Procesamiento de ARN

Muchos transcriptos de ARN son modificados antes de que funcionen correctamente en la clula.
Se conocen distintos tipos de modificacin:
Splicing;
Escisin nucleoltica;
Agregado de cap;
Poliadenilado;
Modificacin de bases y azcares;
"Edicin"
Splicing
Por splicing se entiende una serie de reacciones que dan lugar a la eliminacin de intrones del
transcripto primario. Estas reacciones consisten en la utilizacin de un enlace fosfodister para la
generacin de otro.

En el splicing caracterstico de los intrones del Grupo II, el grupo hidroxilo 2' de una adenina en el
intrn ataca la unin intrn-exn ubicada a 5'. El hidroxilo 3' liberado del exn ataca luego la unin
exn-intrn ubicada a 3', completndose la reaccin y liberando el intrn en forma de lazo(lariat).
En el splicing caracterstico de los intrones del Grupo I, el grupo hidroxilo de un nuclesido de
guanina ataca la unin intrn-exn ubicada a 5'. El hidroxilo 3' liberado del exn ataca luego la
unin exn-intrn ubicada a 3', completndose la reaccin. El intrn liberado es capaz de comletar
subsiguintes reacciones de transesterificacin.
Ambos mecanismos tienen, entonces, dos pasos esenciales. El primero es la ruptura de la unin
intrn-exn a 5', seguido por la ruptura respectiva en la unin ubicada a 3'.

El splicing de intrones nucleares no precisa de nuclesidos libres, ni de una estructura secundaria
conservada del ARN considerado. No obstante, requiere de un complejo consistente en 44 o ms
portenas y una serie de ARN nucleares pequeos (snRNAs - small nuclear RNAs). stos juegan el
rol de las estructuras secundarias de los intrones de los grupos I y II.
El splicing de intrones nucleares requiere secuencias internas especficas, enunciadas por la "regla
GT-AG", que describen los extremos del intrn. En forma adicional, se halla un "sitio de
ramificacin", con la secuencia UACUAAC en levaduras (menos conservada en mamferos).
Al igual que las reacciones autnomas descriptas para los intrones de los grupo I y II, el extremo 5'
del intrn es el primero en ser liberado, producindose una reaccin entre el exn a 5' y la unin
intrn-exn ubicado a 3'. Al igual que el tipo II, se produce un lazo por la reaccin entre el extremo
3' del intrn y el sitio de ramificacin.

Escisin nucleoltica
Los genes de algunos ARN de transferencia contienen 14 a 20 nucletidos en el brazo del
anticodn que no estn presentes en el ARNt maduro. Los transcriptos conteniendo intrones son
sustrato de una endonucleasa que escinde el ARN en cada extremo del intrn. La estructura
secundaria de los precursores de ARNt mantiene prximos los exones a 5' y 3' tras el corte.
Los extremos sueltos del ARNt cortado son ligados en una reaccin que requiere ATP.
Posteriormente, se da una modificacin de algunas bases a fin de completar la maduracin.
A diferencia de los intrones quitados por splicing, el procesamiento de los precursores de ARNt no
involura transesterificacin, y es precisa una fuente externa de energa.

El corte de un transcripto por una endonucleasa es tambin caracterstico de los precursores
deARN ribosomal: En procariotas, los extremos 5' de los ARNr 16S y 23S son generados por la
RNAsa C, una endonucleasa. De los ITS (Internal Transcribed Spacers - espaciadores internos
transcriptos) se generan precursores de ARNt. Un proceso semejante se da en Eucariotas. En
muchos casos, el correcto procesamiento depende de estructuras secundarias de los ARN
involucrados.
Varios ARN maduros pueden obtenerse del mismo transcripto. Un buen ejemplo de ello es el
genoma mitocondrial, que contiene un nmero reducido de promotores; de sus transcriptos se
generan ARN estructurales, ribosomales y de transferencia.

