INFORME DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
PRESENTADO POR: NOMBRE CODIGO GRUPO COLABORATIVO NOMBRE DEL TUTOR VIRTUAL CORREO DEL TUTOR VIRTUAL NOMBRE DEL DIRECTOR DEL CURSO Karol Ibeth Meza Acosta
Diana Garca Vargas PRESENTADO A: Ing. Mara Fernanda Domnguez Amorocho FECHA DE REALIZACION DE LA PRCTICA: 12 y 27 de Abril del 2014 ENTREGA DE INFORME:
BUCARAMANGA NFORME LABORATORIO 1 Y 2 - COMPONENTE PRCTICO
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL Identificar diferentes especies de microorganismos como hongos y bacterias mediante toma de muestras en laboratorio de agua de charco y evaluacin microbiolgica en alimentos. Realizando procedimientos de siembra, coloracin, tincin e identificacin macroscpica y microscpica de estos.
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Identificar diferentes especies de microorganismos mediante mtodos de siembra microbiana. Realizar mtodos de tincin mediante coloracin simple y compuesta. Clasificacin de hongos mediante la observacin microscpica. Identificar medios de cultivo diferencial y selectivo. Controlar el crecimiento bacteriano de Gram- positivo y Gram -negativos. Identificar mediante el mtodo microscpico cianobacterias. Identificar unidades formadoras de colonias. Establecer normas y principios bsicos de comportamiento en el laboratorio.
2. MARCO TEORICO BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Los laboratorios de microbiologa estn regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la proteccin contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, as como garantizar la calidad de las tcnicas y la confiabilidad de los resultados.
METODOS DE SIEMBRA
Siembra en Estra Compuesta: Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y aislarlas fcilmente. Par ello Se flamea el asa redonda, se toma la muestra del material a estudiar (agua residual), se coge parte de la muestra para colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada Homogenizar, luego se Colca el inoculo en uno de los extremos de la caja de Petri con el medio de cultivo indicado. Extienda el cultivo haciendo 4 estras paralelas, sin romper el agar y Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel vinipel para llevarlas a incubar a 37 C.
TCNICAS DE TINCIN
La tincin es una tcnica en la que se utilizan diferentes colorantes, que son captados por las estructuras de las muestras biolgicas que se observan al microscopio, siendo cada estructura a fin a un tipo determinado de colorante, por lo que se pigmentan de diferente color y se pueden diferenciar e identificar.
Tincin simple: Un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante.
Tincin de Gram: Fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se ha modificado y es unos de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. Ayuda a determinar rpidamente las caractersticas morfolgicas, por lo que es til en la indicacin de los antibiticos. Esta tincin tambin permite establecer si el material enviado al laboratorio para su cultivo posee la calidad adecuada.
Es la tincin usada ms comnmente en los laboratorios de microbiologa. Constituyen el criterio bsico para separar los grandes grupos de bacterias (Gram positivas y Gram negativas), Ahora se sabe que la discrepancia en las propiedades de tincin de estos dos grupos refleja una diferencia fundamental en la naturaleza qumica de sus paredes celulares y en la naturaleza de estas. Despus de la fijacin de la muestra en un portaobjetos de cristal (por calentamiento o tratamiento con alcohol), esta se expone a cristal violeta y despus se agrega Lugol para formar un complejo con el pigmento principal. Durante la decoloracin con alcohol o acetona, las bacterias Gram positivas teniendo una gruesa capa de peptidoglicano es capaz de retener el complejo, mientras que los microorganismos gramnegativos teniendo una capa delgada de peptidoglicano lo pierden; se aade saponina como contra colorante, que es retenido por los microorganismos gramnegativos (de ah su color rosado).
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo.Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de o tras.
El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C.
De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Lquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulacin. Semislidos: Contienen 0.5% de agar en su formulacin. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo). Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulacin. Estos mediosinmovilizan a las clulas, permitindoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbilogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan ms de un tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar tambin se utilizan para la determinacin de clulas viables (recuento en placas).
De acuerdo a su composicin, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Definidos: es aqul medio de cultivo del cual se conoce su composicin exacta. Son muy utilizados en estudios fisiolgicos. Los medios mnimos son medios definidos que nicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pe ro no para desarrollarse ptimamente. Complejos: es aqul del cual no se conoce la composicin exacta del medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composicin qumica exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.
