Espectroscopia de Fluorescencia

MODULO
INTRODUCCIN A LA ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
RECOPILADO POR:
J orge Enrique Castillo Ayala
UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI
ANALISIS INSTRUMENTAL
JECA 1
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FLUORESCENCI A
Es el fenmeno a travs del cual algunas molculas despus de
absorber radiacin electromagntica, son capaces de emitir luz, sin que
se de cambio en la multiplicidad.
E0
E1
Absorcin
UV
Emisin
VIS
v1
v2
v3
v4
v1
v2
v3
v4
JECA 2
E0
E1
S0 S1 T1
Singulet
e
Singulete Triplete
Estado fundamental en su
estado de mnima energa
Transicin sin cambio
de multiplicidad. El
modo vibracional no es
el de mnima energa
Cambio de
multiplicidad. El modo
vibracional no es el de
mnima energa
FLUORESCENCI A
JECA 3
Una vez el electrn se encuentra en el estado excitado, este tiende a pasar
al estado fundamental; este retorno se puede llevar a cabo de mltiples
formas, las cuales compiten entre s.
La transicin desde un modo vibracional vi del estado excitado hasta el
estado fundamental se conoce como desexcitacin.
La desexcitacin puede ocurrir de una forma no radiativa (sin emitir
radiacin electromagntica) o radiativa(emitiendo un fotn).
Las sustancias que emiten radiacin electromagntica, se les conoce como
luminiscentes.
Las formas ms importantes de desexcitacin se pueden clasificar en
transiciones verticalesy horizontales.
Las verticales se dan entre estados vibracionales de distinta energa; las
horizontales implican transiciones entre modos vibracionales
isoenergticos.
JECA 4
S
0
S
1
S
2
T
Conversi
n interna y
externa
Absorcin
Fluorescenci
a
Fosforescenci
a
Cruce entre
sistemas
Relajacin
vibracional
Conversi
n interna
Relajacin
vibracional
Estado triplete
excitado
Estados singuletes
excitados
Diagrama de J ablonski
JECA 5
JECA 6
PROCESOS DE DESACTI VACI N
1. Relajacin vibracional
Colisiones moleculares conducentes al estado fundamental vibracional.
2. Conversin interna
Paso a un nivel electrnico inferior sin emitir radiacin. Solapamiento de niveles
vibracionales.
3. Conversin externa
Transferencia de energa desde la molcula excitada hacia el disolvente.
4. Predisociacin
Excitacin a nivel electrnico que por conversin interna conduce a nivel
electrnico inferior en el que se disocia.
5. Disociacin
Excitacin a nivel electrnico en el que la molcula se disocia.
6. Cruzamiento de sistemas
Transicin entre dos estados electrnicos de diferente multiplicidad de espn.
Ms probables cuando se solapan los niveles vibracionales.
DESEXCI TACI ONES NO RADI ATI VAS
Desexcitaciones no radiativas se dan por procesos de relajacin
vibracional y rotaciona, (R).
Mediante dicho proceso la molcula va pasando a modos vibracionales de
menor energa dentro del estado excitado (vi vi-1 v0) hasta
alcanzar el de mnima energa compatible con dicho estado.
Este tipo de transicin es, por lo tanto, vertical.
En molculas en disolucin, dicho proceso se debe a los choques
estadsticos entre esas molculas, o entre stas y las de disolvente.
La energa liberada en esta desexcitacin se convierte en energa cintica
de las molculas, y en ltimo trmino se disipa en forma de calor.
Esta es, la cusa por la que se calienta un medio como consecuencia de su
exposicin a la luz. Estos procesos de relajacin son muy rpidos en los
lquidos (10
-12
s) y compiten con otras formas de desexcitacin. JECA 7
S0
S1
v1
v2
v3
v4
v1
v2
v3
v4
v0
v0
RELAJ ACI ON VI BRACI ONAL
O ROTACI ONAL
JECA 8
En el camino hacia modos vibracionales de menor energa dentro del estado
S1, puede suceder que alguno de ellos, vj, sea de igual energa que un modo
vibracional del estado fundamental, vj.
En ese caso pude acontecer una transicin isoenergtica, por tanto horizontal,
no radiativa, que se conoce con el nombre de conversin interna (CI ):
En este caso la molcula pasa a un modo vibracional de elevada energa de
los del estado singulete fundamental.
La evolucin hacia el modo vibracional de menor energa ocurre mediante
procesos de relajacin idnticos a los descritos para el estado singulete
excitado.