Modificaciones de los extremos del ARN mensajero
Los extremos 5' de transcriptos de RNA polimerasa II tienen estructuras especiales llamadascaps.
En la mayor parte de los eucariotas, se trata de una 7 - metilguanosina trifosfato, que es agregada
poco despus de la iniciacin de la transcripcin. Esto aumenta enormemente la traducibilidad de
estos ARNm, dado que el cap estimula la unin de ciertos factores de traduccin.

La poliadenilacin es el agregado de una cadena de cido poliadenlico (poliA) de 50 a 200
nucletidos en el extremo 3' del precursor de ARN mensajero. Esto requiere de un corte previo. La
seal consenso aislada es AAUAAA, a unos 10-30 nucletidos 5' del sitio poliA. Igualmente, se ha
observado un elemento rigo en GU o U a 3'.

Modificacin de bases y azcares
Algunas bases y azcares en los ARN llevan modificaciones, como ser metilacin. La metilacin
afecta residuos de adenina en ARNr, la guanina del cap, y el 2' OH de ribosas, presentes cerca
del cap en transcriptos de RNA polimerasa y algunas posiciones del ARNr.
Los ARNt en particular contienen una amplia variedad de bases modificadas, creadas por distintas
enzimas.
Las modificaciones proveen de una mayor riqueza de seales, ms all de los cuatro nucletidos
bsicos. En el caso de ARN mensajeros, no afectan la capacidad codificante de stos, si bien
existen cambios que afectan los patrones de lectura.

"Edicin" del ARN
En ciertos casos, se ha observado diferencias notables entre el transcripto primario y el ARN
mensajero a traducir. Esas diferencias son debidas a procesos de "edicin". Esta edicin puede
realizarse de dos modos:
Una o varias bases pueden haber sido cambiadas por otras, lo cual altera el mensaje por
cambios en los codones individuales.
Puede haber habido insercin o eliminacin de uno o varios nuceltidos, lo cual conduce a
cambios en el marco de lectura del mensajero.

