel). Si, por ejemplo, el coeficiente central fuera positivo y los de los alrededores negativos
(Figura 7.7C), entonces todo pixel rodeado de otros de similar intensidad se vera reducido en
intensidad (porque a su valor se le restara un cantidad similar); esto de-enfatiza regiones de
intensidad ms o menos uniforme. En cambio, pixels de alta intensidad rodeados de otros de
baja intensidad (o viceversa) resaltarn su contraste. La aplicacin de un filtro de este tipo
permite enfocar una imagen borrosa; al mismo tiempo, su uso requiere cierto cuidado puesto
que se trata de un procesamiento que enfatiza transiciones locales de niveles de intensidad, y

Figura 7.7
110
si la imagen tiene de por s
un fondo poco uniforme, al
aplicrsele el filtro se
acentuara el ruido de fondo.
La Figura 7.8 ilustra los
efectos de filtros que
atenan frecuencias
espaciales bajas (i.e. pasa
altos) y frecuencias
espaciales altas,
respectivamente. La imagen es una micrografa electrnica de barrido de un fotorreceptor
aislado de la retina de un molusco.

Figura 7.8
111

8. El lser
En secciones anteriores se ha mencionado varias veces el lser como fuente de iluminacin
para algunas tcnicas de microscopa, tales como TIRF, microscopa multifotnica, y muchos
microscopios confocales. Este instrumento es de amplia utilizacin en diversos contextos, no
solamente la microscopa, lo cual justifica presentar una breve introduccin a sus principios de
funcionamiento. El nombre lser es la sigla de Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation (amplificacin de luz por emisin estimulada de radiacin). Su caracterstica
fundamental es que la luz que emite es coherente, es decir, se trata de ondas que tienen la
misma frecuencia (luz monocromtica) y adems la misma fase de oscilacin. La emisin
ocurre en un haz altamente colimado (rayos paralelos) que puede ser muy fino (o enfocarse
ulteriormente en un punto extremadamente
pequeo). Los mecanismos detallados de
generacin de la luz lser trascienden las
metas des estas notas; sin embargo, podemos
resumir brevemente sus caractersticas
fundamentales. En pocas palabras, una
poblacin de cierta clase de molculas es
mantenida activamente en un estado de
excitacin electrnica, al ser irradiada de una
manera continua (bombeada), tpicamente por
una fuente convencional de luz. Al decaer un
electrn a un orbital ms bajo, se emite un
fotn, el cual puede ser absorbido por otra
molcula del medio; sta, al encontrarse ya en
el estado excitado, por el principio de emisin
estimulada (fenmeno predicho por Einstein)
sufre una transicin de de-excitacin, con la
consiguiente emisin de luz. Pero, por
supuesto, el fotn incidente no es absorbido
(de lo contrario el proceso no estara acompaado por una disminucin de la energa de la
molcula - la de-excitacin -, sino un aumento), lo cual implica que se tienen ahora dos fotones;
estos pueden interactuar con otras molculas del medio que tambin se mantienen en estado
excitado, y el proceso se repite. Como tal, las emisiones espontneas se multiplican a travs de
emisiones estimuladas. El panel A de la Figura 8.1 ilustra el fenmeno. As que, mientras la
mayora de las molculas se mantengan en estado activado (inversin de la poblacin), la luz
se va amplificando. Este proceso ocurre en un compartimiento cerrado (la cavidad resonante)
que tiene a un lado un espejo y al otro un espejo parcialmente transparente, que deje pasar
una fraccin diminuta de la luz (Figura 8.1B). De esta manera, los fotones quedan rebotando de
un lado a otro, incrementando la probabilidad de inducir ms y ms emisiones estimuladas;
siendo la longitud de la cavidad resonante un mltiplo de la longitud de onda emitida, se forman
ondas estacionarias: las que no estn en fase se anulan, las que estn en fase se refuerzan.
De esta manera, solamente ondas coherentes salen por el lado semi-transparente. La longitud
de onda de la luz emitida por un lser depende de la naturaleza del material utilizado, por eso
se habla de lser de gas (por ejemplo, Helio-Nen que emite principalmente a las a longitudes
de onda de 543 y 633 nm las as llamadas lneas de emisin), lsers de estado slido (por
ejemplo, de rub, que emite a 694 y 628 nm), etc. Adems, diferentes lsers pueden emitir luz
de una manera continua (los as llamados continuous wave o CW), o bien lo hacen por pulsos
discretos cuya duracin puede llegar a ser extremadamente corta, hasta de fempto-segundos
(10
-15
s, i.e. milsimas de trillonsimas de segundo!).