JECA 9
v9
v5
S0
S1
S0
Absorcin
Conversin interna
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
JECA 10
v9
v5
S0
S2
S1
Absorcin
Conversin interna
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
Fluorescencia
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
S0 JECA 11
Las transiciones desde un estado singulete a un estado triplete, y viceversa,
estn altamente impedidas, ya que implican un cambio de multiplicidad.
Sin embargo, en algunas molculas, dichos estados tripletes poseen modos
vibracionales isoenergticos con determinados modos vibracionales de
estados singuletes excitados. As, la transicin entre dichos estados puede
suceder con bastante probabilidad. Esta transicin, que es horizontal, se
conoce con el nombre de cruce entre sistemas, (CES):
El modo vibracional de menor energa de T1 normalmente est a un nivel
energtico inferior que el correspondiente del estado S1. Esto hace que los
estados tripletes se comporten como autnticas trampas para los electrones
excitados. La transicin al estado singulete fundamental implica un cambio de
multiplicidad, la molcula permanecer mucho tiempo en ese estado triplete
antes de abandonarlo.
JECA 12
v9
v5
S0
S1
T1
Absorcin
Cruce entre
sistemas
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
v9
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
Fosforescencia
S0
v5
v1
v2
v3
v4
v0
v6
v7
v8
JECA 13
RENDI MI ENTO CUANTI CO
El rendimiento cuntico es la relacin entre el nmero de molculas que emiten
luminiscencia respecto al nmero total de molculas excitadas.
Para molculas altamente fluorescentes como la fluoresceina, la eficiencia
cuntica, bajo determinadas condiciones, es aproximadamente uno.
El rendimiento cuntico para un compuesto se puede calcular a partir de
las constantes de velocidad relativas kx de los procesos por los que el
estado singulete excitado ms bajo se desactiva. Fluorescencia (kf), cruce
entre sistemas (kces), conversin externa (kce), conversin interna (kci),
predisociacin (kpd), disociacin (kd). kf, kpd, kd , dependen de la
estructura y kces, kce, kci , dependen del entorno.
d pd ci ce ces f
f
k k k k k k
k
+ + + + +
=
JECA 14
TRANSI CI ONES EN MOLCULAS
FLUORESCENTES
La fluorescencia rara vez se presenta por absorcin de radiacin de longitud de
onda inferior a 250 nm, debido a que esta radiacin es suficientemente
energtica para producir desactivacin de los estados excitados por
predisociacin o disociacin.
Rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones * , en cambio,
est asociada a procesos menos energticos * y * n.
La fluorescencia surge, generalmente, de una transicin desde el nivel
vibracional ms bajo del primer estado electrnico excitado a uno de los
niveles vibracionales del estado electrnico fundamental.
Para la mayora de los compuestos fluorescentes, la radiacin se produce por
una transicin * y * n, dependiendo de cul de ellas sea la
menos energtica.
JECA 15
EFI CI ENCI A CUNTI CA Y TI PO DE
TRANSI CI N
La fluorescencia se encuentra con ms frecuencia en los compuestos en
los que la transicin de ms baja energa es del tipo *, que en
aquellos compuestos en los que la transicin de menor energa es del tipo
n *.
La mayor eficiencia cuntica asociada a la transicin * se puede
explicar de dos formas:
1. La absortividad molar de una transicin * es normalmente de
100 a 1000 veces superior que la de un proceso n * que representa
una medida de la probabilidad de la transicin en ambas direcciones; el
tiempo de la transicin * es de 1 X 10
-9
a 1 X 10
-7
s y el de la
transicin n * es de 1 X 10
-7
a 1 X 10
-5
s; siendo kf mayor para la
transicin *.
JECA 16
EFI CI ENCI A CUNTI CA Y TI PO DE
TRANSI CI N
2. Consideraciones termodinmicas sugieren que la constante de
velocidad del cruce entre sistemas kces es menor para el estado
excitado *, ya que la diferencia de energa entre los estados
singulete/triplete es grande , es decir, se requiere ms energa para
desaparear los electrones del estado excitado *.
Como consecuencia, el solapamiento de los niveles vibracionales del
triplete con los del estado singulete es menor y la probabilidad de que
ocurra un cruce entre sistemas es menor.
