6.

8 Metodologia do LAPETOX (Laboratrio de Pesquisas

Toxicolgicas):
[49]

A metodologia utilizada no Laboratrio de Pesquisas Toxicolgicas baseada
na metodologia de Meyer et al.
Obteno de matanuplios de Artemia salina L. / Incubao:

Colocar cerca de 20 mg de cisto de Artemia salina L. em um estudo
dos lados da incubadora;
Cobrir esse mesmo lado da incubadora com papel de alumnio;
Deixar o sistema sob luz artificial por 48 horas para que haja a
ecloso das larvas (metanuplios).

Dissoluo da substancia em estudo:

Pesar 50 mg da substancia em um vidro de penicilina;
Adicionar 2 gotas de Cremophor. Com a extremidade plana de uma
esptula metlica homogeneizar a mistura;
Adicionar mistura 1mL de Tween 80 5 % utilizando uma pipeta
graduada de maneira que o solvente escorra pelas paredes do tubo.
Homogeneizar a mistura e verificar se h material acumulado na
esptula;
Transferir a soluo para um balo volumtrico de 5mL utilizando um
funil pequeno. Completar os 5 mL com gua salina. Em solues
translcidas, a curvatura do menisco deve coincidir com trao da
aferio. J em substancias coloridas, a borda do menisco que
deve coincidir com o trao de aferio. A fim de se evitar perdas de
soluo, a gua salina utilizada para completar o volume de 5 mL
deve ser antes utilizada para lavar o funil e o vidro de penicilina
que continha a substancia. Ao retirar o funil verificar se h gotas de
soluo aderidas a ele;
Tampar o balo, agitar e transferir novamente a soluo para o vidro
de penicilina. Verificar se h gotas de soluo aderidas ao balo.

Preparao do controle:

Em um vidro de penicilina, adicionar 2 gotas de Cremophor e 1 mL
de Tween 80 a 5 %. Com a extremidade plana de uma esptula
metlica homogeneizar a mistura;
Transferir a soluo para um balo volumtrico de 5 mL utilizando
um funil pequeno;
Completar o volume de 5 mL com gua salina, a qual, antes de ser
adicionada soluo, deve ser utilizada para lavar o funil e o vidro
de penicilina utilizado;
Tampar o balo, agitar e transferir a soluo para o vidro de
penicilina. Verificar se h gotas de soluo aderidas ao balo.

Teste de toxicidade / Exposio:

O teste de toxicidade feito em triplicata para cada concentrao. As
concentraes utilizadas no teste so: 1000 g/mL, 750 g/mL, 500 g/mL, 250
g/mL, 100 g/mL e 50 g/mL obtidas a partir de diluies da soluo inicial
em gua do mar. Caso no seja possvel determinar a CL
50
nestas
concentraes feito um diluio para: 100 g/mL, 50 g/mL, 40 g/mL, 30
g/mL, 20 g/mL e 10 g/mL.
Utilizando pipetas automticas, adicionar os volumes de 500 L, 375 L,
250 L, 125 L, 50 L e 25 L da soluo inicial aos tubos de ensaio ou 50,
25 L, 20 L, 15 L e 10 L para as menores concentraes, sendo 3 tubos
para cada concentrao. Certificar-se de que no h bolhas na pipeta e de que
a soluo est sendo colocada na parte de baixo do tubo;
Com uma bureta adicionar 5 mL de gua salina filtrada e com pH entre 8
e 9. Com uma pipeta de Pasteur adicionar de 10 a 13 matanuplios de Artemia
salina Leach em cada tubo de ensaio. Certificar-se de que nenhuma larva est
aderida parede da pipeta ou do tubo de ensaio. Aps adio das larvas aos
tubos de ensaio, deixar o sistema sob luz artificial por 24 horas.

Preenchimento da Ficha Cumulativa / Leitura:

Media dos vivos, em ordem decrescente de concentraes;
Media dos mortos, em ordem crescente de concentraes;
Vivos acumulados, em ordem decrescente de concentrao;
Mortos acumulados, em ordem crescente de concentrao;
A porcentagem de vivos dada pela regra de trs, onde total acumulado
corresponde a 100 % e os vivos acumulados correspondem a X.
As concentraes e as porcentagens de vivos foram ento analisadas
pelo mtodo estatstico Probitos para determinao da CL
50
.