Figura 8.1
112

Aplicaciones del lser: (ii) pinzas y trampas pticas
Todas las aplicaciones de principios pticos que hemos considerado hasta el momento
concernan la observacin de muestras o la caracterizacin de sus propiedades. Puede resultar
sorprendente enterarse de que la luz tambin se puede utilizarse para manipular
mecnicamente ciertos objetos diminutos, o para monitorear la fuerza mecnica que stos son
capaces de ejercer. Todo ello se desprende de un principio igualmente sorprendente, segn el
cual la radiacin electromagntica es capaz de ejercer una presin, la as llamada presin de
radiacin: sta es una fuerza que tiene la misma direccin que la de propagacin del rayo
luminoso. Lo extrao es que, vista desde el punto de vista de la teora corpuscular, la luz est
constituida por fotones y stos no tienen masa alguna, con lo cual uno se pregunta como
podran ejercer una fuerza mecnica. Sin embargo, resulta que un fotn tiene momento, (lo
cual evidentemente requiere apartarse de la definicin clsica P = mv); se pudo llegar a esta
conclusin desde las ecuaciones de Maxwell, tomando en cuenta el efecto del componente
magntico de la onda sobre una carga que est siendo afectada por ella, y de otras
consideraciones, en especial la teora de la relatividad. Ahora, si al interactuar con la materia el
momento de un fotn se ve alterado (bien sea debido a absorcin, que lo aniquilara del todo, o
bien a reflexin o refraccin, que le alteraran la direccin) entonces, por la tercera ley de
Newton (el principio de accin y reaccin) un cambio de momento igual y opuesto, es decir una
fuerza, se aplicara a la partcula que interactu con el fotn (F = ma = mdv/dt, i.e. dP/dt). Las
fuerzas en cuestin son diminutas, y requieren intensidades de luz muy altas para manifestarse
visiblemente, pero a niveles de partculas microscpicas pueden ser lo suficientemente
conspicuas para producir fenmenos observables. La posibilidad de empujar una partcula
muy pequea con un haz se luz fue verificada hace mucho tiempo, pero tambin se
documentaron fenmenos adicionales que abrieron un horizonte de posibilidades
insospechadas: una de las observaciones seminales fue constatar que si el rayo tena
intensidad mayor en el centro que en la periferia (como ocurre en el modo ms comn de
funcionamiento de una lser, el as llamado TEM
00
, en el cual el rayo tiene el perfil de una
campana de Gauss), entonces la partcula tenda a ubicarse espontneamente justo en el eje
del haz, mientras que al apagar la luz
inmediatamente reanudaba su movimiento
Browniano lateral. Estos fenmenos pudieron
explicarse examinando los cambios en la
direccin de diferentes rayos refractados por la
partcula (y por lo tanto los cambios en sus
respectivos momentos y la fuerza resultante final),
lo cual llev al invento de trampas pticas o
pinzas pticas (optical tweezers), que sirven
para agarrar y manipular una partcula
aproximadamente esfrica (o por lo menos
convexa), siempre y cuando sta tenga un ndice
de refraccin mayor que el del entorno.
Consideremos un rayo altamente enfocado en un
punto (un disco de Airy, en realidad) por medio de
un objetivo de microscopio de gran apertura
numrica, y miremos lo que sucedera a una
partcula de alto ndice de refraccin que entrara
al cono de luz (Figura 8.2A). Para simplificar el
anlisis, pensemos solamente en un rayo central y
dos rayos bien perifricos (el anlisis completo
requerira hacer el balance de todos los rayos que
Figura 8.2
113
inciden sobre la partcula). El rayo central, al encontrar una interfase a 90 grados no alterara su
direccin sino solamente se enlentecera (por el mayor ndice de refraccin); el cambio de
momento implicara una fuerza igual y opuesta que empujara la partcula hacia adelante; esto
representa una manifestacin de la presin de radiacin mencionada anteriormente. Pero los
rayos perifricos tambin incidiran sobre la superficie de la partcula con un ngulo cercano a
la normal, y sufriran poca refraccin (el caso lmite, ilustrado en la figura, es que el centro de la
partcula esfrica coincidiera con el foco, en cuyo caso no habr ninguna refraccin porque
todos los ngulos de incidencia sern de 90 grados). La presin de radiacin de cada rayo se
puede descomponer, por la ley del paralelogramo, en un componente vertical que empuja la
partcula, y otro horizontal hacia el eje ptico, el cual se anula entre diferente rayos, por
simetra (flechas rojas). La fuerza neta resultante tender a alejar la partcula. Si sta llega
poco mas lejos del punto focal, la situacin cambia: mientras el rayo central sigue empujando,
un rayo perifrico encontrar la interfase con un ngulo muy oblicuo y ser fuertemente
refractato, como muestra la Figura 8.2B; nuevamente, la fuerza sobre la partcula debida a ese
cambio en momento (flecha verde, igual y opuesta al cambio de momento representado por la
flecha negra) se puede descomponer en un componente transversal y otro alineado con eje
ptico pero esta vez apuntando hacia el objetivo (flecha roja vertical). Lo mismo ocurrira con un
rayo simtricamente ubicado al otro lado de la partcula. Es decir, mientras la presin de
radiacin del rayo central empuja la partcula, los rayos perifricos ahora la jalan. En otras
palabras, existir, a lo largo del eje ptico una distribucin de fuerzas en direccin opuestas:
una en la misma direccin que la luz, y la otra que puede oponrsele; sta ltima cobra ms
fuerza cerca del foco. Si en algn punto a lo largo del eje las dos tendencias se equiparan, una
partcula quedar atrapada en ese sitio. Por consiguiente, una partcula que entrara al cono de
luz se desplazara hasta el punto en el cual las fuerzas en direcciones opuestas se balancean,
y all permanecera en estado estacionario; si se moviera el rayo, la partcula lo seguir. Con
esto se ha logrado, por ejemplo, inmovilizar bacterias, o separarlas, y hasta manipular
espacialmente estructuras sub-celulares como mitocondrias. Otro campo de aplicacin ha sido
el estudio de la interaccin de motores moleculares, como miosinas o kinesinas, con filamentos
de actina o microtbulos inmovilizados sobre una lmina de vidrio. Para observar la funcin del
motor molecular, ste se acopla a una bolita (por ejemplo, una micro-esfera de sefarosa) la
cual fungir de carga que ser transportada por el motor al deslizarse por el filamento-
sustrato, y, siendo de tamao suficiente, podr visualizarse por un microscopio ptico de alta
resolucin. Tradicionalmente, experimentos de este tipo han sido muy dispendiosos porque en
una solucin diluida la probabilidad de interaccin entre los dos partners es muy baja, y el
experimentador debe esperar interminablemente para que ocurra una asociacin y empiece el
movimiento. Con pinzas pticas, en cambio, se puede agarrar un complejo miosina/sefarosa, y
fsicamente colocarlo sobre la actina para dar inicio al experimento, sin demora alguna. Otra
rea muy fructfera se ha desarrollado a partir de la nocin de que una pinza ptica puede
oponerse al movimiento de un objeto microscpico, por ejemplo un cilio. Si se logra anular por
completo su movimiento, quiere decir que la fuerza de la pinza ptica, la cual depende de la
intensidad del haz de luz (la cual est bajo el control del experimentador), es exactamente igual
y opuesta a la del sujeto; por lo tanto, es posible cuantificar sta ltima (hasta en trillonsimas
de Newton!). De esta manera se ha podido determinar la fuerza ejercida por un flagelo de una
bacteria, o inclusive la de una molcula de polimerasa mientras se desplaza a lo largo de la
hebra de ADN que le sirve de templete, generando un RNA mensajero!

Aplicaciones del lser: (iii) ciruga y micro-ciruga
Otro de los usos del lser en biomedicina es para ciruga: entre los ms utilizados se
encuentran el lser de CO
2
cuya luz tiene una longitud de onda en el infrarrojo profundo (10
m) y es absorbida por el agua contenida en los tejidos, con lo cual los vaporiza (debido al
114
drstico aumento de temperatura), cauterizando y limitando hemorragias; el lser de Argon
emite luz a longitudes de onda visible (e.g. 488 nm y 514 nm), que es fuertemente absorbida
por la hemoglobina, y tambin cauteriza el tejido produciendo rpida coagulacin de las
sangre. Aplicaciones similares se han desarrollado a escalas celulares, en las cuales un rayo
lser altamente enfocado en un punto diminuto por medio del objetivo de un microscopio se
utiliza para irradiar una clula especfica en un tejido, destruyndola. En algunas instancias, se
prefiere micro-inyectar primero a la clula-blanco con algn colorante que absorba fuertemente
en una banda especfica del espectro de luz, y luego irradiarla con un lser de la longitud de
onda apropiada para ese colorante, con lo cual se maximiza la selectividad y la efectividad de
la ablacin ptica, evitando daos a tejidos limtrofes. Acercamientos de este tipo han
permitido, entre otras cosas, establecer el rol de clulas especficas en un circuito neuronal.