Y SU TRADUCCION

La traduccin es el paso de la informacin transportada por el ARN-m a protena. La especificidad
funcional de los polipptidos reside en su secuencia lineal de aminocidos que determina su
estructura primaria, secundaria y terciaria. De manera, que los aminocidos libres que hay en el
citoplasma tienen que unirse para formar los polipptidos y la secuencia lineal de aminocidos de
un polipptido depende de la secuencia lineal de ribonucletidos en el ARN que a su vez est
determinada por la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN.
Los elementos que intervienen en el proceso de traduccin son fundamentalmente: los
aminocidos, los ARN-t (ARN transferentes), los ribosomas, ARN-r (ARN ribosmico y protenas
ribosomales), el ARN-m (ARN mensajero), enzimas, factores proteicos y nucletidos trifosfato
(ATP, GTP).
El primer paso que tiene que producirse es la activacin de los aminocidos y formacin de los
complejos de transferencia. Los aminocidos por s solos no son capaces de reconocer los tripletes
del ARN-m de manera que necesitan unirse a un ARN de pequeo tamao (constante de
sedimentacin 4S) llamado ARN adaptador, ARN soluble o ARN transferente. Crick (1958) postul
la necesidad de la existencia de un adaptador que acoplar cada aminocido a su correspondiente
codn.
ESTRUCTURA DE LOS ARN TRANSFERENTES (ARN-t)
Los primeros estudios sobre la estructura de los ARN-t se realizaron por R. W. Holley y col. (1965)
trabajando con el ARN-t de alanina de levaduras. A partir de sus trabajos se estableci el modelo
general de estructura de los ARN-t y por estas investigaciones recibi el Premio Nobel en (1968).
Las molculas encargadas de transportar los aminocidos hasta el ribosoma y de reconocer los
codones del ARN mensajero durante el proceso de traduccin son los ARN transferentes (ARN-t).
Los ARN-t tienen una estructura en forma de hoja de trbol con varios sitios funcionales:
Extremo 3': lugar de unin al aminocido (contiene siempre la secuencia ACC).
Lazo dihidrouracilo (DHU): lugar de unin a la aminoacil ARN-t sintetasa o enzimas
encargadas de unir un aminocido a su correspondiente ARN-t.
Lazo de T C: lugar de enlace al ribosoma.
Lazo del anticodn: lugar de reconocimiento de los codones del mensajero.
Normalmente el ARN-t adopta una estructura de hoja de trbol plegada en forma de L o forma de
boomerang.
Los ARN-t suelen presentar bases nitrogenadas poco frecuentes como son la pseudouridina (),
metilguanosina (mG), dimetilguanosina (m
2
G), metilinosina (mI) y dihidrouridina (DHU, UH
2
).
El que realiza el reconocimiento del codn correspondiente del ARN-m es el anticodn del ARN-t y
no el aminocido. Mediante un experimento se demostr que era posible transformar el cisteinil-
ARN-t mediante tratamiento con hidruro de nquel en alanil-ARN-t. Este tratamiento convierte la
cistena en alanina. De esta manera se consigui un ARN-t especfico de cisteina que en lugar de
llevar unida cisteina llevaba unida alanina. Cuando se empleo este ARN-t hbrido para sintetizar
protenas se pudo comprobar que en el lugar en el que deba aparecer cisteina en la secuencia del
polipptido apareca alanina. Por tanto, el que llevaba a cabo el reconocimiento del codn del
ARN-m era el anticodn del ARN-t y no el aminocido.
LOS RIBOSOMAS (ARN RIBOSMICO Y PROTENAS RIBOSOMALES)
El reconocimiento entre los tripletes del mensajero y los anticodones de los ARN-t cargados con su
correspondiente aminocido, as como el establecimiento de los enlaces peptdicos entre dos
aminocidos sucesivos tiene lugar en los ribosomas.
os ribosomas son unas estructuras o partculas citoplsmicas formadas por ribonucleoprotenas
(unin de ARN ribosmicos con protenas ribosomales). Los ribosomas en las clulas eucariticas
se encuentran en la membrana del retculo endoplasmtico. La estructura general de los ribosomas
procariticos y eucariticos consta de una subunidad pequea, una subunidad grande y dos sedes,
la sede aminoacdica (Sede A) lugar de entrada de los ARN-t cargados con un aminocido
(aminoacil-ARN-t) y la sede peptdica (Sede P) lugar en el que se encuentran los ARN-t cargados
con un pptido (peptidil-ARN-t). Las constantes de sedimentacin de cada subunidad, los tipos de
ARN ribosmico (ARN-r) y las protenas ribosomales que forman parte de ambas subunidades en
los ribosomas eucariticos y procariticos se indican en la siguiente tabla:
