MICROSCOPA

MICROSCOPA.
Fundamento: formacin de imgenes a partir de un
especmen.
Tcnica que permite observar objetos con un
microscopio (simple o compuesto) para obtener una
imagen aumentada .
AUMENTO/ RESOLUCIN.
El objeto a estudiar (preparado histolgico por
ejemplo),
fuente de iluminacin,
sistema ptico.
QU ES UN MICROSCOPIO?
Instrumento ptico
destinado a observar
objetos extremadamente
diminutos.
Todos producen imgenes,
pero los mecanismos
utilizados para generarlas
son diversos.
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TIPOS.
Microscopios fotnicos
Campo claro.
Contraste de fases.
Campo oscuro.
Fluorescencia.
Microscopio
confocal.
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Microscopios
electrnicos.
MET y MEB.
Microscopios de campo
prximo.
Fuerza atmica.
Efecto tnel.
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MICROSCOPIO CAMPO CLARO.
Observacin de especmenes.
Morfologa microscpica
Afinidad tintorial.
Poder de resolucin.
Objetivos 10X, 40X y 100x
(inmersin).
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MI CROSCOP A CAMPO CLARO
MICROSCOPA DE CONTRASTE DE FASES.
Visualizar clulas sin teir y en estado
vivo.
ndice de refraccin de la luz.
Aprovecha las pequeas diferencias de
los ndices de refraccin en las distintas
partes de una clula y en distintas partes
de una muestra de tejido.
Partes oscuras corresponden a porciones
densas del espcimen; partes claras
corresponden a porciones menos
densas.
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MICROSCOPA DE
CONTRASTE DE FASES.
MICROSCOPA CAMPO
OSCURO.
Haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un
cono hueco concentrado
sobre el espcimen.
El objeto iluminado dispersa
la luz y se hace as visible
contra el fondo oscuro que
tiene detrs.
Observacin de clulas vivas
y mviles.
MICROSCOPA CAMPO
OSCURO.
MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA.
Utilizacin de fluorocromos.
Fuente luminosa que emite radiaciones ultra-
violeta (a una determinada longitud de onda).
Imagen observada: resultado de radiacin
electromagntica emitida por molculas que
han absorbido excitacin primaria y reemitido
luz con mayor longitud de onda.
Lentes de cuarzo.
Epifluorecencia.
Espcimen fluorescente con el fondo oscuro.
FLUOROCROMOS.
Pueden usarse directamente,
aprovechando la propiedad de
unirse a determinadas
molculas.
Conjugados a otras molculas,
como anticuerpos, capaces de
unirse de modo especfico a
estructuras concretas de la
clula.
Tienen la propiedad de ser
excitados (pasar a un nivel
superior de energa) cuando
absorben luz ultravioleta (luz
de longitud de onda corta).
PRINCIPALES FLUOROCROMOS
EMPLEADOS EN INMUNOFLUORESCENCIA.
ESPECTROS DE ABSORCIN Y EMISIN.
Fluorocromo Longitud de
onda de
absorcin
(nm)
Longitud de
onda de
emisin
(nm).
Cascade blue 374- 403 422- 430
Fluorescena (FITC) 494 520
Rodamina (TRITC) 540 570
Naranja de acridina 460- 502 526- 650
Yoduro de propidio 536 617
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MICROSCOPA DE
FLUORESCENCIA.
MICROSCOPA CONFOCAL.
Fuente de luz: Lser.
Sistema para captacin y
procesamiento de
imgenes.
Permite realizar cortes
pticos finos a muestras de
tejidos ms o menos
gruesos y realizar
reconstrucciones 3D a
partir de cortes seriados.
Enfoque a un solo plano.
MICROSCOPA CONFOCAL.
Izquierda:
hipotlamo de
ratn, centro:
msculo liso de
rata (dobles y
triples marcajes).
Derecha: grano de
polen de girasol el
cual es
autofluorescente.
MICROSCOPA CONFOCAL.