115

9. ptica Fisiolgica
En esta seccin aplicaremos los principios de la ptica al anlisis del ojo: la formacin de
imgenes, la resolucin, y, en algunos casos, la presencia de mecanismos bsicos para
controlar el enfoque y la cantidad de luz que reciben las clulas fotosensibles. Finalmente,
tambin se elucidarn las bases de la visin cromtica, i.e. la capacidad de percibir colores.
El ojo de los vertebrados
El sistema visual de la gran mayora de los organismos utiliza un aparato ptico refractivo para
formar una imagen del mundo externo (solo se conocen pocos ojos que utilicen un espejo). El
propsito es enfocar la luz de cada punto de un plano focal del mundo externo sobre el sensor,
la retina, que est formada por de clulas fotosensibles. Se conocen dos diseos
fundamentales de ojo en la naturaleza. Uno es el as
llamado ojo simple por estar constituido por un solo
sistema diptrico; ojos simples se encuentran en todos los
vertebrados, y en varios invertebrados como los
cefalpodos (e.g. calamares y pulpos). Otro diseo,
llamado ojo compuesto es comn entre la mayora de los
invertebrados, y consiste en una matriz de elementos
pticos independientes, cada uno con su propio aparato
para enfocar la luz. A su vez, los ojos compuestos admiten
variantes, cuyas caractersticas difieren de una manera
fundamental. En esta discusin son concentraremos en el
ojo simple de los vertebrados, en el cual el sensor de luz
est constituido por un mosaico de clulas altamente
especializadas, conocidas como conos y bastones; los bastones son ms sensibles y se
distribuyen en la mayora de la retina perifrica, mientras que los conos se concentran el la
pequea regin central conocida como la fvea (Figura 9.1; el diagrama representa los conos y
bastones con su segmento externo foto-sensible apuntando hacia la direccin de llegada de la
luz: en realidad en los vertebrados la retina es invertida, y la luz ha de atravesar todas las
capas de la retina hasta llegar a los fotorreceptores, los cuales apuntan hacia afuera!).
Dos elementos pticos cumplen la funcin de proyectar la imagen de los objetos del espacio
visual sobre la retina: (i) la crnea, que forma la primera interfase, i.e. la superficie externa de la
porcin frontal del ojo (ii) el lente o cristalino, ubicado ms internamente. A pesar de la
curvatura y espesor del cristalino, es la crnea que desempea el rol principal como elemento
refractivo, en parte debido al cambio mucho ms abrupto de ndice de refraccin en la interfase
aire-crnea, comparado con la interfase entre los fludos intra-oculares (humor acuoso) y el
cristalino: del poder total de 59 dioptras del ojo humano, 43 se deben a la crnea. Por
supuesto, si el sujeto se sumerge en agua, el ndice de refraccin cambia menos en la interfase
con la crnea, y el poder diptrico de sta ltima disminuye drsticamente, resultando
insuficiente para enfocar una imagen (los pjaros pescadores poseen un parpado especializado
que es transparente y refractivo, y baja cuando el animal se zambulle, permitindole mantener
la capacidad de enfocar debajo del agua).

Acomodacin
En el ojo, la distancia entre el complejo crnea-lente (ms especficamente, el punto nodal) y la
retina es fija (aproximadamente 17 mm), pero los objetos en el mundo externo se encuentran a
diferentes distancias. Para lograr enfocarlos, el ojo cambia el poder diptrico del lente: para
enfocar objetos lejanos, hace falta menos poder refractivo, y el lente es mantenido con una

Figura 9.1
116
menor curvatura (i.e. mayor radio de curvatura) por la tensin pasiva ejercida por fibras
pegadas radialmente desde la regin ecuatorial del lente, que lo estiran (Figura 9.2A). Sin
embargo, para enfocar objetos cercanos se contrae un anillo muscular alrededor del lente
(msculo ciliar), el cual reduce la tensin de las fibras,
y permite que el lente se relaje, asumiendo, por
elasticidad, una forma ms esfrica (mayor
curvaturamayor poder diptrico; Figura 9.2B). Estos
ajustes en el poder diptrico del ojo se conocen como
el proceso de acomodacin. As que el lente, cuya
contribucin al poder diptrico total del ojo es
relativamente modesta, tiene la funcin esencial de
aportar los ajustes que hacen falta para poder enfocar
objetos cercanos y lejanos. La elasticidad del lente se
pierde con la edad, reduciendo por lo tanto la
capacidad de enfocar objetos cercanos. La
transparencia del lente tambin se puede deteriorar
(cataratas) lo cual puede requerir una intervencin
quirrgica. Las consecuencias de las tcnicas
inicialmente empleadas, que simplemente
contemplaban la remocin del lente, eran (i) reduccin
del poder diptrico del ojo, y por lo tanto necesidad de
compensarlo con anteojos (ii) prdida de la acomodacin (iii) sensibilidad a luz ultravioleta, ya
que estos rayos normalmente son filtrados por el lente, que les impide llegar a la retina. Hoy en
da, el cristalino se remplaza con un lente artificial, para obviar en gran medida estas
deficiencias. Cabe aclarar que ste no es el nico mecanismo por medio del cual se puede
lograr acomodacin. Los ojos de muchos peces utilizan en cambio la estrategia de variar la
posicin del cristalino, acercndolo o alejndolo de la retina. El efecto es el mismo: mantener la
proyeccin del objeto enfocada sobre la matriz retinal, compensando por la mayor o menor
distancia a la cual se encuentre el objeto.

Resolucin ptica del ojo
Limitaciones debidas al sistema diptrico. Para examinar la capacidad del ojo de discernir
detalles finos es conveniente utilizar las dimensiones angulares de un objeto, en lugar de las
dimensiones lineares (es decir, el ngulo que subtiende el objeto que uno mira), ya que en
ltima instancia lo que interesa no es el tamao absoluto del objeto, sino que tan grande ser
su imagen proyectada en la retina: por ejemplo, un objeto grande pero muy lejano podra tener
una imagen retinal tan pequea o ms que la de un objeto ms pequeo pero mucho ms
cercano al observador. La unidad de medida angular es el grado (indicado por el smbolo que
sigue a un nmero); es a menudo necesario referirse a fracciones pequeas de un grado, y se
utiliza el minuto de arco (), que representa 1/60 de grado, y el segundo de arco () que a su vez
representa 1/60 de minuto (es decir, 1/3600 de grado). Para convertir distancias y tamaos a
grados se hace uso de identidades bsicas de trigonometra, que se pueden fcilmente
aproximar para ngulos pequeos (como suele ser el caso cuando se examina la resolucin del
ojo). Por ejemplo, un objeto de 5 cm de tamao ubicado a 2 m en frente del ojo tendra un
tamao angular de aproximadamente 5/200 = 0.025 radianes, es decir 1.43 (1 radian = 57.3);
adems, considerando que la distancia entre el centro del complejo crnea/lente y la retina es
de 17 mm, podemos calcular que proyectara una imagen en la retina de 0.025*17 mm =
0.425 mm. En cuanto a propiedades estrictamente pticas (asumiendo que el ojo no presente
defectos de visin), el poder de resolucin del ojo est determinado por (i) su apertura
numrica (dependiente principalmente de la pupila) (ii) aberracin esfrica, y (iii) aberracin
cromtica. Estas resultan en que un objeto puntual formara como imagen un disco (el disco de