JECA 17
FLUOROFOROS
Para que una molcula pueda llegar a emitir fluorescencia, es necesario que
previamente sea capaz de absorber radiacin electromagntica; es decir,
dicha molcula debe pasar de su estado fundamental S0, en el modo
vibracional de menor energa, a algn modo vibracional vi de un estado
excitado (S1 o S2), es necesario que dicha molcula tenga un crofomforo,
es decir, enlaces o conjuntos de enlaces responsables de dicha absorcin.
El hecho de que una molcula posea un grupo cromforo no implica
necesariamente que pueda emitir fluorescencia; sin embargo, si ese grupo
fluorece, se le denomina fluorforo.
Cuando una molcula posee de modo natural un fluorforo, a ste se le
califica como intrnseco. En otros casos es conveniente unir a una
molcula, covalentemente o no, un fluorforo ajeno a ella. El fin de esta
manipulacin es dotarla de fluorescencia si no la tiene o de una
fluorescencia diferentea la que tiene de modo natural. A este tipo de
fluorforos se les denomina extrinsecos.
JECA 18
FLUORESCENCI A Y ESTRUCTURA
La fluorescencia ms intensa y ms til es la que presentan los compuestos
que contienen grupos funcionales aromticos con transiciones *
de baja energa.
Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifticas y
alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados tambin
pueden presentar fluorescencia, pero el nmero de estos compuestos es
pequeo comparado con el nmero de sistemas aromticos.
OH
VITAMINA A
JECA 19
La mayora de hidrocarburos aromticos no sustituidos son fluorescentes en
disolucin, la eficiencia cuntica normalmente aumenta con el nmero de
anillos y con su grado de condensacin.
BENCENO NAFTALENO
ANTRACENO
FENANTRENO
PIRENO
FLUORENO
FLUORANTENO
JECA 20
Los heterocclicos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol,
no presentan fluorescencia.
Las estructuras condensadas con los anteriores si presentan fluorescencia.
N
PIRIDINA
O
FURANO
S N
H
TIOFENO PIRROL
N
QUINOLINA
N
ISOQUINOLINA
N
H
INDOL
JECA 21
En los heterocclicos con nitrgeno, se cree que la transicin electrnica de
ms baja energa implica a un sistema n * que rpidamente se
transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
La condensacin de anillos bencnicos para dar ncleos heterocclicos, da
lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorcin. En estas
estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es ms corto, as, se
observa fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y
el indol.
La sustitucin en el anillo bencnico provoca desplazamientos en la
longitud de onda de los mximos de absorcin y los correspondientes
cambios en los picos de fluorescencia.
La sustitucin afecta a la eficacia de la fluorescencia: algunos de estos
efectos se ilustran con los datos de los derivados bencnicos. (tabla)
JECA 22
Efecto de los sustituyentes en la fluorescencia del benceno
Compuesto Formula Longitud de onda de
fluorescencia, nm
Intensidad de
fluorescencia relativa
Benceno C
6
H
6
270 - 310 10
Tolueno C
6
H
5
CH
3
270 - 320 17
Propilbenceno C
6
H
5
C
3
H
7
270 - 320 17
Fluorobenceno C
6
H
5
F 270 -320 10
Clorobenceno C
6
H
5
Cl 275 - 345 7
Bromobenceno C
6
H
5
Br 290 - 380 5
Yodobenceno C
6
H
5
I - 0
Fenol C
6
H
5
OH 285 - 365 18
Ion fenolato C
6
H
5
O
-
310 - 400 10
Anisol C
6
H
5
OCH
3
285 - 345 20
Anilina C
6
H
5
NH
2
310 - 405 20
Ion anilinio C
6
H
5
NH
3
+
- 0
cido benzoico C
6
H
5
COOH 310 - 390 3
Benzonitrilo C
6
H
5
CN 280 - 360 20
Nitrobenceno C
6
H
5
NO
2
- 0

JECA 23
Los halgenos ejercen influencia en la fluorescencia, se cree que el descenso
en la fluorescencia al aumentar el nmero atmico del halgeno es debido,
en parte, al efecto del tomo pesado (el cruce entre sistemas es ms comn
en molculas que contienen tomos pesados, como son el yodo o el bromo;
los acoplamientos espn/orbital se hacen grandes en presencia de tales
tomos y, de ese modo, se favorece en cambio en el espn), que aumenta la
probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el estado triplete.
Se cree que la predisociacin juega un papel importante tanto en el
yodobenceno como en los nitroderivados; estos compuestos tienen enlaces
de fcil ruptura que pueden absorber la energa de excitacin seguida de una
conversin interna.