De acuerdo a su funcin, los medios de cultivo se clasifican como:
Medios Selectivos: Son aqullos que poseen uno o ms componentes aadidos, los cuales inhibirn o prevendrn el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o promovern el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustar las condiciones fsicas de un medio de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de inters. Medios Diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna caracterstica observable en su patrn de crecimiento en el medio, ya sea por produccin de algn pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH, o por halos de degradacin de algn componente en el medio de cultivo. Medios de Enriquecimiento: Contienen algn componente que permite el crecimiento de cierto tipo especfico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras. Medios Enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran nmero de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biolgicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc.El procedimiento se hace mediante una siembra de la muestra en caja de Petri por medio del mtodo ecomtrico y determinar el ndice de crecimiento absoluto (ICA).
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Los factores fsicos y qumicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parmetros medio ambientales no solo permiti estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilit aprender la forma de controlarlos.
El crecimiento bacteriano es la divisin de una bacteria en dos clulas hijas en un proceso llamado fisin binaria. Previniendo que no se produzca ningn caso de mutacin las clulas hijas resultantes sern genticamente idnticas a la clula original. De este modo tiene lugar la "duplicacin local" de la poblacin bacteriana. Las dos clulas hijas creadas tras la divisin no sobreviven necesariamente. Sin embargo, si el nmero de supervivientes supera la unidad, en promedio, la poblacin bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medicin de una curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido tradicionalmente una parte de la formacin de todos los microbilogos. Los procesos fundamentales empleados para ello son la enumeracin bacteriana (conteo bacteriano) por mtodos directos e individuales (microscopa, citometra de flujo1), por mtodos directos y masivos (biomasa), por mtodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por mtodos indirectos y en bloque (nmero ms probable, turbidez, absorcin de nutrientes). Los modelos permiten conciliar la teora con las mediciones.
OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS
Cyanobacteria: Es el nombre de un filo del reino Bacteria (nico del dominio del mismo nombre) que comprende a las cianobacterias y, en algn sentido, a sus descendientes por endosimbiosis, los plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los nicos procariotas que llevan a cabo fotosntesis oxignica, por ello tambin se les denomina oxyphotobacteria.El procedimiento se hace Colocando en el centro de la lmina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y colocar luego una laminilla encima de esta preparacin y esperar 2 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscopio y observar en 10X, 40X y 100X con el fin de ver las caractersticas de la bacteria mejor.
RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC)
Microorganismo aerobio mesfilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces dedesarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30C. Es un parmetro que sirve para estimar laflora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores ms tilesdel estado microbiolgico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitadocomo indicador de la presencia de patgenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos seconsideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.
PRUEBAS DE ANTAGONISMO
La composicin de la micro flora y de la micro fauna de un ecosistema est regulada por las interacciones de los microorganismos de una comunidad entre s y de los mismos con el medio no bitico de lo cual surge un equilibrio dinmico. Si dos o ms especies que coexisten en un lugar no se afectan mutuamente la relacin es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las especies comienzan a interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo, protocooperacin, simbiosis, amensalismo, predacin, parasitismo. La evaluacin de estas relaciones in vitro permiten aislar y seleccionar microorganismos con capacidad de Biocontroladores. En las pruebas de antagonismo se trabaja con la tcnica por enfriamiento, el Mtodo de Igarashi y tcnica de estras.
En la tcnica por enfriamiento se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en la parte trasera por la mitad con un marcador de vidrio y se seala la mitad de cada una de las mitades previamente divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por puncin sembrar los microorganismos. Incubar a 37C si uso bacterias o a 25C si uso hongos.
En mtodo de Igarashi Se toma una caja de Petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con un asa redonda, en un espacio de tres (3) centmetros un microorganismo seleccionado y finalmente siembre en el centro por puncin.
La tcnica por estras su proceso se hace en caja de Petri en la cual previamente usted sembr con una estra en el centro una bacteria, sembrar a 0.5 cm, por medio de estras, cuatro bacterias a evaluar. En el revs de la caja con marcador de vidrio seale que microorganismos sembr. Incubar a 37C.