Figura 9.2
117
Airy, ulteriormente deteriorado por las aberraciones), y para poder percibir puntos como
distintos, su separacin angular deber ser mayor que las dimensiones del disco de Airy.

Limitaciones pticas debidas al mosaico retinal. La deteccin de luz por la retina ocurre por la
estimulacin de clulas fotosensibles individuales, los conos y bastones. Por lo tanto, para
estimar la capacidad de resolucin del ojo no es suficiente considerar las propiedades pticas
de la crnea, el cristalino y la pupila (que establecen su lmite
de difraccin), sino tambin el mosaico retinal. Al igual que
una cmara digital, una imagen no tendr buena resolucin si
el sensor posee un nmero limitado de pixels, ya que si las
proyecciones de dos puntos del espacio visual caen sobre el
mismo pixel, su deteccin individual es imposible, porque sus
respectivas imgenes no activan diferentes elementos
fotosensibles. Por lo tanto en el ojo la utilizacin plena de las
capacidades de resolucin de la crnea y el lente solo se
realizarn si el dimetro de los fotorreceptores es comparable
al disco de Airy, permitiendo que la imagen de dos puntos
resueltos pticamente caiga sobre fotorreceptores distintos
(ms precisamente, deberan estimular dos fotorreceptores
separados, que tuvieran de por medio otro fotorreceptor, para que hubiera dos sitios no
contiguos de estimulacin). En el ojo el disco de Airy vara segn el grado de apertura de la
pupila (que puede contraerse o dilatarse entre 1.5 y 6 mm, lo cual afecta la apertura numrica;
Figura 9.3). Desde el punto de vista puramente ptico, la separacin de dos puntos en el
espacio visual para que no se superpongan sus respectivos discos de Airy sera del orden de
2.3 a 0.6 minutos de arco. Teniendo en cuenta que el dimetro aproximado de un fotorreceptor
en la fvea (la zona central de la retina donde se alcanza la mxima resolucin) es de unos 30
segundos de arco (unos 2.4 m de dimetro), quiere decir que an a la mxima dilatacin
pupilar bajo condiciones normales (i.e. sin uso de frmacos como la atropina, comnmente
utilizada en exmenes oftalmolgicos), la matriz retinal es suficientemente fina para no
deteriorar la capacidad de resolucin del ojo: la evolucin ha optimizado las dimensiones de los
elementos fotosensibles para que fueran equiparables al lmite de difraccin.

A este propsito es preciso aclarar algo importante que permite al ojo mantener buena
sensibilidad y buena resolucin espacial; estas
consideraciones nos brindan la oportunidad de ver un
par de leyes bsicas de ptica en accin en un
sistema biolgico. En primera instancia, se debe
optimizar la captura de fotones. La ley de Beer-
Lambert nos dice que la probabilidad de que stos
pasen sin ser absorbidos decae exponencialmente con
la longitud de la trayectoria por el medio absorbente, y
que la constante espacial de dicha funcin
exponencial depende de la concentracin de las
molculas que absorben luz y de su coeficiente de
extincin. La naturaleza optimiza la situacin (i)
utilizando molculas cuyo coeficiente de extincin es
muy alto (40,000, como se ha mencionado
previamente), (ii) expresndolas masivamente (del
rden de 100 millones de ellas por clula), y (iii)
haciendo que el segmento foto-sensible sea una
estructura delgada y alargada, de tal manera que el

Figura 9.3

Figura 9.4
118
recorrido de los fotones sea largo, favoreciendo su absorcin. Este ltimo punto, sin embargo,
conlleva un problema: el aparato diptrico enfoca la imagen de los objetos en un cierto plano, y
si la estructura foto-sensible forma una capa espesa, la luz un puede estar enfocada sino a un
nivel restringido del fotorreceptor; como tal, se esperara que por fuera de ese plano focal la luz
se desparramara, invadiendo otros fotorreceptores y perdiendo resolucin. Sin embargo el
ndice de refraccin de los fotorreceptores es mayor que el de los intersticios entre ellos. Por lo
tanto, si se enfoca la luz sobre el extremo del segmento fotosensible, ste gua la luz
funcionando como una fibra ptica (por el principio de reflexin total interna), evitando que
llegue a fotorreceptores vecinos. De esta manera se preserva la focalidad. La Figura 9.4 ilustra
el proceso: el cono de luz se enfoca al entrar a la clula (en conos y bastones de vertebrados la
direccin de entrada sera por el soma, como se ha mencionado) , y rebota internamente
mantenindose en su interior en lugar de escapar por los lados y llegar a estimular
fotorreceptores vecinos (lneas azules).

Defectos de visin
En muchos individuos el poder diptrico de la cornea y el cristalino puede ser inadecuado para
formar una imagen perfectamente enfocada sobre la capa de los fotorreceptores en la retina.
Por ejemplo, la imagen de un punto podra formarse a una distancia demasiado corta detrs del
lente, i.e. adelante de la retina. En este caso los rayos se cruzaran y volveran a divergir, y al
llegar a la retina proyectaran un
disco difuso. Este problema, que
se denomina miopa (Figura 9.5A),
implica que an cuando el
msculo ciliar est relajado para
mirar objetos lejanos (mnima
curvatura del lente), la refraccin
es excesiva; se puede corregir
interponiendo, adelante del ojo, un
lente divergente cuyo propsito es
contrarrestar el excesivo poder
diptrico del ojo (Figura 9.5B).
Alternativamente, puede suceder
que el poder diptrico del ojo es
insuficiente, especialmente
cuando se intenta enfocar un
objeto cercano, y los rayos que
emanan de un punto en el espacio visual no convergen lo suficientemente rpido y por lo tanto
llegan a la retina cuando todava estn distribuidos en un disco. Este problema se denomina
hipermetropa y se corrige aadiendo un lente convergente que aumente el poder refractivo
(Figura 9.5C y D). Notar que en ambos casos los lentes de correccin se colocan en
proximidad de la crnea, a una distancia menor que su distancia focal. Como tal, no alcanzan a
formar una imagen real al frente del ojo (la cual sera invertida!); simplemente, su poder
refractivo se aade al del ojo, modificndolo para corregir el punto de enfoque sobre la retina
(cuando se combinan lentes de esta manera, su poder diptrico total es simplemente la suma
de las dioptras de cada uno de los elementos).

