RECOLECCION, TRANSPORTE, CONSERVACION Y PROCESAMIENTO

DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS PARASITOLOGICOS

(REFERIRSE A LA GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS PARA LOS
METODOS DE CONCENTRACION DE MATERIA FECAL)

La correcta obtencin de muestras es un prerrequisito fundamental para arribar a
un diagnstico adecuado. Para tal fin, deben considerarse los factores que contribuyen
al diagnstico presuntivo de las parasitosis, la preparacin fsica y emocional del
paciente para la toma de las muestras, los procedimientos requeridos para su obtencin,
transporte y preservacin y, finalmente, su procesamiento e identificacin del agente
etiolgico.

I. ENTEROPARSITOS
En el caso de la toma de muestra para diagnstico de enteroparasitosis se deben
considerar cuatro abordajes posibles: la obtencin de materia fecal, la obtencin de
muestras perianales, la obtencin de biopsias y la obtencin de suero o plasma (esto
ltimo aplica slo al diagnstico serolgico de amebosis extraintestinal).
Para una mejor orientacin con respecto a los posibles agentes etiolgicos
responsables de la infeccin intestinal se requiere la elaboracin de una ficha tipo. con
antecedentes epidemiolgicos y clnicos, accesible al laboratorio de diagnstico
parasitolgico. Esta ficha debe incluir precisiones sobre los siguientes datos:
1. Nombre y apellido. Edad. Sexo.
2. Lugar de nacimiento. Residencia actual. Residencias anteriores. Viajes.
3. Ocupacin laboral.
4. Motivo de la consulta.
5. Sistemas de provisin de agua, de eliminacin de excretas y de gestin de
residuos en el domicilio. Piso de tierra o material.
6. Hbitos (preparacin y consumo de alimentos, geofagia, contacto con el suelo,
lavado de manos, etc.).
7. Presencia de animales domsticos y de vectores mecnicos.
8. Familiares/convivientes/contactos con parasitosis actuales o pasadas.
9. Medicacin especfica administrada actualmente o en forma reciente.
10. Sntomas dominantes (digestivos, prurito, respiratorios, etc.).
11. Evidencias de parasitosis ( antecedente de expulsin de parsitos).
12. Antecedentes de desnutricin e inmunodepresin.
1 . Preparacin del paciente
El paciente debe someterse a una preparacin correcta, mnima e indispensable
para evitar exmenes falsamente negativos o positivos. Por eso se recomienda evitar,
por lo menos tres das antes y durante la recoleccin de las muestras, la administracin
oral o rectal de medicamentos que:
i. Sean empleados como medio de contraste radiolgico (P.ej., compuestos baritados).
ii. Alteren el trnsito intestinal (P.ej., carbn vegetal, sales de bismuto, laxantes)
iii. Aumenten el contenido lipdico de la materia fecal (P.ej., vaselina lquida)
Asimismo, se recomienda suspender, por lo menos tres das antes y durante la
recoleccin de las muestras, la ingestin de alimentos que produzcan abundante residuo
no digerible, tales como:
i. Fibras vegetales (P.ej., legumbres, frutos de cutcula gruesa)
ii. Granos (P.ej., frutas con semillas abundantes y pequeas, tales como la frutilla u
otros frutos del bosque).
iii. Polen.
2 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras habituales
2.1 Mtodo recomendado por la OMS para estudios coproparasitolgicos
2.1.1 Recoleccin
Se debe recolectar la materia fecal recin emitida en un frasco con fijador en
forma seriada (las muestras nicas tienen una sensibilidad de alrededor del 60%). En
casos de que las deposiciones sean formes o blandas se recomienda recolectar 3
muestras en das alternos en un lapso de 7 das, siempre de aquellas zonas ms
llamativas. En aquellos pacientes con diarrea aguda se recomiendan tomar 3 muestras
seriadas, y aquellos con diarrea crnica 6 muestras alternas en un lapso de 12 das. Las
materias fecales tienen que ser homogeneizadas por el paciente con una esptula o
elemento similar. En todos los casos la cantidad de muestra a recoger ser de una
cucharita del tamao de las de t.
En caso de emitir heces mucosanguinolentas se recomienda enviarlas en fresco
(sin fijador) al laboratorio inmediatamente despus de emitidas o conservarlas a 4 C y
enviarlas dentro de las 24hs.
Si se observan estructuras similares a parsitos adultos, se deben recoger en
frascos con agua o fijador y remitirlas al laboratorio.
2.1.2 Preservacin
Los fijadores habitualmente empleados para la preservacin de muestras
coproparasitolgicas incluyen: formol al 5% en agua o solucin fisiolgica; alcohol
polivinlico, PVA; fenol-alcohol-formol, PAF; acetato de sodio-cido actico-formol.
SAF o; merthiolate-iodo-formol, MIF) en una proporcin de 1 parte de heces por cada 3
partes de fijador (aproximadamente el volumen final no debe exceder la mitad del
volumen del fijador). No debe estar mezclado con orina u otro lquido.
2.1.3 Transporte
Las muestras fijadas pueden ser transportadas y permanecer utilizables para el
diagnstico por meses a temperatura ambiente o refrigeradas a 4 C. Se recomienda
dividir la muestra y recogerla por un lado en Formol 5% y por el otro en PVA y/o SAF,
debido a que estos fijadores presentan ventajas y desventajas complementarias. El
formol preserva mejor morfologa de huevos de helmintos y larvas; PVA y SAF son en
general ms adecuados para realizar coloraciones permanentes de trofozotos y quistes
de protozoarios. El formol, fijador habitual empleado en el diagnstico
coproparasitolgico, tiene la ventaja adicional de desodorizar las muestras.