Ribosomas Subunidades ARN-r Protenas ribosomales
Procariticos: 70S
66% ARN, 34% protenas
Grande: 50S
23S: 2.904 bases
31 diferentes (L1-L31)
5S: 120 bases
Pequea: 30S 16S: 1541 bases 21 diferentes (S1-S21)
Eucariticos: 80S
60% ARN, 40% protenas
Grande: 60S
28S: 4718 bases
49 diferentes (L1-L49) 5,8S: 160 bases
5S: 120 bases
Pequea: 40S 18S: 1874 bases 33 diferentes (S1-S33)
ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDO Y FORMACIN DE LOS COMPLEJOS DE
TRANSFERENCIA
La activacin de los aminocidos para formar los complejos de transferencia es el paso previo
necesario para que pueda comenzar la traduccin, y consiste en la unin de cada aminocido a su
ARN-t especfico mediante la intervencin de un enzima, la aminoacil-ARN-t sintetasa y el aporte
de energa del ATP.
aa
1
+ ARN-t
1
+ ATP ARN-t
1
-aa
1
+ AMP + PPi
La unin del aminocido al ARN-t tiene lugar por el extremo 3' del ARN-t. Todos los ARN-t en su
extremo 3' contienen la secuencia 3' ACC 5'. Las aminoacil-ARN-t-sintetasas tienen tres sedes
distintas, una para el reconocimiento del aminocido, otra para el ARN-t y otra para el ATP. Debe
existir al menos una aminoacil-ARN-t-sintetasa diferente por cada ARN-t distinto. El ARN-t se une
a la aminoacil-ARN-t-sintetasa a travs del lazo dihirouracilo (DHU).
Por ltimo, la especificidad de reconocimiento de las aminoacil-ARN-t-sintetasas y el
correspondiente aminocido no reside en el anticodn del ARN-t. Esta especificidad es lo que se
ha llamado el Segundo Cdigo Gentico. Esta especificidad reside en el par de bases G y U que
ocupan las posiciones 3 y 70, respectivamente del ARN-t. La ausencia de este par impide que se
una la alanina a su ARN-t y la introduccin de dicho par en la misma posicin en los ARN-t-cys y
ARN-t-phe les confiere la capacidad de unirse al aminocido alanina.
INCORPORACIN DE LOS AMINOCIDOS A LA CADENA POLIPEPTDICA
Una vez activados los aminocidos y formados los complejos de transferencia (ARN-t cargados
con el aminocido correspondiente) ya puede comenzar la sntesis de la cadena polipeptdica y la
incorporacin de los aminocidos. En este proceso se pueden distinguir tres fases diferentes:
Iniciacin de la cadena polipeptdica.
Elongacin de la cadena polipeptdica.
Terminacin de la cadena polipeptdica.
NICIACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA
En la iniciacin de la cadena polipeptdica intervienen el primer ARN-t, o ARN-t iniciador de la
traduccin que habitualmente es el ARN-t-Formilmetionina, las subunidades ribosomales, el ARN-
m, enzimas, los factores de iniciacin IF1, IF2 e IF3 y una fuente de energa como GTP. Las
subunidades ribosomales estn separadas cuando no estn ocupadas en la sntesis de
polipptidos. Para poder iniciar la traduccin es necesario que ambas subunidades se ensamblen.
Se pueden distinguir tres fases en el proceso de iniciacin:
Fase 1: Unin del mensajero (ARN-m) a la subunidad pequea 30S de los ribosomas
estimulada por la accin del factor IF3.
Fase 2: El ARN-t-iniciador (ARN-t-Formilmetionina) se une al factor IF2 y a GTP y se situa
en la Sede P.
Fase 3: Unin de las dos subunidades ribosomales 30S y 50S mediante la hidrlisis del
GTP unido a IF2 catalizada por una protena ribosomal. Una vez unidas ambas
subunidades se sueltan o disocian los factores IF2 e IF3. La funcin de IF1 no se conoce
con exactitud aunque se cree que interviene en el proceso del reciclado de los ribosomas.
ELONGACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA
Una vez formado el complejo de iniciacin se puede comenzar la elongacin del
polipptido. La elongacin o crecimiento de la cadena polipeptdica tiene lugar en esencia
mediante la formacin de enlaces pptdicos entre los aminocidos sucesivos. Intervienen
en este proceso, el peptidil-ARN-t, los aminoacil-ARN-t, ribosomas, ARN-m, enzimas,
factores proteicos de elongacin EF-Tu, EF-Ts y EF-G y fuentes de energa como GTP. Se
pueden distinguir cuatro fases esenciales en el proceso de elongacin:
Fase 1: El aminoacil-ARN-t correspondiente al siguiente triplete del ARN-m entra en la sede A dl
ribosoma gracias a la intervencin del factor EF-Tu. Para ello EF-Tu se une primero a GTP
activndose y despus el complejo activado (EF-Tu-GTP) se une al aminoacil- ARN-t. Despus la
hidrlisis de GTP a GDP favorece la entrada del aminoacil-ARN-t en la sede A y el complejo EF-
Tu-GDP se libera.