Visin cromtica
Como ultimo tema relacionado con la funcin visual, vamos a considerar brevemente como se
logra discernir colores. El color percibido de una luz est relacionado con su longitud de onda.
Sin embargo los dos trminos no son equivalentes: la longitud de onda es un parmetro fsico

Figura 9.5
119
de la radiacin electromagntica, el color es un fenmeno perceptual complejo, que resulta del
procesamiento de la luz por el sistema nervioso. El primer concepto a esclarecer es que las
clulas fotosensibles son incapaces de discernir la longitud de onda per se: ya sabemos que
para detectar un fotn ste debe ser absorbido por
alguna molcula, a la cual cede su energa. En la
molcula receptora esta energa se traduce en
alteraciones de su vibracin, rotacin, ocupacin de
orbitales por los electrones, etc. Pero la longitud de la
onda luminosa incidente no queda registrada. Por lo
tanto, en un fotorreceptor el tamao de la respuesta
producida por un estimulo luminoso es solamente
funcin del numero de rodopsinas isomerizadas, lo
que se conoce como el Principio de Rushton. Como
extraer entonces informacin sobre las propiedades
cromticas de la luz? La estrategia se basa en el
hecho de que las molculas tienden a absorber luz
selectivamente, segn la longitud de onda (es decir, el
hecho de que en general el coeficiente de extincin, ,
depende de ). Supongamos que todos los
fotorreceptores contuvieran la misma clase de
rodopsina, con el mismo espectro de absorcin,
representado por el panel central de la Figura 9.6. Uno
podra pensar que el solo hecho de que el fotopigmento absorbe algunas longitudes de onda
mejor que otras de por si confiere a la clula capacidades de discriminacin cromtica: por
ejemplo, supongamos que fotones de 500 nm (lo que los humanos llamamos verde) tuvieran
dos veces mayor probabilidad ser absorbidos que fotones de 600 nm (lo que nosotros
llamamos rojo). Si un destello e luz contuviera un cierto numero de fotones (representado por
la longitud de las flechas en el panel superior de la Figura 68), habra entonces dos veces mas
rodopsinas isomerizadas si la luz fuera verde que si fuera roja, y por lo tanto la respuesta
elctrica de la clula seria mayor con luz verde (panel inferior). Uno estara tentado de concluir
que la clula discrimina el verde del rojo. Sin embargo, eso es una falacia: si comparramos la
misma luz verde con una luz roja dos veces ms intensa (el doble de fotones), los dos destellos
resultaran en el mismo nmero de isomerizaciones, ya que para la luz roja la menor
probabilidad de absorcin ser compensada por la mayor abundancia fotones (Figura 9.7). Por
el principio de Rushton, las dos respuestas fisiolgicas sern entonces iguales, y ciertamente
uno no atribuira la capacidad de discernir colores a un organismo que confundiera una luz
verde tenue con una roja brillante! Podemos superar esta dificultad si en lugar de un solo tipo
de fotopigmento tuviramos dos o mas, segregados en clulas distintas. Por ejemplo,
supongamos que unas clulas contuvieran el pigmento que absorbe preferencialmente a 500
nm (llammoslas clulas V) y otras un pigmento que absorbiera preferencialmente a 600 nm
(clulas R; Figura 9.8). En este caso, una luz verde estimulara fuertemente las clulas V y
dbilmente las clulas R. La luz roja hara lo contrario. Por consiguiente el patrn de activacin
de las dos poblaciones de clulas seria diferente con las dos longitudes de onda; al variar las

Figura 9.6
120
intensidades, cambiaran las amplitudes de las
respuestas, por cierto, pero no se alterara esa
respuesta diferencial: una luz de 500 nm, cualquiera que
fuera su intensidad, siempre activara mas fuertemente
clulas V que clulas R, y viceversa con una luz de 600
nm .
Si alguna estructura del sistema nervioso pudiera
comparar el nivel de actividad proveniente de las dos
poblaciones de clulas, podra determinar que los dos
estmulos son cromticamente diferentes, y seria
entonces lcito concluir que el sujeto distingue rojo de
verde. Aun as, el sistema de discriminacin cromtica
que hemos creado est lejos de ser perfecto, y un sujeto
fcilmente confundira otros estmulos que desde el
punto de vista fsico son muy diferentes. Por ejemplo,
podramos utilizar una luz de 550 nm (amarilla), la cual
seria absorbida similarmente tanto por clulas V como
por clulas R (aunque no de una manera ptima para ninguno de los dos fotopigmentos), y las
dos clases de fotorreceptores generaran por lo tanto respuestas similares (Figura 9.9). Ahora
podramos presentar otro estimulo luminoso, compuesto por la superposicin de una luz que
solo fuera absorbida por las clulas V, y otra que solo fuera absorbida por las clulas R. Esto
podra lograrse con un bombillo azul prendido simultneamente con otro rojo profundo. El
resultado seria, de nuevo, una igual activacin de las dos clases de clulas: el sujeto percibira
lo mismo que la luz amarilla! (Figura 9.10). Es decir, con dos poblaciones de fotorreceptores
ciertamente distinguiramos luces monocromticas, pero podramos ser incapaces de
discriminar algunas mezclas de dos longitudes de onda. Si en lugar de dos tuviramos tres
clases de clulas, ese problema seria resuelto, pero mezclas de tres o ms colores todava nos
confundiran. Es decir, el hecho de que realmente no medimos la longitud de onda nos obliga a
tratar de inferir las caractersticas cromticas de un estimulo determinando sus efectos sobre
diferentes clases de fotorreceptores, cada uno con una cierta sensibilidad preferencial en
cuanto a longitud de onda.
Entre mas clases de clulas con fotopigmentos diferentes, mas refinados nuestros juicios, pero
siempre estaremos sujetos a la posibilidad de confundir mezclas complejas de longitudes de
onda. Es preciso recalcar que la mayora de estmulos luminosos en nuestro entorno estn
constituidos por mezclas de longitudes de onda: la luz
monocromtica es realmente una excepcin. El sistema
visual humano cromtico consiste de tres tipos de
fotorreceptores, preferencialmente sensibles a rojo,
verde y azul, respectivamente (Figura 9.11), y nos
permite ver y discriminar cierta gama de colores; pero
hay muchos que percibimos como iguales, sin serlo.
Figura 9.8
Figura 9.9