2.2 Examen de heces seriado de 6 muestras con tcnica de Deschiens
En un frasco de boca ancha con solucin de formol al 5% se recolecta una
muestra (una cucharadita) de materia fecal por da, de las porciones que llamen ms la
atencin (con moco, pus, sangre, etc.), hasta completar las 6 muestras. No es necesario
que sean en das consecutivos.
Ventajas del mtodo:
i. El formol desodoriza y fija el material.
ii. Puede enviarse a distancia.
iii. Al ser seriado pone a cubierto las fases negativas de protozoarios (descargas
cclicas de quistes).
Desventajas del mtodo:
i. El formol no preserva los trofozotos de protozoarios (en este caso puede
reemplazarse por PVA).



2.3 Examen de heces frescas: tcnica de Neghme
Se recolecta una sola muestra de materia fecal en solucin fisiolgica; debe
remitirse rpidamente al laboratorio y procesarse en el da (observacin inmediata o
fijacin para ulterior observacin).
Ventajas: Se pueden reconocer las formas vegetativas de los protozoarios.
Desventajas: No es seriado.

2.4 Mtodos especiales de diagnstico-Enterobius vermicularis y Taenia spp
2.4.1 Mtodo de Graham-Garaguso para E.vermicularis
2.4.1.1 Preparacin del enfermo
En todos los casos debe evitarse:
i. El aseo de la regin anal y perianal antes de la realizacin de la obtencin de
la muestra; esto reduce la sensibilidad del mtodo.
ii. El uso de talcos, aceites o cremas en la regin afectada durante el perodo
que abarque la recoleccin de las muestras.
2.4.1.2 Recoleccin, preservacin y transporte de la muestra.
Se entregan 6 portaobjetos con cinta adhesiva de celofn adherido a estos, y 6
esptulas bajalenguas. El mtodo que se describe es adecuado para el diagnstico de
enterobiosis en nios. Se deben tomar 6 muestras seriadas por las maanas sin previa
higiene del margen anal, de la siguiente manera:
i. Despegar la cinta adhesiva del portaobjetos y enrollarla en la esptula
bajalenguas. La faz adhesiva debe quedar expuesta hacia afuera. El paciente en
decbito ventral, debe separar los glteos.
ii. Se debe aplicar repetidamente la faz adhesiva en la regin anal y perianal.
iii. Pegar la cinta adhesiva sobre el portaobjetos, a modo de cubreobjetos.
En adultos se recomienda reemplazar el procedimiento previo por el que se
describe a continuacin, para el cual se entregan al paciente 5 gasas dobladas de 5x5
cm, aproximadamente, y un frasco de formol al 5%. Las muestras se toman
seriadamente durante 5 das:
i. El paciente en decbito ventral, debe separar los glteos.
ii. Pasar la gasa, previamente humedecida en agua o solucin fisiolgica, por el
ano y la regin perianal en forma repetida.
iii. Colocar todas las gasas en el mismo frasco de formol.
Debe tenerse en cuenta que los huevos de E. vermicularis son altamente
infecciosos, por lo que deben extremarse las precauciones de higiene durante y despus
de la toma de muestra.