La adicin de un cido carboxlico o de un grupo carbonilo en un anillo
aromtico generalmente inhibe la fluorescencia. En estos compuestos, la
energa de la transicin n * es menor que la de la transicin
*; el rendimiento de la fluorescencia es normalmente menor para el
sistema del primer tipo.
JECA 24
EFECTO DE LA RI GI DEZ ESTRUCTURAL
H
2
C
FLUORENO
BIFENILO
La fluorescencia se ve favorecida en molculas que poseen estructuras
rgidas.
La eficiencia cuntica para el fluoreno y el bifenilo son prximas a 1,0 y 0,2,
respectivamente, bajo condiciones de medida similares.
La falte de rigidez de una molcula probablemente provoca un aumento de
la velocidad de conversin interna y el correspondiente aumento en la
probabilidad de desactivacin no radiante.
JECA 25
EFECTO DE LA RI GI DEZ ESTRUCTURAL
Se ha recurrido a la influencia de la rigidez estructural para explicar el
aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgnicos cuando
estn formando un complejo con un ion metlico.
La intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinolina es mucho menor
que la de su complejo con zinc.
N
O
Zn
2
JECA 26
JECA 27
EFECTO DE LA TEMPERATURA
La eficiencia cuntica de fluorescencia disminuye en la mayora de
las molculas al aumentar la temperatura.
Al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es
elevada, aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin
externa.
JECA 28
EFECTO DEL DI SOLVENTE
Una disminucin en la viscosidad del disolvente aumenta la probabilidad de
la conversin externa, disminuyendo la eficiencia cuntica de fluorescencia.
La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de disolventes que
contienen tomos pesados o de solutos con dichos tomos en su estructura;
como por ejemplo: tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.
El efecto es similar al observado cuando se introducen, por sustitucin,
tomos pesados en compuestos fluorescentes: las interacciones spin-orbital
desembocan en un aumento en la velocidad de formacin del triplete y en la
correspondiente disminucin de la fluorescencia.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a
los disolventes compuestos que contienen tomos pesados.
JECA 29
EFECTO DEL pH
La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos
o bsicos depende normalmente del pH.
Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisin son,
probablemente, diferentes para las formas ionizadas y no ionizadas del
compuesto.
Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo surgen del
distinto nmero de especies resonantes asociadas con las formas cidas
y bsicas de las molculas.
JECA 30
EFECTO DEL pH
N N N N
H H H H H H H H
H
FORMAS RESONANTES DE LA ANILINA ION ANILINIO
La anilina tiene varias formas resonantes, mientras que el ion anilinio solo
una. Esto es, cuanto mayor es el nmero de formas resonantes, mayor es la
estabilidad del primer estado excitado, la consecuencia es una
fluorescencia en la regin ultravioleta.
La influencia del pH en la fluorescencia de ciertos compuestos se ha
utilizado para la deteccin de puntos finales en valoraciones acido/base.
JECA 31
EFECTO DEL OX GENO DI SUELTO
La presencia de oxgeno disuelto suele reducir la intensidad de
fluorescencia de una disolucin.
Este efecto puede ser el resultado de una oxidacin de las especies
fluorescentes inducida fotoqumicamenre. Sin embargo, con ms
frecuencia la amortiguacin tiene lugar como consecuencia de las
propiedades paramagnticas del oxgeno molecular, que favorecen el
cruce entre sistemas y la conversin de las molculas excitadas al estado
triplete.
Otras especies paramagnticas tambin tienden a amortiguar la
fluorescencia.
JECA 32
EFECTO DE LA CONCENTRACI N EN LA
I NTENSI DAD DE FLUORESCENCI A
La potencia de la emisin fluorescente F es proporcional a la potencia radiante
del haz de excitacin absorbido por el sistema. Esto es
F =K(Po P) (1)
Donde Po = potencia del haz que incide sobre la disolucin.
P = potencia despus de atravesar una longitud bdel medio.
K = constante que depende de la eficiencia cuntica de la
fluorescencia
Con el objeto de relacionar F con la concentracin cde la especie fluorescente,
se escribe la ley de Beer de la forma
(2)
bc
o
P
P
10
=
JECA 33
Donde es la absortividad molar de las molculas fluorescentes y ebc es la
ansorbancia, A. Sustituyendo la ecuacin (2) en la ecuacin (1)se obtiene
F =KPo(1 10
- bc
) (3)
El trmino exponencial de la ecuacin (3) puede desarrollarse como una serie
de Maclaurin
(4)
( )
+ = ...
