Anlisis de polimorfismos mediante marcadores VNTR para el Locus D1S80.

Prez R.S., Rubio K.T., Toro Y.M., Escuela de Bioqumica, Facultad de Ciencias,
Universidad San Sebastin, Concepcin Chile, Junio 2014.
Resumen: Se extrajeron clulas epiteliales descamativas desde la mucosa oral,
pasndolas por un proceso de incubacin y hervor con resina Chelex para extraer
y proteger el material gentico, el DNA de la muestra fue amplificado por PCR
dirigida al locus D1S80 que presenta una regin altamente polimrfica. Finalmente
se realiz el anlisis de los polimorfismos por electroforesis en un gel de agarosa al
1,5% no visualizndose los resultados esperados, se presume que pudo haber
degradacin del DNA en el proceso previo a la electroforesis, probablemente por
mal estado de la resina Chelex y/o discontinuidad en el hervor de la muestra
biolgica con la resina.
Palabra clave: VNTR, Polimorfismos, D1S80.
Abstract: Scaly epithelial cells were extracted from the oral mucosa, by passing
them through an incubation process and boiling in Chelex for extracting and
protecting genetic material, the sample DNA was amplified by PCR directed to the
locus D1S80 having a highly polymorphic region . Finally, the analysis of
polymorphisms was performed by electrophoresis in agarose gel 1.5% not displayed
the expected results, it is presumed that DNA degradation may have in the process
prior to electrophoresis, probably messed up the Chelex resin and / or discontinuity
in the boiling of the sample with the resin.
Keyword: VNTR, Polymorphisms, D1S80.
Introduccin
El ADN presenta regiones
codificantes que son esencialmente
iguales entre individuos de una misma
especie y regiones aparentemente
silenciosas, sumamente abundantes,
las cuales pueden variar de un
individuo a otro. A estas regiones de
les denomina polimrficas. El genoma
humano contiene cientos de
segmentos altamente polimrficos
(aproximadamente el 25%),
caracterizados por la repeticin en
tndem en nmero variable de ciertas
secuencias. Estos segmentos se
denominan VNTRs (Villalobos Torres,
1999) (Repeticiones en Tndem de
Nmero Variable) se caracterizan por
presentar una organizacin tal que
segmentos de ADN similares
(unidades de repeticin) que se
encuentran dispuestos en tndem en
nmeros variables de veces
(constituyendo los diferentes alelos) y
flanqueados por secuencias no
redundantes. En estas ltimas se
hallan secuencias adecuadas para la
unin de pequeas secuencias
iniciadoras (primers), que posibilitan la
polimerizacin del fragmento
complementario a la secuencia de
inters por medio de la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).
(Tosto, 2014).
La PCR es una tcnica de
amplificacin in vitro de pequeas
secuencias de DNA que permite
sintetizar millones de copias idnticas
a partir de una cadena nica
basndose en la facilidad que posee el
DNA para desnaturalizarse y
renaturalizarse. Para la sntesis del
DNA se utilizan primers en
combinacin con una DNA polimerasa
termoestable que incorpora dNTPs.
Esta reaccin se lleva a cabo en un
termociclador que realiza ciclos
automticos de tres temperaturas
(95C para desnaturalizar el DN 50-
65C para acoplamientos de los
primers y 72C para la elongacin)
realizando alrededor de 30 ciclos que
proporciona finalmente una cantidad
suficiente de DNA para el anlisis
directo sin necesidad de utilizar
sondas, mediante electroforesis en
gel. El locus hipervariable D1S80 fue
inicialmente identificado por la sonda
pMCT118. (Mullis KB, 1987) Se
localiza en el brazo corto del
cromosoma 1 y tiene una segregacin
autosmica codominante (Nakamura
Y, 1989), contiene secuencias de DNA
repetidas en tndem (VNTR) la cual se
repite tiene un tamao de 16 pb de
longitud y los alelos tienen tamaos
variables desde 350 a 1000 pb en
donde ms de 22 alelos diferentes han
sido identificados y con repeticin de
unidades desde 14 hasta 50 veces
(Villalobos Torres, 1999). El objetivo
principal de este trabajo fue
comprender la utilidad de los
marcadores moleculares VNTR
mediante el anlisis de polimorfismo
del alelo D1S80 con PCR y luego
electroforesis para su visualizacin.