2.4.2 Recoleccin y preservacin de progltides y adultos de nematodes
Ante la sospecha de infeccin por adultos de nematodes y de progltides de
cestodes intestinales del gnero Taenia debe proveerse al paciente un frasco con
formalina o solucin salina. No deben emplearse fijadores como el etanol
(frecuentemente empleado en estos casos), ya que opacan la cutcula y dificultan la
identificacin de la especie. Eventualmente, el paciente puede emplear agua corriente.
Si se emplea agua o solucin salina la muestra debe ser refrigerada y enviarse sin
demora al laboratorio. Debe tenerse en cuenta que el mantenimiento de adultos de
nematodes o progltides en solucin fisiolgica preserva la viabilidad de los huevos,
siendo altamente infecciosos para el humano en el caso de T. solium, H. nana y E.
vermicularis.


3 . Recoleccin, transporte y procesamiento de muestras para estudios especiales
3.1 Recoleccin de fluidos y tejidos
De acuerdo al cuadro clnico y al diagnstico presuntivo, las formas evolutivas
de los parsitos intestinales pueden ser investigadas en:
i. Lquido duodenal.
ii. Biopsias de intestino delgado o colon obtenidas mediante endoscopa.
iii. Esputo.
iv. Filtrado de materia fecal.
La obtencin de estas muestras, complementarias a los estudios habituales,
requiere la intervencin del mdico especialista, generalmente un gastroenterlogo. Se
reservan para situaciones clnicas particulares (P.ej., coproparasitolgicos negativos en
pacientes con sospecha fundada de giardiosis, amebosis, estrongiloidosis).
En el caso de aspirados de lquido duodenal o esputo, estos deben colocarse en
un tubo de vidrio o plstico transparente, limpio y seco. La cantidad de la muestra es de
2-5 ml y deber transportarse de modo inmediato al laboratorio o, en su defecto,
refrigerarse a 4 C por un tiempo no mayor a las 4 horas.
Las biopsias se recogern en solucin fisiolgica o paraformaldehdo al 4% para
su ulterior preparacin histolgica con fines de microscopa de campo claro,
fluorescencia o electrnica.

3.2 Mtodo de la cpsula de Beal o Enterotest
Consiste en hacerle tragar al paciente una cpsula con gelatina unida a una
cuerda de nylon. La cpsula llega al duodeno y despus se la retira y se observa el
material mucoso duodenal. Se emplea para identificar trofozotos de Giardia intestinalis
y larvas de Strongyloides stercoralis.

3.3 Recoleccin de material y deteccin de antgenos y/o cidos nucleicos en
materia fecal (recomendaciones del CDC)
3.3.1 Deteccin de antgenos de protozoarios en materia fecal: Por regla general
deben consultarse las condiciones de recoleccin y preservacin sugeridas por
el fabricante del equipo que se emplear para el diagnstico (materia fecal
fresca, fijada o congelada). La deteccin de coproantgenos parasitarios se
realiza tanto mediante ELISA como por inmunocromatografa. Antgenos
particulados (p.ej., quistes de protozoarios intestinales) pueden detectarse
mediante inmunofluorescencia directa. Se desaconseja el uso de PVA y los
mtodos de concentracin, en el caso de deteccin de antgenos de Giardia
intestinalis mediante ELISA.
3.3.2 Deteccin de cidos nucleicos: Las muestras deben recogerse en ausencia de
fijadores y enviarse refrigeradas o congeladas (hielo seco). Como alternativa,
las muestras se pueden mezclar en proporcin 1:1 con dicromato de potasio o
etanol absoluto y enviarse refrigeradas. Para protozoarios intestinales, se
recomienda previamente hacer tinciones y examinarlas microscpicamente; en
caso de identificar al parsito por morfologa, la PCR no se realiza. Es
necesario realizar la extraccin del ADN de la muestra de materia fecal previo
a la realizacin de la PCR.





II. PARSITOS DE SANGRE Y TEJIDOS
Ficha tipo: Nombre y apellido. Edad. Lugar de nacimiento. Residencia actual y
anteriores Tipo de vivienda y caractersticas de los alrededores. Viajes recientes.
Animales domsticos. Personas parasitadas en la vivienda (si es nio, es de especial
inters conocer los antecedentes maternos). Ingesta de carnes mal cocidas. Origen del
agua. Reconocimiento de vectores y su presencia en el domicilio o alrededores. Fecha
de comienzo de la enfermedad y diagnstico clnico presuntivo.