Fase 2: La liberacin del ribosoma del complejo EF-Tu-GDP esta mediada por la intervencin del
factor de elongacin EF-Ts. Este factor, EF-Ts, tambin interviene en la regeneracin y activacin
del factor EF-Tu.

Fase 3: La transferencia de la cadena peptdica del peptidil-ARN-t que est en la Sede P al
aminoacil-ARN-t nuevo que ha entrado en la sede A. Esta reaccin est catalizada por un enzima
que es la peptidil-transferassa. Despus el ribosoma avanza un codn sobre el ARN-m en la
direccin 5'3' (se transloca). Este paso se realiza gracias a la intervencin del factor EF-G
activado por la hidrlisis de GTP. En esta fase se libera el ARN-t descargado que estaba en la
sede P y al moverse el ribosoma el pptidil-ARN-t recin formado que estaba en la sede A pasa a
ocupar la sede P.
TERMINACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA
La terminacin de la cadena polipeptdica en bacterias tiene lugar cuando los ribosomas en su
avance a lo largo del ARN-m se encuentran con cualquiera de los siguientes tripletes de
terminacin o codones de fin: UAA, UAG y UGA. Adems, durante la terminacin intervienen los
factores proteicos de terminacin RF1, RF2 y RF3. No hay ningn ARN-t que reconozca a los
tripletes de terminacin, son los factores de terminacin o liberacin los que se encargan de
reconocer los codones de STOP. El factor RF1 reconooce los codone UAA y UAG y el factor RF2
identifica a los codones UAA y UGA. El factor RF3 tambin colabora en la reaccin de terminacin.
Cuando el peptidil-ARN-t est en la sede P los factores de terminacin en respuesta a la existencia
de un codn de terminacin en el ARN-m entran en la sede A. Como consecuencia el polipptido
se libera de la sede P, se disocian las dos subunidades del ribosoma y se libera el ARN-t que
estaba en la sede P. Esta reaccin de terminacin se lleva a cabo mediante la hidrlisis de GTP.
PROCESAMIENTO DE PROTENAS

Los polipptidos una vez sintetizados pueden ser procesados. Existen diferentes tipos de
procesamiento posterior a la sntesis de los polipptidos, uno de los ms frecuentes es el que tiene
lugar por el extremo amino (N-terminal). Muchas protenas de membrana y protenas secretadas
por la clula contienen cuando se sintetizan una corta secuencia de aminocidos (de 15 a 25) en el
extremo N-terminal o pptido lder, denominada tambin pptido seal. La mayora de los
aminocidos del pptido seal son hidrofbicos y son reconocidos por factores y receptores
proteicos que intervienen en el transporte del polipptido a travs de la membrana celular. Durante
este proceso una peptidasa produce un corte que libera el pptido seal. En bacterias tambin se
produce este procesamiento en protenas que se secretan. Esta es la causa por que muchos
polipptidos maduros (ya procesados) no poseen el aminocido metionina en el extremo N-
terminal. Existen muchos ejemplos de procesamiento de polipptidos, varias hormonas peptdicas
pequeas, como la corticotropina (ACTH), se producen tras el procesamiento de una protena de
mayor tamao.
ORTE Y UN IN DE SEGMENTOS DE PROTENAS

En bacterias y en eucariontes se ha observado la eliminacin de segmentos internos de los
polipptidos durante el procesamiento. Estos segmentos eliminados se denominan secuencias
proteicas interpuestas (IVPS, del ingls Intervening Protein Sequence). Durante el procesamiento
se produce un enlace peptdico entre las secuencias que flanquean la IVPS y su eliminacin es
autocataltica, se realiza "in vitro". Todas las regiones IVPS estudiadas muestran actividad
endonuclesas, aunque esta actividad no esta relacionada con la de corte y unin de las IVPS.