Prctica N6

HIDRLISIS ENZIMTICA DE TRIACILGLICRIDOS POR ACCIN DE LA LIPASA PANCRETICA

Andrea M. Rosero B. (28140220); Miguel Nastar C. (27140296)

Departamento de Qumica, Facultad de ciencias exactas y Naturales, Universidad de Nario, Sede Torobajo, Carrera
18 Calle 50; Sam Juan de Pasto, Colombia.

Realizado 1de noviembre de 2011; entregado 29 de noviembre de 2011

Resumen
Se busc comprobar la accin enzimtica de la lipasa pancretica sobre una mezcla de triacilglicridos, comparando
los productos de la accin de la enzima a travs del tiempo mediante una cromatografa de capa fina (TLC) sobre
silica gel, en donde se aprovech las diferencias en polaridad de los diferentes acilglicridos y cidos grasos. Sin
embargo, no se obtuvo una placa cromatogrfica adecuada para el anlisis, probablemente debido a que no se dej
secar el suficiente tiempo antes de su revelacin; por esta razn se compar con otra placa cromatografica la cual
presento mejores resultados.

Palabras clave: enzimtica, triacilglicridos, lipasa pancretica, TLC.

I ntroduccin
De acuerdo con la definicin de la Comisin de
Enzimas de la IUPAC, las lipasas (EC 3.1.1.3.) son
triacilglicerol ster hidrolasas, es decir, enzimas que
catalizan de forma natural la hidrlisis de
triacilgliceridos. Estn presentes en la gran totalidad de
los organismos vivos, desde los microorganismos a los
animales superiores, siendo imprescindibles para la
asimilacin de los lpidos as como tambin para el
almacenamiento y posterior utilizacin de las grasas
que sirven de reserva energtica.
(1)

Actualmente se conoce la estructura tridimensional de
un gran nmero de lipasas
(2)
que tienes caractersticas
estructurales comunes, a pesar de las diferencias en su
tamao, origen y secuencia de aminocidos. Todas
ellas presentan conformaciones del tipo / con una
lamina central, compuesta por al menos cinco
filamentos paralelos
(3)
. Secuencias peptdicas -
helicoidales flanquean la lamina central por ambas
caras. En la figura 1. Se muestra una representacin
esquemtica de la conformacin / propia de las
lipasas.



En cuanto al centro activo de estas enzimas, est
constituido por la triada: Serina, Histidina y Acido
Asprtico. Dicha triada cataltica est presente en la
prctica totalidad de las lipasas (aunque en algunas de
ellas el cido apartico es sustituido por el glutmico), La
unin del aminocido serina a un agente inhibidor,
revela que dicho aminocido resulta crucial en la accin
cataltica de la enzima
(4)
.

Un ejemplo de lipasas es la lipasa pancretica presente
en el organismo humano, la cual es la enzima que
cataliza la hidrlisis parcial de triglicridos que, en su
mayora contienen cidos grasos de cadena larga. Sin
embargo para que el organismo pueda digerir
triglicridos de cadena larga, que son los ms
abundantes en la alimentacin diaria, estos deben ser
previamente emulsificados y formar as pequeas
micelas solubles en agua, dichos triglicridos son
emulsificados en el intestino delgado por la accin de la
bilis, que es sintetizada en el hgado y contiene cidos
biliares conjugados, fosfatidilcolina y colesterol. Para su
carcter anfiptico, estos compuestos biliares favorecen
la formacin de las micelas, en cuyo centro se ubican los
triglicridos, lo cual facilita la accin de las enzimas
digestivas que actan sobre las grasas de la dieta

Esta
enzima hidroliza los enlaces ester en los carbonos uno y
tres formando el 2- monoacilglierol (en mayor
proporcin) y los correspondientes cidos grasos como
se indica en le ecuacin 1.
(5)



Ecuacion 1. Accin de la lipasa pancretica sobre los
triacilgliceridos.

La lipasa pancretica, es sintetizada en el pncreas y
tiene su accin en el duodeno a travs del sistema de
conductos del pncreas, requiere un cofactor proteico
llamado colipasa, producido tambin por el pncreas y
que origina la activacin de la enzima. En la figura 2. Se
indica el diagrama de la lipasa pancretica humana
coloreada por la estructura secundaria donde se observa
las hlices alfa en rojo, las hojas beta en amarillo, y las
hlices al azar en verde, la coenzima colipasa de color
azul y una pequea molcula inhibidora en la zona
superior izquierda
(6)
.