3. METODOLOGA
3.1 INSTRUMENTOS
Asa redonda Cajas de Petri Mechero Incubadora Vinipel Marcador de vidrio Portaobjetos Cubreobjetos Tubos de ensayo Asa redonda o curva Asa recta Pipetas estriles de 1 y 2 ml Estufa Vaso de Precipitado de 500 ml Contador de colonias Microscopio
3.2 REACTIVOS
Muestra contaminada con microorganismos Agua peptonada al 0,1% estril Agar nutritivo Agua destilada estril Azul de metileno Cristal violeta Lugol Alcohol cetona Fucsina bsica o safranina Azul de lactofenol Cultivo de Hongos 2. Agar Baird Parker (selectivo para estafilococos) Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri Caldo nutritivo Agua con cianobacterias
4. PROCEDIMIENTO PRACTICAS LABORATORIO
4.1 PROCEDIMIENTO PRACTICA No 1: METODO DE SIEMBRA
1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. El material previamente esta esterilizado. 2. Colocar 1ml de la muestra de Agua sucia y colocarla con el asa redondo en el tubo de ensayo que contiene aproximadamente 35ml de agua peptonada. Esta mezcla se tapa y agita por un periodo de tiempo de 15 minutos para que se homogenice.
3. Colocar la muestra en la incubadora por un periodo de tiempo de 20 30 minutos. 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un crculo de papel, aproximadamente de 8 cm, esto se hace como gua para distribuir correctamente la muestra dentro de la Caja Petri. Este se coloca debajo de la caja de Petri cuando se est sembrando.
5. Finalizado el tiempo de incubacin, se procede a realizar la siembra. Se toma el asa redonda y se esterilizarla, colocndola sobre el mechero hasta quela punta muerte un color rojo, se deja enfriar cerca al mechero agitndolo y se procede a tomar la muestra del tubo de ensayo.
6. Abrir el tubo de ensayo con la muestra, e introducir el asa, esta tomara residuos lquidos que se adhieren. 7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y deno pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este.
8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento dibujado en el papel, siguiendo todas las precauciones y seguridad necesaria para que la muestra no se contamine.
9. Terminado la siembra, marcar la Caja Petri en el borde de la base. 10. Colocar el tubo y la caja a incubar a una temperatura de 37C. La Caja Petri debe estar boca abajo siempre. 11. Desinfectar el rea de trabajo, apagar el mechero y entregar el material.
Por cuestiones relacionadas con el clima, cuando regresamos al laboratorio para continuar con las practicas, los cultivos no crecieron, por tal motivo la tutora de practica consigui un Ecoli el cual fue sembrado por Estras y unos hongos tricoderma (ambiental) para poder continuar con el desarrollo de la actividad.
PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: TCNICAS DE TINCIN (Coloracin Simple)
1. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota de agua estril, se esteriliza el agar hasta que quede rojo, se toma una muestra de EMB (Ecoli) se extiende a un rea no superior a dos centmetros cuadrados.
2. Dejar que la preparacin se seque al aire. Una vez seca la muestra, se fija con calor sobre el mechero aproximadamente se pasan tres veces.
3. Dejar enfriar la lmina. Lo anterior se conoce como la realizacin de un frotis y se hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas.
4. Colocar la preparacin sobre una rejilla encima del vertedero. 5. Cubrir la suspensin con los siguientes colorantes, en los siguientes tiempos establecidos, as: Cristal violeta: 1 minuto Azul de Metileno: 5 minutos Fucsina: 1 minuto Una vez aplicada cada uno de los anteriores colorantes de debe lavar con agua teniendo cuidado en no destruir la muestra.
6. Terminado el tiempo de coloracin segn el colorante empleado, eliminar el colorante lavando con agua suavemente.
7. Dejar secar y colocar la preparacin en la platina del microscopio y observar.
PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: TCNICAS DE TINCIN (Coloracin Compuesta)
1. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota del cultivo bacteriano con ayuda del asa redonda estril realizar un frotis de la muestra seleccionada.
2. Dejar que la preparacin se seque al aire. Una vez seca la muestra, se fija con calor sobre el mechero aproximadamente se pasan tres veces. Dejar enfriar la lmina.
3. Colocar en la rejilla para coloracin y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante. 4. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis. 5. Realizar la decoloracin con la mezcla alcohol- acetona, por 25 segundos. Lavar inmediatamente con agua. 6. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar con agua.
7. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas.
PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: COLORACIN ESPECIAL (Tinta China)
1. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota de agua estril, se le adiciona una gota de tinta china.
2. Con el agar estril se toma una muestra de Ecoli y se mezcla.
3. Se le coloca una lamina, montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas.
4.2 PROCEDIMIENTO PRACTICA No 3: OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS
1. Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota de azul de lactofenol.