3!
2,303
! 2
303 , 2
303 , 2 '
2
!bc bc
bc P K F
o

JECA 34
Siempre que 2,303 bc = A < 0,05, los trminos posteriores del corchete son
despreciables respecto al primero; en estas condiciones, el error relativo
mximo cometido al despreciar todos los trminos excepto el primero es de
0,13 por 100. Por ello se puede escribir
F =2,3 K bc P
o
(5)
o cuando P
o
es constante,
F =Kc (6)
c
F
JECA 35
ESPECTROS DE EMI SI ON Y DE
EXCI TACI N
Tres espectros del fenantreno, E corresponde al
espectro de excitacin, este se obtiene
midiendo la intensidad luminiscente a una
longitud de onda fija mientras se vara la
longitud de onda de excitacin.
Los espectros de fluorescencia F y
fosforescencia P suponen la excitacin a una
longitud de onda fija mientras se registra la
intensidad de emisin como funcin de la
longitud de onda.
La fotoluminiscencia tiene lugar a longitudes de onda ms largas que las
longitudes de onda de excitacin. Las bandas fosforescentes se encuentran a
longitudes de onda ms largas que las bandas de fluorescencia, ya que el estado
triplete excitado tiene menor energa que el correspondiente estado singulete.
JECA 36
I NSTRUMENTACI N EN FLUORESCENCIA Y
FOSFORESCENCI A
Los componentes de los instrumentos usados
en las medidas de luminiscencia son
similares a los que se encuentran en los
fotmetros o espectrofotmetros UV/Vis.
La figura muestra los componentes de los
fluormetros o espectrofluormetros.
Casi todos los instrumentos de fluorescencia
utilizan pticas de doble haz para compensar
las fluctuaciones en la potencia de la fuente.
JECA 37
FOSFORESCENCI A
1. Lmparas:
Arco de Mercurio a baja presin (254, 302, 313, 546, 578, 691, 773
nm) tiles en Fluormetros de filtros.
Lmpara de arco de Xenon Emite espectro de radiacin continua desde
300 a 1300 nm tiles en espectrofluormetros.
Lseres sintonizables de nitrgeno pulsante o de Nd:YAG trabajan
a una sola longitud de onda.
2. Filtros y Monocromadores:
Se han usado tanto filtros de absorcin como filtros de interferencia en
los fluormetros para seleccionar la longitud de onda de excitacin y de
emisin. En los espectrofluormetros se utilizan monocromadores de
red.
JECA 38
FOSFORESCENCI A
3. Detectores
Se utilizan tubos fotomultiplicadores, detectores de diodos y en el caso
particular de algunos espectrofluormetros se usan detectores de diodos en
lnea; tiles en HPLC y Electroforesis capilar.
4. Cubetas
Se utilizan cubetas cilndricas o rectangulares, fabricadas en slice o en
vidrio que se utilizan segn el caso.
En fluorescencia es importante evitar dejar huellas dactilares en las
cubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia fluorece.
JECA 39
FOSFORESCENCI A
Los espectrofluormetros son instrumentos especializados
equipados con dos monocromadores .
Uno de los monocromadores permite variar la longitud
de onda de excitacin y el otro permite obtener un
espectro de emisin.
La figura muestra un espectro de excitacin del antraceno
que es similar al espectro de absorcin; tambin se
muestra el espectro de emisin de fluorescencia del
antraceno; la longitud de onda de excitacin se mantuvo
constante mientras se hace un barrido de las longitudes
de onda de emisin.
JECA 40
FOSFORESCENCI A
Estos espectros son como una imagen especular uno del otro, ya que las
diferencias de energa vibracional para los dos estados electrnicos fundamental
y excitado son ms o menos las mismas.
JECA 41
FLUORMETRO
Son instrumentos diseados para anlisis cuantitativo; para seleccionar la
longitud de onda de excitacin y de emisin utilizan filtros. Utilizan
lmpara de mercurio a baja presin y un par de tubos fotomultiplicadores.
JECA 42
ESPECTROFLUOR METRO
Instrumentos diseados para hacer barrido espectral en la regin UV y
Visible para obtener los espectros de excitacin y de emisin de las
molculas que fluorecen. Utilizan monocromadores de red y lmpara de
arco de Xenn; se utilizan tanto para anlisis cualitativo como para anlisis
cuantitativo.

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