Figura N
o
2. Diagrama de la lipasa pancretica
humana

Resultados y discusin

La accin enzimtica de la lipasa pancretica fue
comprobada originando la hidrolisis de
triacilglicridos, mediante la formacin de cidos
grasos y monoacilgliceroles como indica la ecuacin 1.

La formacin de estos dos productos especficos se
debe a las propiedades de la lipasa pancretica a nivel
molecular para actuar de forma selectiva sobre esteres
en la posicin , de manera que se escinden cidos
grasos de las posiciones C-1 y C-3, dando como
resultado cidos libres y - monoacilgliceroles
(7)
,
siendo este ultimo el producto de mayor proporcin.
Adems, gracias a que la lipasa pancretica presenta
mejor especificidad sobre cidos grasos de cadena
larga puede inferirse que dichos cidos obtenidos tras
la hidrolisis y verificados por medio de la
cromatografa de capa fina tengan estas caractersticas.

En cuanto a la obtencin de dichos productos mediante
la hidrlisis enzimtica se evidencia claras ventajas
respecto de la hidrlisis qumica tradicional, ya que
esta emplea temperaturas superiores 250
o
C y
presiones de 30 a 60 Atm, mientras que la liplisis
enzimtica transcurre a presin ambiente y a 40-60
o
C
como se observo en el desarrollo de la prctica, esto
implica un gran ahorro, tanto energtico como en
materiales, constituyendo un proceso mucho ms
seguro ya que adems no tiene lugar reacciones
secundarias, ni se generan productos indeseados
adems de obtenerse cidos grasos termolbiles que
resultaran degradados en el proceso convencional.

Independientemente del ambiente en que se encuentre
la enzima, el mecanismo cataltico actualmente
aceptado para describir la accin de lipasas y esterasas
se centra en el residuo cataltico serina, situado en su
centro activo. El tomo de oxgeno presente en la
serina acta como nuclefilo, formando un hemiacetal
tetradrico con el triglicrido. A continuacin el enlace
ester del hemiacetal es hidrolizado y el diglicerido
liberado, formndose el complejo acil-enzima.
Seguidamente se produce un ataque sobre dicho
complejo acil-enzima por parte de un nuclefilo, que
puede ser el agua presente en el medio, obtenindose
finalmente el acido graso respectivamente, y
liberndose la enzima
(8)
. Todas estas etapas se
esquematizan en la figura 3.

Figura N
o
3. Etapas de una reaccin catalizada por
lipasas: (1). Ataque nucleoflico sobre un tomo de
carbono del grupo carbonilo de un triglicrido. (2).
Formacin del complejo acil-enzima y un alcohol o di
glicrido. (3). Ataque nucleoflico del agua. (4).
Liberacin del acido graso o carboxlico. Reproducido
de Camacho Pez (2000)

Dentro del procedimiento realizado en esta prctica, se
tomaron 5 muestras cada 10 minutos para evaluar la
accin de la enzima a medida que el tiempo
aumentaba; para lograr la inhicin de la enzima, las
muestras extradas del medio de reaccin se las
someta a una disminucin en el pH del medio gracias
a la adicin de HCl 2M originando que la enzima se
inactive bajo estas condiciones, debido a esta
caracterstica se hizo importante mantener el carcter
bsico en el medio de reaccin inicial para garantizar
la accin de la lipasa pancretica sobre la mezcla de
triglicridos, realizando el control con ayuda del
indicador fenolftalena que en medio bsico presentaba
su color rojo magenta.
Posteriormente, se realizo la separacin de los cidos
grasos formados disolvindolos en cloroformo para
correr la muestra en la placa cromatogrfica que se
muestra en la figura N
o
4.













Figura N
o
.4. Placa cromatogrfica.

Respecto a la placa cromatogrfica obtenida, se puede
observar que las muestras sembradas no corrieron
adecuadamente sobre esta, posiblemente debido a que
no se dejo secar la placa el tiempo necesario antes de
ser revelada; as, es probable que al ser rociada con la
solucin de cido fosfomolbdico al 10% en etanol
(revelador), se hubiera producido una mezcla entre este
y las muestras sembradas, generndose la gran mancha
observada horizontalmente, (figura N 4).

As, para realizar un anlisis de la accin enzimtica de
la lipasa pancretica sobre la mezcla de los
triacilglicridos mediante TLC, se tom una placa
standar con mejores resultados indicada en la figura
N5.

Figura N 5: Placa cromatogrfica standar con
mejores resultados.