Preparacin del paciente
Para la preparacin del enfermo que va a ser investigado, ante la sospecha de
infeccin de parsitos de sangre y tejidos. deben cumplirse las normas generales de
higiene y antisepsia relativas a la obtencin de muestras de sangre y biopsias. Sin
embargo, se justifican algunas precisiones:
En el caso de muestras de sangre para serologa se aplica el requisito de un
ayuno mnimo para evitar el exceso de lpidos que pudieran interferir en los mtodos de
inmunodiagnstico. Sin embargo, este requisito no es necesario si se obtuviera la
muestra de sangre para realizar un diagnstico directo (P.ej., para tripanosomosis
americana, malaria o filariosis).
En el caso de biopsias cutneas o transcuneas, la piel debe ser adecuadamente
lavada con agua y jabn y desinfectada con iodo-povidona o etanol 70 %, antes de
realizar el procedimiento quirrgico (o aspirado en el caso de biopsia de mdula sea o
ganglios linfticos).

1 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras
1.1 Sangre
1.1.1 Recoleccin
1.1.1.1 Puncin digital
Limpiar del pulpejo del dedo medio (mano izquierda si el paciente es diestro o
viceversa), con alcohol 70%, dejar evaporar y punzar el pulpejo con lanceta o aguja
estril (de preferencia en la cara lateral del dedo). En casos peditricos se puede emplear
el mismo procedimiento para punzar el taln
1.1.1.2 Puncin venosa
Se recogen dos muestras, una sin anticoagulante para estudios serolgicos y otra
con anticoagulante en condiciones estriles, esta ltima muestra se emplear para
realizar estudios de diagnstico directo (inocular medios de cultivo o animales), y
realizar el examen microscpico en fresco con o sin previa concentracin. Las muestras
para la determinacin directa de un hemoparsito debern ser remitidas al laboratorio de
manera inmediata, a temperatura ambiente (22-25 C). Los materiales necesarios
incluyen: Agujas y jeringas descartables estriles, algodn, alcohol, capilares
heparinizados, tubos de ensayo, heparina, portaobjetos y cubreobjetos, plastilina,
centrfuga para microcapilares y/o centrfuga clnica.

