ELISA (ENZYME LINKED INMUNO SORBENT ASSAY)

FUNDAMENTO. Procedimiento inmunoenzimtico que recurre al empleo de

inmungenos, haptenos o anticuerpos marcados con una enzima, para revelar el
reactivo complementario a nivel de distintos fluidos biolgicos. Al estar uno de los
componentes (Ag o Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoabsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por
tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un sustrato especfico que al
actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante
el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.
El procedimiento se efecta fundamentalmente mediante mtodos indirecto,
competitivos o de doble anticuerpo.


MTODO INDIRECTO

Se fija el Ag a la fase slida, agregndose luego al sistema la muestra del
paciente (sospechosa de contener el Ac homlogo).
Se agrega anti-Ig elaborada contra el primer Ac, marcada con una enzima.
Se incorpora a la reaccin un sustrato de la enzima.
La concentracin de Ac presente en la muestra ser directamente proporcional
a la cantidad de producto enzimtico formado.

MTODO COMPETITIVO

Se basa en la competencia que se establece (por la ley de accin de masas)
entre un Ag marcado enzimticamente y el mismo Ag sin marcar, al ser
colocados frente a una cantidad limitada del Ac homlogo.
El procedimiento puede realizarse en un solo paso. El Ag marcado (reactivo
artificial) con un Ag no marcado (muestra) y colocando la mezcla en presencia
del Ac fijado a un soporte; o bien en varios pasos agregando primero el Ag no
marcado (muestra) y luego el marcado.
En ambos casos la cantidad de Ag marcado que se una al Ac ser inversamente
proporcional al Ag no marcado presente en la muestra analizada.

MTODO DEL DOBLE ANTICUERPO (MTODO SANDWICH)

Consiste en fijar a un soporte el Ac homlogo del Ag que se desea revelar,
agregando secuencialmente: a) la muestra sospechosa de contener este ltimo
reactivo, b) el Ac homlogo marcado enzimticamente, c) el sustrato de la
enzima.
La cantidad de Ac marcado que se fija al sistema ser directamente
proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra.



COMPONENTES BSICOS DE UN ENSAYO DE ELISA

Equipos
Materiales
Fase slida. Tiras con 8 12 micropozos o placas de 96 pozos,
elaboradas a base de poliestireno o cloruro de polivinilo en cuyo interior
se encuentra fijado el inmunoreactivo (Ag o Ac) que servir para
capturar al analito investigado en la muestra problema. La fase slida es
recubierta con una solucin bloqueadora que se encargar de detener
la interaccin Ag-Ac al agregar la muestra problema en los micropozos.
Reactivos.
Conjugados. Son el resultado de la unin covalente entre dos molculas
(una enzima y molculas de Ag o de Ac) segn sea el propsito del
ensayo. Para ensayos que detectan Acs: especficos contra un
determinado Ag, los conjugados consisten en anti Ig-enzima o bien de
un sistema avidina-biotina, en el cual los Acs anti Igs son conjugados con
biotina, y la enzima se conjuga con la avidina. Antgenos policlonales:
anti Igs que provienen de animales inmunizados con Igs heterlogas. Ag
Monoclonales: cuando provienen de hibridomas.
Enzimas: peroxidasa de rbano picante (HRP) y fosfatasa alcalina
Sustratos. Para fosfatasa alcalina (cromognico) se utiliza una solucin
alcalina de p-nitrofenilsustrato, con la cual se obtiene un producto
coloreado de color amarillo.
Para HRP (no cromognico), el sustrato es una solucin de perxido de
hidrgeno, mezclada con una solucin tampn de pH cido que
contiene alguno de los siguientes cromgenos: ABTS, OPD o
tetrametilbenzadiacina (TMB).
Solucin de parada y solucin de lavado. La solucin de parada es la que
se agrega al final del ensayo para detener la interaccin de la enzima
con el sustrato y por ende, detener la formacin de los complejos
enzima-sustrato. Se utiliza cido sulfrico.


APLICACIONES CLNICAS DE ELISA

Cuantificacin de IgG
Cuantificacin de gonadotrofina
Revelacin y cuantificacin de Acs, inmungenos y haptenos
Bsqueda de anticuerpos en enfermedades bacterianas, micsicas, parasitarias
y virsicas.









H
2
O
2
-
T
M
B

VARIABLE DIRECTA TIPO
SANDWICH
VARIABLE INDIRECTA VARIABLE INDIRECTA
1. Reaccin Ag-Ac






2. Reaccin de deteccin
Ag-Ac







3. Reaccin E-S (reaccin
enzimtica)







4. Incubacin
5. Solucin de parada
6. lectura


1. Reaccin Ag-Ac







2. Reaccin de deteccin
Ag-Ac








3. Reaccin E-S (reaccin
enzimtica)








1. Reaccin Ag-Ac






2. Reaccin de deteccin
del Ac








3. Reaccin E-S (reaccin
enzimtica)
Micropozos recubiertos con:
1. Ac monoclonales anti-Ag S
VHB.
Muestra problema:
1. Suero o plasma (Ag S VHB)
Conjugado:
1. Anticuerpos anti Ag S
VHB-PRP
Micropozos recubiertos con:
1. Ac monoclonales anti-IgG
e IgM humanas (Ag de
captura)
Muestra Problema:
1. Ac contra HIV
2. IgG-IgM especfica contra
el Ag.
Conjugado:
1. Conjugado Ag especfico
(da especificidad)
marcado con una enzima.
Micropozos recubiertos con:
1. Protenas Purificadas
2. Pptidos recombinantes
3. Pptidos sintticos

Deteccin y/o cuantificacin de Ags
de diversa naturaleza. Los Ac
especficos contra el Ag son fijados
a la fase slida; el conjugado son Igs
especficas contra el Ag marcada
con la enzima.
Deteccin de Ac especficos contra
Ags de diversa naturaleza y origen.
Los anti-Igs de captura estn fijados
a la fase slida, contra las Igs
especficas a ser detectadas; el
conjugado es el Ag especfico
marcado con la enzima.
Deteccin de Acs especficos contra
Ags de naturaleza y origen diverso.
El Ag est fijado a la fase slida y el
conjugado consiste de anti-Igs-
enzima.


H
2
O
2
-
T
M
B

H
2
O
2
-
T
M
B

VARIANTE COMPETITIVA
MTODO DIRECTO (DETECTA Y/O CUANTIFICA AG)

1. Fase slida recubierta con anticuerpos homlogos (Ac anti-T4, en el caso de
TSH).
2. El Ag sin marcar (SUERO) competir con el Ag marcado (Ag-Enzima) por el sitio
de unin Fab en el Ac homlogo inserto en la fase slida.



















A mayor concentracin de Ag, menor absorbancia
A mayor color de la muestra, menor concentracin de Ag. Esto ocurre debido a que
los Ags marcados con la enzima ocuparon las regiones Fab en el Ac, desplazando al Ag
no marcado por gradiente de concentracin, por ende, se podr evidenciar mayor
coloracin de la muestra con una menor concentracin del Ag ensayado.
La formacin de color es inversamente proporcional a la concentracin del Ag a
ensayar.
Misma Naturaleza
Ag sin marcar Ag marcado
H
2
O
2
-HRP
Coloracin (-). Negativa

Incoloro (+). Positiva
1
2
3
Solucin de parada