Figura 9.7
121
Organismos con ms clases de fotorreceptores
selectivos a diferentes longitudes de onda (desde
pjaros a crustceos) tienen capacidades de visin
cromtica superiores a las nuestras, y distinguen colores
que a nuestros ojos son idnticos. Notar que los
sensores con diferentes caractersticas cromticas se
pueden generar de distintas maneras. Una es la
presencia de fotopigmentos que varen en su absorcin
espectral, como el caso que hemos examinado (y que es
representativo, entre otros, de la visin cromtica en los
mamferos). Pero el mismo resultado se puede obtener
con sensores de idnticas caractersticas, ante los
cuales se interpongan filtros cromticos (i.e. filtros que
dejen pasar selectivamente diferentes longitudes de
onda). Al acto prctico, la cantidad de luz que llegara a
un sensor o a otro depender de su longitud de onda y
de la transmitancia del filtro en esa banda. Las aves
implementan visin cromtica de esta manera, con
gotas pigmentadas de diferentes maneras, las
cuales se interponen en el camino de la luz, antes de
que llegue al fotopigmento.

Cabe mencionar que no solamente la capacidad de
discernir colores dentro de una cierta banda del
espectro es diferente para diferentes organismos,
sino que la misma franja de luz que llamamos
visible no es la misma para todos: por ejemplo, las
abejas (y muchas ms especies) pueden ver luz
ultravioleta, los humanos no. El sol irradia cierta
cantidad de luz en la banda UV, por consiguiente,
objetos que difieren en su absorbancia de luz ultravioleta podrn
verse diferentes si el sujeto percibe UV, pero lucirn iguales a un
sujeto que no tenga esa capacidad. De hecho, las abejas son muy
selectivas al elegir flores hacia las cuales se dirigen para extraer
nctar, y se basan en parte en diferentes patrones de dibujos en los
ptalos que solo se distinguen pudiendo ver UV; para un
observador humano esas flores luciran iguales. La Figura 9.12
ilustra este punto: se tom una fotografa de una flor blanca (segn
la ve un humano, por lo menos), y luego se repiti la foto
registrando las diferencias de la luz reflejada en la banda UV (panel
inferior): en este caso, aparecen patrones que son completamente
invisibles para el observador humano.

Habiendo establecido que la percepcin del color es un reflejo del
grado relativo de activacin de diferentes poblaciones de
fotorreceptores, es posible definir lo que se llama el espacio
cromtico, un dominio que incluye todos los posibles colores que
un individuo puede percibir. Para construirlo, consideremos el caso
ms sencillo posible, el de un organismo que posee solamente dos
clases de fotorreceptores con diferente sensibilidad espectral para
su visin cromtica (que llamaremos X y Y), como ilustra la

Figura 9.11
Figura 9.10

Figura 9.12
122
Figura 9.13A. Pensemos en los efectos que ejercera
un estmulo luminoso monocromtico cuya
intensidad (definida como nmero de fotones en un
destello) fuera constante, pero cuya longitud de onda
se pudiera variar de una manera continua. Las lneas
punteadas indican los estmulos de las longitudes de
onda seleccionadas para llevar a cabo una serie de
mediciones; para cada estmulo, el valor de la
ordenada donde la lnea vertical intercepta las dos
curvas establece el nivel de activacin producido en
los fotorreceptores X y Y, respectivamente. En el
panel B de la misma figura se grafica el grado de
activacin de los dos tipos de fotorreceptores ante la
aplicacin de los diferentes estmulos: para cada luz,
el valor a lo largo de la abscisa indica la magnitud de
la respuesta de los fotorreceptores X, la ordenada la
de los fotorreceptores Y, con lo cual la respuesta
queda definida por la posicin de un punto en el
plano x-y. Si consideremos el conjunto seleccionado
de luces monocromticas, observamos que la de
420 nm activa solamente fotorreceptores X, y por lo
tanto representaremos sus efectos como un punto
ubicado sobre la abscisa. Pero a medida que incrementa, habr no solamente un aumento en
la respuesta de X (al acercarnos a su pico de respuesta), sino tambin progresivamente ms
activacin de fotorreceptores Y, y por lo tanto crecer la coordenada vertical del punto
correspondiente en la grfica del panel B; luego, la coordenada X volver a bajar, cuando se
pase su pico de respuesta mxima, mientras la Y sigue creciendo. Barriendo las diferentes
longitudes de onda, se dibuja la curva ilustrada en el diagrama.
Ahora consideremos el caso ms general de luces que no sean monocromticas; un estmulo
luminoso puede consistir en una onda electromagntica compleja, pero sabemos que en ltima
instancia se puede descomponer en la suma de componentes sinusoidales simples (de nuevo,
el teorema de Fourier). Pensemos primero en la situacin simple que contempla solamente dos
componentes; puesto que cada uno de ellos es un color monocromtico, sus respectivas
respuestas estn representadas como algn punto a lo largo de la curva. El efecto conjunto
ser entonces una combinacin lineal de las dos respuestas individuales. Si nos ceimos a
estmulos compuestos del mismo nmero total de fotones (como se ha fijado para las luces
monocromticas), es fcil demostrar que la ubicacin de ese punto en el espacio x-y
necesariamente ser en algn sitio a lo largo de la recta que une los puntos que representan
las respuestas a los componentes individuales. La ubicacin exacta, es decir que tan cerca del
uno o del otro, reflejar la intensidad relativa de las dos luces monocromticas en la mezcla.
Extendiendo este razonamiento y permitiendo superposiciones de muchos componentes
monocromticos se concluye que cada percepcin de color, resultante bien sea de luces
monocromticas o de mezclas complejas, est representada por un punto particular en el
dominio del plano x-y encerrado por la curva de las respuestas monocromticas.
Hay un conjunto de puntos en el dominio de cromaticidad, que ocupa una posicin especial: se
trata de la recta y=x, que define los estmulos que evocan una respuesta de igual magnitud en
las dos clases de fotorreceptores (la lnea gris en la figura). Estos son estmulos que no se
percibiran como de ningn color particular, es decir, lo que, dependiendo de la magnitud de la
respuesta llamaramos blanco o gris. Evidentemente, hay luces monocromticas que al
combinarlas de cierta manera pueden producir ese efecto (i.e. aquellos puntos en la curva
Figura 9.13
123
perimetral que al unirlos por una recta cruzan la lnea diagonal); para otras combinaciones eso
no ocurre.
En un organismo con un sistema de visin cromtica ms complejo (ms clases de
fotorreceptores espectralmente diferentes) el dominio de cromaticidad se torna ms complicado
y requiere ms dimensiones para poderse representar grficamente (y lo mismo para las
mezclas de estmulos que se perciben como acromticos). Adems, se puede relajar la
restriccin de que la intensidad de los estmulos es la misma, con lo cual se complica
ulteriormente el espacio de cromaticidad. Pero de todas formas el resultado es una
representacin geomtrica de todas las percepciones de color posibles para un sujeto, y de la
forma como stas pueden engendrarse con diferentes combinaciones de longitud de onda.