2. Luego tomar con el agar previamente estril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante. 3. Colocar luego un cubreobjetos o laminilla encima de esta preparacin que est en el portaobjetos y esperar 3 minutos.
4. Finalizado ese tiempo montar al microscopio y observar.
4.3 PROCEDIMIENTO PRACTICA No 7: OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS
1. Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota del agua sucia que sirve como muestra.
2. Colocar luego el cubre objetos encima de esta preparacin y esperar 2 minutos.
3. Finalizado este tiempo montar al microscopio y observar en 10X, 40X y 100X. 5. RESULTADOS PRACTICAS LABORATORIO
5.1 RESULTADO PRACTICA No 1:METODOS DE SIEMBRA Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que rene un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad El medio de cultivo empelado en esta prctica es: Medios Selectivos: favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular, con la diferencia de ser slidos, diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. Durante la prctica se emple la tcnicas de siembra por estra, para la elaboracin de esta tcnica de siembra se us agar nutritivo que estaba dentro de una caja Petri previamente esterilizada; este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario. Los medios slidos en placas Petri, ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en l. Por cuestiones relacionadas con el clima, cuando regresamos al laboratorio para continuar con las practicas, los cultivos no crecieron, por tal motivo la tutora de practica consigui un Ecoli el cual fue sembrado por Estras y unos hongos tricoderma (ambiental) para poder continuar con el desarrollo de la actividad.
5.2 RESULTADO PRACTICA No 2: TCNICAS DE TINCIN(Coloracin Simple) LECTURA AGRUPACIONES BACTERIANAS Bacteria: Bacilos Color: Morado Tamao: 1,3 mm de dimetro por 3 a 5 mm de largo. Forma: Cilndrica Bacilar, cadenas cortas. Agrupacin bacilar: Estreptobacilos, agrupaciones de bacilos a modo de cadena. En esta prctica se realiz tincin simple, donde se utilizan unos colorantes, con el objeto de permitir la observacin de lamorfologa bacteriana. Se aplic la coloracin para endosporas bacterianas, para determinar tipo de pared y la morfologa de las clulas bacterianas, as como el tipo de agregacin, mediante observacin microscpica. En la caracterizacin microscpica, se identific la especie bacilos de 1,3 mm de dimetro por 3 a 5 mm de largo con bordes redondeados aproximadamente, que forman cadenas cortas. Se observan esporas cilndricas subterminales.
RESULTADO PRACTICA No 2: TCNICAS DE TINCIN(Coloracin Compuesta) LECTURA AGRUPACIONES BACTERIANAS Bacteria: Bacilos Gram Positivo Color: Morado Tamao: 1 a 1,3 mm de dimetro por 3 a 10 mm de largo. Forma: Cilndrica Bacilar, cadenas largas. Agrupacin bacilar: Estreptobacilos, agrupaciones de bacilos a modo de cadena. En esta prctica se realiz tincin compuesta, donde se utilizan varios colorantes, con el objeto de permitir la observacin de lamorfologa bacteriana. Se aplic la coloracin de Gram, para determinar tipo de pared y la morfologa de las clulas bacterianas, as como el tipo de agregacin, mediante observacin microscpica. En la caracterizacin microscpica, se identific la especie bacilos Gram positivos, de 1 a 1,3 mm de dimetro por 3 a 10 mm de largo, con bordes cuadrados o cncavos.
RESULTADO PRACTICA No 2: COLORACIN ESPECIAL (Tinta China) Falta.
5.3 RESULTADO PRACTICA No 3: OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS
OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS Hongo: Tricoderma Estructura observada: Redondeados u ovales, se observa la formacin de hifas. Color: Verde suave
5.4 RESULTADO PRACTICA No 7:OBSERVACIN MICROSCPICA DE CIANOBACTERIAS Microscpio 10X,
Microscpio 40X.
Microscpio 100X.
6. CONCLUSIONES
Los medios qumicamente definidos se preparan aadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos altamente purificados. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. FALTA..
7. BIBLIOGRAFA
NORMAS DE LA AMERICAN PSYCHOLOGICAL ASSOCIATION (APA) PARA LA CONFECCIN DE REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: Biblioteca Central Luis Demetrio Tinoco, http://www.cibem.org/paginas/img/apa6.pdf. Universidad Nacional Abierta y a Distancia, Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente, Gua de Laboratorio, Microbiologa Ambiental,http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/358010A_MICROBIOLOGIA_PRACT ICAS_2014.pdf.