1.1.2 Procesamiento
En el caso de investigacin de la muestra en fresco, sta debe ser estudiada de
modo inmediato para limitar la prdida de sensibilidad, debido a la muerte de parsitos.
Por el contrario, las muestras fijadas y coloreadas pueden ser enviadas con tiempo al
laboratorio de referencia para su evaluacin.
1.1.2.1 Gota fresca (si se sospecha una tripanosomosis o filariosis)
Colocar una gota entre porta y cubre-objeto y revisar microscpicamente el
preparado recorrindolo totalmente en guarda griega. Si la muestra no se observara de
manera inmediata, conviene recoger sangre con heparina u otro anticoagulante en un
tubo y preparar la gota fresca en el momento de realizar la observacin. El
reconocimiento de los parsitos se basa en su morfologa y movimientos. Los
preparados deben ser observados nicamente con objetivos secos (4x-10x-40x). La
sensibilidad es baja porque la muestra no est concentrada.
1.1.2.2 Extendidos o frotis (para tripanosomosis, filariosis, paludismo y babesiosis)
Sobre un extremo de un portaobjeto seco, previamente desengrasado con una
mezcla de alcohol-acetona, se coloca una pequea gota de sangre. La misma se
extiende, ayudndose con un segundo portaobjeto que se colocar por delante, pero
contactando la gota de sangre en un ngulo de 45 aproximadamente y que servir para
deslizarla formando una fina pelcula. Dejar secar y transportar al laboratorio para su
fijacin y tincin con colorantes adecuados (May-Grnwald-Giemsa o Wright-Giemsa).
Al igual que la gota fresca, esta tcnica tiene baja sensibilidad. Sin embargo, permite
visualizar detalles morfolgicos de los parsitos y ser mantenida como registro
permanente.
1.1.2.3 Gota gruesa (para tripanosomosis, filariosis y paludismo)
Colocar sobre el centro del porta una gota de sangre bastante grande; sobre ella
se agregarn 1 a 3 ms, segn el espesor de las gotas que se extraigan. Con el ngulo de
otro portaobjetos efectuar sobre las gotas un movimiento espiral desde el centro hacia la
periferia raspando la superficie del portaobjeto. Extender la superficie de las gotas
durante uno a dos minutos. De esta manera se desfibrinar la sangre y se extender la
gota con un dimetro de 2 a 2,5 cm. Dejar secar y enviar al laboratorio para su tincin
con Giemsa diludo sin fijacin previa. Es una tcnica de sensibilidad mayor que las
anteriores, pero tiene peor definicin de las estructuras parasitarias.
1.1.2.4 Microhematocrito
Tomar sangre del pulpejo del dedo (o del taln) y cargar varios capilares
heparinizados (en general se emplean seis microcapilares por paciente). Sellar un
extremo con plastilina o calor y centrifugar a 1500-2500 rpm por 5 minutos. Si no se
puede proceder a centrifugar inmediatamente, conviene tomar una muestra de sangre
heparinizada en tubo y preparar con ella los microhematocritos en el momento de
procesarlos. Luego de centrifugado se obtienen 3 fases: plasma, leucocitos y eritrocitos.
Los tripomastigotes sedimentan junto con los leucocitos. Se observa microscpicamente
la fase leucocitaria entre portaobjetos y cubreobjetos. Es la tcnica de eleccin para el
diagnstico directo de transmisin congnita de enfermedad de Chagas. Tiene una
sensibilidad de 90-95% en la infeccin aguda.
1.1.2.5 Xenodiagnstico (se utiliza para T. cruzi)
Se emplean 40 ninfas de T. infestans de tercer estadio, con ayuno previo de 15
das, repartidas en 4 cajas (10 insectos por caja). Las cajas se cubren con una gasa bien
fijada y se colocan simultneamente durante 30 min. en antebrazos y/o muslos del
paciente. Se investigar el contenido intestinal de los insectos durante un lapso de 45-60
das. Este mtodo slo es usado en casos especiales en los centros de referencia, pues es
laborioso y caro, pero su sensibilidad es cercana al 100% en la fase aguda de la
infeccin.
1.1.2.6 Deteccin de antgenos en sangre mediante inmunocromatografa
Se emplea para identificar gnero y especie de Plasmodium (P. vivax y P.
falciparum). Sangre obtenida por puncin digital es lisada en solucin hipotnica,
liberando antgenos parasitarios. Los antgenos reaccionan en fase lquida con
anticuerpos especficos marcados con oro coloidal. Los complejos inmunes migran en
una tira de papel (o dentro de un cassette) y se unen a anticuerpos especficos de
captura, unidos covalentemente a la tira de papel. La reaccin es positiva si se observan
bandas coloreadas, aparte de la correspondiente al control positivo.
1.1.2.7 QBC (Quantitative buffy coat o mtodo de naranja de acridina)
Es una tcnica para detectar infeccin por Plasmodium y Babesia en muestras de
sangre. La sangre se recoge en un tubo capilar con sus paredes internas recubiertas del
fluorocromo naranja de acridina. Este fluorocromo se intercala en el ADN. Luego de
centrifugar el capilar en una microcentrfuga, se observan los parsitos fluorescentes en
los eritrocitos que se concentran debajo de la interfase leucocitaria, empleando un
microscopio provisto de luz UV. Esta prueba tiene como ventajas ser ms rpida y ms
sensible que la gota gruesa.

1.2 Tejidos slidos
1.2.1 Recoleccin
1.2.1.1 Obtencin por puncin con agujas finas
Esta tcnica se utiliza habitualmente para el diagnstico de leishmaniosis
visceral, para la cual se obtiene muestras por puncin-aspiracin generalmente de
mdula sea (esternn o cresta ilaca) y excepcionalmente de bazo, ganglios o hgado.
1.2.1.2 Mediante acto quirrgico a partir de rganos
Se pueden obtener muestras de todo tipo de rganos (pulmn, ganglios, hgado,
bazo, piel, tejido celular subcutneo, etc), dependiendo del parsito sospechado.

1.2.2 Procesamiento
1.2.2.1 Frotis
Con los aspirados de mdula sea, ganglio o bazo se pueden realizar extendidos.
En estos es posible identificar Leishmania donovani mediante microscopa de campo
claro, con los colorantes habituales para hematologa, o microscopa de fluorescencia,
empleando anticuerpos conjugados con fluorocromos.
1.2.2.2 Improntas
El material obtenido mediante ciruga (p.ej., ganglios, bazo, hgado) puede
emplearse para realizar improntas. Luego de obtener la pieza, se elimina la sangre
superficial por aposicin sobre papel de filtro. Las improntas se tien con colorantes
habituales para hematologa.
1.2.2.3 Cortes histolgicos
Para microscopia ptica (de campo claro o de fluorescencia) o electrnica.
Actualmente, algunos laboratorios tambin realizan tcnicas de biologa molecular
sobre el material de biopsia (PCR e hibridizacin in situ), pero su empleo an no est
normatizado.