Visin de luz polarizada
Al introducir la luz como onda electromagntica, se habl de los parmetros principales que la
caracterizan, es decir, su amplitud y su frecuencia (o su longitud de onda), y en la seccin
anterior se esboz como las clulas fotosensibles del ojo pueden extraer la informacin
pertinente. Pero tambin se haba mencionado que la luz puede ser polarizada, en otras
palabras, la oscilacin del vector elctrico podra no ocurrir en todas las direcciones en el plano
ortogonal al eje de propagacin, sino ceirse, por ejemplo, a una sola lnea (en cuyo caso
tendramos luz linealmente polarizada). En esta seccin examinaremos la posibilidad de que un
detector biolgico pueda discriminar luz polarizada y discernir su orientacin. Para eso,
necesitamos refinar un poco nuestro entendimiento acerca de las condiciones que permiten
que el fotopigmento absorba luz. Hasta ahora, sencillamente se dijo que el cromforo (en la
mayora de los casos el aldehdo de vitamina A, llamado 11-cis-retinal) es responsable de la
absorcin de luz visible, pero hay que ser ms especficos: realmente la interaccin entre
fotones y materia concierne elementos particulares de sta, los electrones. Esta nocin es
intuitivamente obvia ya que la luz consiste en una oscilacin electromagntica la cual por lo
tanto ha de actuar sobre alguna partcula elctricamente cargada. Los electrones representan
justamente las cargas expuestas en la materia (mientras que los protones en el ncleo estn
resguardados por la nube electrnica que los
rodea). En el cromforo, la interaccin con el
fotn a ser absorbido concierne
especficamente electrones que se distribuyen
a lo largo de la cadena de carbonos que est
pegada del anillo (as llamado -ionn), la cual
est constituida por un alternarse de enlaces
covalentes dobles y sencillos. El punto crucial
es el siguiente: la luz tendr propensin a ser
absorbida en la medida en que la oscilacin del
campo electromagntico est alineada en una
direccin paralela a un cierto vector que
denominamos el momento dipolo de transicin
, el cual en el caso del cromforo tiene aproximadamente la misma orientacin que esta cadena
de enlaces. Ahora consideremos ms globalmente la disposicin en el espacio de dicho
momento dipolo de transicin en una molcula de fotopigmento visual. Ya se dijo que la
rodopsina es una protena constituida por siete -hlices que cruzan la membrana (esta parte
protica se conoce como la opsina) y el cromforo se encuentra enlazado a ella dentro de un
bolsillo en la regin ms hidrofbica (ver Figura 9.14). La cola de carbonos del cromforo
est casi a 90 grados con respecto a las -hlices, es decir, el momento dipolo de transicin es
prcticamente paralelo al plano de la membrana (en realidad se desva un poco, alrededor de
15 grados, pero ignoraremos este detalle). El importante recalcar que, pese a que la rodopsina

Figura 9.14
124
es una protena integral de membrana, no
se encuentra anclada y obligada a retener
una posicin fija, sino que flota en la
bicapa lipdica, la cual est en un estado
fluido; por lo tanto, la rodopsina es libre
de moverse, difundindose lateralmente y
rotando. Como tal, en el plano de la
membrana, los momentos dipolo de
transicin de los cromforos estn
distribuidos aleatoriamente en todas las
orientaciones.
Ahora consideremos la estructura
fotosensible de los fotorreceptores de los
vertebrados (conos y bastones), la cual
est formada por una pila de discos planos de membrana, en la cual se encuentra la rodopsina;
la Figura 9.15A ilustra esquemticamente su constitucin. Este arreglo es una manera de
maximizar la cantidad de membrana y por lo tanto de fotopigmento que se puede empacar
en un volumen pequeo, lo cual confiere a la clula una gran densidad ptica, es decir, una
gran capacidad de capturar fotones. La luz transita en la direccin axial del cono o bastn, en
otras palabras, cruza la pila de discos perpendicularmente. Supongamos que la luz fuera
polarizada linealmente: puesto que los cromforos estn orientados en todas las direcciones en
el plano ortogonal a la direccin de propagacin del haz de luz (ver detalle ampliado de un
disco, en la misma figura), hay igual probabilidad de absorcin, sin importar la orientacin del
vector de polarizacin (y sera la misma que con luz no polarizada). Como tal, una clula
fotosensible construida de esta manera no puede responder diferencialmente segn la
polarizacin del estmulo lumnico.

Miremos en cambio el diseo de otra clase de fotorreceptores, llamados rabdomricos, que
son muy comunes entre invertebrados (e.g. artrpodos y moluscos). Estas clulas tambin
empacan una gran cantidad de rodopsina, pero en este caso el aumento en la superficie de la
membrana fotosensible se logra por invaginacin de la membrana plasmtica, formando una
mirada de diminutas estructuras
tubulares, llamadas microvellosidades.
En muchos organismos estas
microvellosidades proyectan
lateralmente, i.e. su eje es perpendicular
a la direccin de la luz (Figura 9.15B).
Supongamos que en la membrana de
estos tubos, al igual que en los discos
de los vertebrados, la rodopsina
tambin tuviera libertad difusional,
orientndose en todas las direcciones
sin preferencia alguna (ver detalle
ampliado de una microvellosidad, en la
misma figura). A pesar de eso, se puede
demostrar que en este caso existira una
tendencia preferencial de absorber luz
que fuera linealmente polarizada en la
misma direccin que el eje de este
cilindro. Para visualizar el porque,