Metodologa
Extraccin de DNA: Se extrajeron
clulas epiteliales desde la mucosa
oral con una trula de algodn,
incubando en agua bidestilada por 15
minutos a temperatura ambiente. Se
centrifug a 10000 rpm por 3 minutos,
se removi el sobrenadante y se
adicion 100 L de resina Chelex, se
dej incubar a 56C por 15 minutos, se
agit en vortex por 10 segundos a alta
velocidad. Se hirvi por 8 minutos y se
agit en vortex por 10 segundos. La
muestra fue centrifugada a 10000 por
3 minutos.
PCR: Para la realizacin de la PCR se
tom 2,5 L de la muestra obtenida de
la extraccin de DNA y se prepararon
en fro dos tubos de PCR unos con la
muestra y un control negativo segn la
tabla 1.
Tabla 1: preparacin para PCR
Reactivos Muestra
L
Control
L
Buffer
PCR 10x
2,5 2,5
MgCL2 1,0 1,0
dNTPs
2,5mM
c/u
4,0 4,0
PR1-
D1S80 50
M
1,0 1,0
PR2-
D1S80 50
M
1,0 1,0
H2O 12,5 15,0
ADN 2,5 --
TaqDNA
pol 5U/mL
0,5 0,5
Volumen
Final
25 25
Se program en termociclador la
secuencia expuesta en la tabla 2.
Tabla 2: Secuencia cclica de PCR
Ciclo 1 95C 10 min
Ciclo 2 95C 1 min
Ciclo 3 68 C 45 seg
Ciclo 4 72C 45 seg
Ciclo 5 Volver al
Ciclo 2 x
35
--
Ciclo 6 72 C 10 min
Ciclo 7 4 C Indef
Ciclo 8 End --

Electroforesis en gel de agarosa: se
prepar un gel de agarosa al 1,5%
disolviendo 3g de agarosa en 200 mL
de agua bidestilada y 2 L de
colorante MaestroGEN y se mont en
cmara de electroforesis horizontal.
La muestra y el control se prepararon
mezclando 10 L de los productos de
PCR y 2 L de Buffer 6x
respectivamente.
Se cargaron las muestras en los
carriles 5,6 (Por error) 6 L cada uno
de control negativo y carril 7 12 L de
muestra de ADN. Se hizo correr la
electroforesis por 45 minutos a 100 V
en un comienzo y luego se baj a 80
V. finalizado dicho tiempo se visualiz
el resultado por tramsiluminacin UV.
Resultados: En la figura 1 se observa
el resultado de la electroforesis en gel,
en los carriles 5 y 6 del control
negativo no hay bandas visibles. La
muestra de ADN en el carril 7 tampoco
mostr bandas. Solo se puede ver una
acumulacin de los partidores en
exceso en las bandas del final de los
carriles.

Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa 1,5% para
visualizacin de los polimorfismos de D1S80

Discusin: Los resultados obtenidos
no fueron los esperados pues no se
observaron las bandas
correspondientes de los posibles
polimorfismos del locus D1S80. En la
figura 2 se observa el resultado de un
individuo heterocigoto cuya
electroforesis arrojaron dos bandas en
450 y 550 pb aproximadamente.

Figura 2: Resultado esperado electroforesis en gel de
agarosa 1% para el polimorfismo del locus D1S80
El anlisis de los VNTR pudo haber
fallado en la accin de la resina Chelex
cuya funcin es proteger y estabilizar
el DNA frente a los factores de
degradacin por DNAsas presentes la
muestra bilgica, esta resina podra
haber estado en mal estado, o bien el
proceso en que haba que hervir la
muestra con Chelex por 8 minutos no
alcanz la temperatura de ebullicin o
no fue continua la exposicin de la
muestra a estas condiciones, pues en
varias ocasiones los tubos se abrieron
y hubo que retirarlos para su cierre.
Con estas posibilidades se puede
suponer que el DNA pudo haberse
degradado antes de entrar a PCR,
pues no se observ DNA genmico en
la imagen electroforesis es decir, el
DNA se degrad y no pudo ocurrir la
amplificacin y es por esto que en la
parte inferior de la electroforesis se ve
una gran acumulacin de partidores.
Por otra parte la electroforesis se sabe
que corri bien porque los marcadores
de tamao arrojaron las bandas
esperadas. Respecto al control
negativo es coherente nuestro
resultado sin bandas pues no contena
DNA que amplificar, lo que corrobora
la ausencia de material gentico al
comparar la similitud del resultado del
control con la muestra de DNA,
hubiese sido muy til usar un control
positivo para verificar nuestra
hiptesis que propone que la falla
estaba en etapa previa a la PCR.
Conclusin: No se obtuvieron los
resultados esperados para el anlisis
de polimorfismos D1S80. El resultado
de la electroforesis no es concluyente

Bibliografa:

Mullis KB, F. F. (1987). Specific
synthesis of DNA in vitro via a
polymerase catalyzed chain
reaction. Meth Enzymol, 155,
335-350.
Nakamura Y, C. M. (1989). Isolation
and Mapping of a Polymorphic
DNA Sequence (pMCT118) on
Chromosome lp (D1S80).
Nucleic Acids Research 16:
9364.
Tosto, D. (2014). Marcadores
Moleculares (fingerprinting) y
analisis de caracteres
humanos.
Villalobos Torres, Q. M. (1999).
Frecuencias alelicas de tres
marcadores genteicos
polimorficos en una muestra
de la poblacin del noreste de
Mexico. Mexico: Universidad
Autnoma Del Nuevo Leon.