Reconstrucciones
tridimensionales a partir de
cortes pticos.
(a) grano de polen,
(b) hgado de ratn,
(c) corteza cerebral de rata.
(d) auto fluorescencia de una
porcin de raz de
helecho.
Las reconstrucciones
fueron realizadas a partir
de series de 30-45 cortes
pticos.
MICROSCOPA ELECTRNICA.
Utiliza electrones.
Objetos de 0,001 m.
Cortes ultrafinos.
Preparacin de la muestra.
Contraste
Oxido de osmio
Tungsteno
Uranio.
Visualizar ultraestructuras
MICROSCOPA
ELECTRNICA.
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MICROSCOPIO ELECTRNICO
DE TRANSMISIN.
MICROSCOPIO ELECTRNICO
DE BARRIDO.
MICROSCOPA ELECTRNICA
DE TRANSMISIN (TEM).
Se observa a travs del
espcimen (trans- iluminacin).
Lminas ultrafinas (en el orden
de nanmetros) que se colocan
en una rejilla de cobre, la cual
es bombardeada con un haz de
electrones enfocado.
Una silueta del espcimen se
proyecta en una pantalla
fluorescente o placa fotogrfica
situada por debajo del mismo.
Resolucin: 0,2nm.
MICROSCOPA ELECTRNICA
DE BARRIDO (SEM).
Se observa la superficie de un
espcimen slido (epi-
iluminacin).
Se puede lograr una resolucin
de 10nm y un aumento hasta
de 20.000x.
Imgenes en 3D gracias a una
mayor profundidad de campo.
Se escanea la superficie del
espcimen con un haz de
electrones (primarios) y los
electrones que rebotan
(secundarios) son recogidos
por un detector.
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Kirov et al ., 2002.
MICROSCOPA DE FUERZA
ATMICA.
Aguja cargada, emite
electrones: se dobla al
desplazarse sobre la
muestra, detectando
irregularidades en la
superficie, palpando la
muestra y por ende su
forma.
Definicin a nivel
subatmico.
Imgenes 3D
Instrumento mecano-ptico
similar al microscopio de efecto
tnel.
Se captura la informacin
proveniente de la fuerza magntica
de superficie de la muestra
logrndose ver molculas muy
pequeas y tomos.
Aplicaciones en biologa celular
MICROSCOPA DE FUERZA
ATMICA.
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MICROSCOPA DE CAMPO PRXIMO.
EFECTO TNEL.
Tambin denominados de sonda de barrido (scanning
probe microscopes).
Nanociencia.
Se constituyen bsicamente de una plataforma y una
sonda o aguja fina que recorre la superficie de la muestra
con gran precisin (escaneo o barrido).
El filamento se coloca muy cerca (a 1 nm) del objeto ,
generando corriente elctrica y se desplaza por la
superficie, captando electrones que se escapan en lo que
se llama efecto tnel.
Los electrones saltan de la punta a la muestra y viceversa.
La corriente del efecto tnel vara dependiendo de la
distancia entre la sonda y la muestra.
Reproduccin de la topografa o relieve de la muestra con
una alta resolucin.
Propiedades qumicas, elctricas, mecnicas o fsicas de la
microestructuras o nanomateriales
MICROSCOPA DE EFECTO
TNEL.
Corral cuntico.
MICROSCOPIO DE IONES EN
CAMPO.
Los ejemplares se observan en una
cmara de alto vaco que es cargada
con un gas como el helio o el nen.
La muestra se congela y se aplica
voltaje positivo; los tomos del gas se
ionizan y el material provoca una
magnetizacin que repele los iones,
los cuales chocan sobre un detector
que recoge la informacin,
obtenindose as una imagen de alta
definicin por los iones gaseosos
rechazados.
Anlisis de tomos, nanomateriales y
elaboracin de microsondas para
microscopios de barrido con sondas.
Obtencin de imgenes muy ntidas a
escala atmica.
DUDAS?
COMENTARIOS?
RIAG
Gracias por su atencin.