En donde: 1 = tiempo 0 min.
2 = tiempo 10 min.
3 = tiempo 20 min.
4 = tiempo 40 min.
5 = tiempo 60 min.
P
1
= acido palmtico
P
2
= cido oleico

De la anterior figura, en primer lugar, se puede
evidenciar la efectividad de la lipasa pancretica a
travs del tiempo, ya que a un tiempo de 0 min (1), se
observa manchas claras indicando con esto que la
cantidad de triacilgliceridos separados fue menor, en
comparacin con 4 y 5 en donde se puede observar que
las manchas son de mayor intensidad (mayor cantidad
de acilglicridos y cidos grasos separados).
En segundo lugar, respecto a las muestras P
1
y P
2

correspondientes a patrones de cidos palmtico y
oleico respectivamente, se puede decir que en P
1
la
ubicacin del cido (palmtico) es la sealada con el
circulo violeta (figura N 6). Esta afirmacin se puede
hacer teniendo en cuenta que mientras la silica gel de
la placa presenta un carcter polar, el cido palmtico
(figura N 7) al presentar una larga cadena carbonada
tiene un carcter apolar. Esta diferencia de polaridades,
hizo que dicho acido se separara con mayor facilidad,
cuyo Rf es 0.71. el circulo indicado en color rojo
probablemente corresponda a impurezas presentes en
el mismo.


Figura N 6: Placa cromatogrfica con la ubicacin
del cido palmtico P
1
.


Figura N 7: Estructura del cido palmtico.

En el caso de P
2
(cido oleico, figura N 8), no se
observa ninguna mancha, posiblemente debido a que no
era el patrn mencionado y pudo haber correspondido a
otro compuesto. Sin embargo, en la parte superior de la
placa entre las muestras 1 a 5 (figura N 6, cuadro azul)
se puede observar la aparicin de manchas a similar Rf
(0.90) de las cuales se puede inferir que corresponden a
cidos con gran carcter apolar.


Figura N 8: Estructura del cido oleico.

Por su parte las manchas indicadas en el recuadro verde
no pudieron ser identificadas ya que no se sembr un
patrn que permitiera reconocerlas.

Conclusiones.

La lipasa pancretica se caracteriza por actuar
de forma selectiva sobre los C1 y C3 de los
triacilgliceridos dando como resultado cidos
grasos y - monoacilgliceroles.
No se pudo realizar el anlisis respectivo con
la placa cromatogrfica obtenida debido a que
las muestras sembradas no corrieron
adecuadamente posiblemente a que no se dejo
secar la placa el tiempo suficiente antes de ser
revelada.
Sin embargo, el anlisis se realizo con una
placa donde si se evidencia la formacin de
cidos grasos y la efectiva accin de la lipasa
pancretica a medida que aumenta el tiempo
de anlisis observndose una mayor cantidad
de acilgliceridos y cidos grasos separados
para las muestras sembradas en 4 y 5.

Bibliografa
(1): Garca Romn, Miguel; Hidrlisis enzimtica de
triacilgliceridos en emulsiones de O/W. Aplicacin a
formulaciones detergentes, Tesis Doctoral como
ingeniero qumico. Universidad de granada
(2). BRADY, L., BRZOZOWSKI, AM.,
DEREWENDA Z.S., DODSON, G., TOLLEY, S.,
TURKENBURG, J.P., CHRISTIANSEN, L., HUGE-
JENSEN, B., NORSKOV, L., THIM, L. y MENGE, U.
(1990). A srine protease triad forms the catalytic centre
of a triacylglycerol lipase. Nature, vol. 334, 767-770.
(3) SCHRANG J.D. y CYGLER, M. (1997). Lipases
and the / fold. Methods in Enzymology. Vol. 284, 85-
106
(4) BRADY, L., BRZOZOWSKI, AM., DEREWENDA
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(5): Jaime Fornaguera, Georgina Gmez; Bioqumica: la
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editorial universidad estatal a distancia. Los lpidos
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(6): Egloff MP, Marguet F, G Buono, Verger R,
Cambillau C, van Tilbeurgh H (marzo de 1995). "La
estructura de 2,46 con una resolucin de la lipasa
pancretica-colipasa complejo inhibida por un fosfonato
C11 alquilo"Bioqumica 34 (9) 2751-62
(7): Teijn, Jos Mara / Pertierra, Armando / Gaitn
Dolores. Fundamentos de bioqumica metablica.
Editorial TEBAR, segunda edicin. Tema 6.
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(8): Camacho Paez,2000; obtencin de lpidos
estructurados por acidlisis con lipasas inmovilizadas.
Tesis Doctoral Universidad de Almera, Espaa. Y
Neves-Petersen 2001. How do lipases and esterases
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