Figura 9.15

Figura 9.16
125
imaginemos que la seccin de la microvellosidad fuera cuadrada en lugar de redonda, es decir,
que se tratara de un paraleleppedo en vez de un cilindro (Figura 9.16); esta simplificacin no
altera de ninguna manera la generalidad de las conclusiones. Podemos considerar por
separado las dos caras alargadas perpendiculares al haz de luz (i.e. la de arriba y la de
abajo), y las dos caras verticales. En las primeras habra cromforos orientados en todas las
direcciones en el plano, al igual que en los discos, y una luz polarizada de cualquier manera (o
no polarizada) tendra la misma probabilidad de absorcin (Figura 9.16A). Pero la situacin es
diferente en las dos caras verticales del paraleleppedo: en este caso si la luz fuera linealmente
polarizada en la direccin del eje de la microvellosidad (Figura 9.16B) encontrara una gama de
orientaciones del momento dipolo de transicin que iran desde 100% favorable (cuando ste
tambin se alinea con el eje de la microvellosidad) hasta 0% favorable (cuando ste es vertical,
es decir, alineado con el haz de luz). Esta probabilidad de absorcin dependiente del grado de
alineamiento entre el cromforo y el eje principal de la microvellosidad, es proporcional al
cuadrado del coseno de ( siendo el ngulo entre los dos vectores). La probabilidad global de
absorcin deber tener en cuenta todas estas orientaciones igualmente representadas, y se
obtiene integrando este factor sobre todos los ngulos posibles:
2
P Acos
2
d
0
En cambio, para luz polarizada en la direccin ortogonal a las microvellosidades (Figura 9.16C)
el vector elctrico ser necesariamente tambin perpendicular a todos los cromforos y por
consiguiente con probabilidad mnima de ser absorbida. Quiere decir que en las dos caras
verticales del paraleleppedo efectivamente hay absorcin para luz polarizada en una direccin
(alineada con el eje de la microvellosidad) pero no en la direccin perpendicular. Sumando
entre las 4 caras del paraleleppedo resulta por lo tanto una neta tendencia preferencial de
absorber luz con una cierta direccin de polarizacin (2 caras no preferenciales y 2 que s lo
son). El argumento para una estructura cilndrica es similar, pero el continuo de orientaciones
obliga a realizar el cmputo de una manera un poco ms compleja (que implica una integral en
coordenadas cilndricas) aunque el resultado es el mismo. Notar que la sola geometra de la
forma como se organiza la membrana fotosensible ya es de por s capaz de producir este
efecto; hay adems indicios de que en algunos casos podra existir algn tipo de anclaje que, al
alinear los cromforos con el eje de las microvellosidades, aumentara ulteriormente la
selectividad. Ahora pasemos de una microvellosidad individual a una clula entera, y
consideremos un fotorreceptor en el cual todas sus microvellosidades tienen la misma
orientacin; esto puede ocurrir bien sea si stas solamente emanan paralelas de un lado de la
clula (como es el caso en el diagrama de la Figura 9.15B) o de dos caras opuestas (como
veremos en la figura 9.17). Dicha clula necesariamente absorbe luz diferencialmente segn
como est polarizada la luz: decimos que su ndice dicrico (que viene siendo el cociente de la
absorcin entre la luz polarizada en la direccin ptima vs. a 90) es necesariamente >1.
Supongamos que la matriz retinal contuviera clulas de este tipo, orientadas de tal manera que
sus microvellosidades estuvieran alineadas bien sea en una direccin o en la direccin
ortogonal: el panel superior de la Figura 9.17 ilustra esquemticamente dicho arreglo en el caso
de la retina de cefalpodos. Se trata de una disposicin parecida a la de un piso de madera en
parquet. El panel central muestra una micrografa electrnica de una seccin transversal de la
retina de un calamar, la cual muestra justamente este arreglo. Se han dibujado recuadros que
enmarcan la seccin de diferentes clulas adyacentes (numeradas 1 a 4), y doble flechas que
indican la orientacin de las microvellosidades. Finalmente, el panel inferior de la misma figura
ilustra un corte longitudinal en el cual se aprecian una porcin de tres fotorreceptores
contiguos: hay una clula central, el soma de cuyo segmento distal se ve como una lnea
diagonal, de la cual emanan perpendicularmente las microvellosidades (i.e. en el plano de la
126
fotografa). A cada lado, en cambio, las
microvellosidades de dos clulas vecinas estn de
punta, es decir, perpendiculares a las de la clula
central. Evidentemente se tienen dos poblaciones de
fotorreceptores, cada una con su preferencia para luz
polarizada en una cierta direccin. Si dichas clulas
sensoriales envan separadamente sus seales al
cerebro de dicho organismo, y ste es capaz de
efectuar una comparacin entre las respuestas (R) de
las dos clases de clulas en cada regin del campo
visual, se puede determinar la polarizacin de la luz:
por ejemplo, si denotamos las dos clases de clulas
como A y B, entonces en el caso en que para dos
fotorreceptores contiguos R(A) > R(B), se puede
inferir que la luz que se enfoc en esa regin de la
retina est polarizada segn el eje preferencial de A, y
viceversa. Es decir, se puede construir una imagen del
patrn de polarizacin en todo el campo visual. Este
procesamiento es paralelo a la estrategia utilizada por
la visin cromtica, en la cual se compara la respuesta
de diferentes fotorreceptores, cada uno
preferencialmente responsivo a una cierta longitud de
onda.

Cuando podra resultar til esa habilidad? Existen
numerosas instancias en las cuales la luz llega al
observador con una determinada polarizacin: por
ejemplo, si rebota de cierta manera sobre una
superficie o si es dispersada por partculas cuyas
dimensiones son . En este caso, el patrn espacial
de radiacin tiene unas caractersticas de polarizacin
(no solamente de intensidad y cromaticidad). Por
ejemplo, la dispersin de la luz del sol por parte de las
partculas de la atmsfera hace que en diferentes
regiones del cielo el patrn de polarizacin es
diferente, y depende adems de la posicin del sol y
por lo tanto tambin de la hora del da. Esta pauta se
preserva an cuando el sol no es directamente visible.
Nuestro sistema visual, al igual que los dems
organismos vertebrados, es totalmente insensible a
tales diferencias, pero el de muchos insectos en
cambio no. Por lo tanto, una abeja puede discernir
esta informacin, la cual puede ser utilizada para guiar su vuelo permitirle orientarse y
encontrar el camino de vuelta al panal despus de una excursin lejana en bsqueda de
nctar, an en ausencia de otros indicios visuales. Algunos cefalpodos, por otra parte, pueden
alterar las propiedades reflectivas de su piel, generando patrones de luz polarizada que son
percibidos por otros individuos y aparentemente sirven como un canal de comunicacin intra-
especies. Una vez ms, el espacio visual de otro organismo puede ser notablemente ms rico
de lo que nuestra experiencia en esa modalidad sensorial nos ofrece. Por supuesto, la
tecnologa puede acudir a nuestra ayuda y suplir algunas limitaciones de nuestro equipaje
biolgico. Por ejemplo, en microscopia podemos utilizar filtros que polarizan la luz e

Saibil & Hewat, J. Cell Biol., 1987

Zonana, Bull. Johns Hopkins Hosp., 1961

Saibil, J. Mol. Biol., 1982

Figura 9.17
127
interponerlos en el camino del iluminador y de la luz a ser visualizada, y lograr de esta manera
convertir patrones de polarizacin en diferencias de intensidad de luz, las cuales pueden ser
fcilmente discernidas por nuestros ojos o por una cmara.

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