Cultivo e Crescimento

de Microorganismos
Prof. Fernando Ananias
Por que importante estudar o crescimento das microbiano?
- Isolar os agentes causais das doenas infecciosas
- Identificao dos agentes causais das doenas infecciosas
- Desenvolvimento de agentes antimicrobianos
- Preservao dos alimentos
- Estudo: Bioqumica, Gentica, Biotecnologia
Como as bactrias se multiplicam?
cidos nuclicos
Protenas
Lipdeos
polissacardeos
1
2
Tempo de Gerao
1
2
20min
4
20min
8
20min
X= x
0
.2
n
Onde n= nmero de
geraes
X=1.2
3
X=8
Exerccios:
- Sabendo-se de o tempo de gerao de E. coli de 20 minutos, partindo-se
de uma nica clula quantas clulas bacterianas sero obtidas aps 1 hora de
cultivo?
R: Em 1 hora de cultivo (60 minutos) teremos 3 geraes (n=3)
Ento: X= xo.2
n
X= 1.2
3
X= 8
1 hora
2 horas
R: Em 2 horas de cultivo (120 minutos) teremos 6 geraes (n=6)
Ento: X= xo.2
n
X= 1.2
6
X= 64
- E aps 2 horas de cultivo?
Exerccios:
- Sabendo-se de o tempo de gerao de E. coli de 20 minutos, partindo-se
de uma nica clula quantas clulas bacterianas sero obtidas aps 1 hora de
cultivo?
R: Em 1 hora de cultivo (60 minutos) teremos 3 geraes (n=3)
Ento: X= xo.2
n
X= 1.2
3
X= 8
1 hora
3 horas
R. Teremos 3 geraes a cada hora, 9 geraes (n=9)
Ento: X= xo.2
n
X= 1.2
9
X= 8.8.8 = 512
- E aps X horas de cultivo?
24 horas
12 horas
4 horas
R. 12 geraes (n=12)
Ento: X= xo.2
12
X= 2
9
.2
3
= 512 . 8 = 4.086
R. Nmero de geraes= 12 . 3 (n=36)
Ento: X= xo.2
36
X= 2
9
.2
9
.2
9
.2
9
= 512 . 512 . 512 . 512 = 6,86.10
10
R. Nmero de geraes= 24 . 3 (n=72)
Ento: X= xo.2
72
X= 2
36
.2
36
= 4,7.10
21
Curva de Crescimento
A
D
B
C
Fases da Curva de Crescimento de bactrias:
- Fase Lag - Fase Estacionria
- Fase Exponencial ou Logaritmica (Log) - Fase de Declnio
A C
B D
X= xo.2
n
- Quero traar uma Curva de Crescimento Bacteriano. Como o
crescimento da cultura bacteriana pode ser acompanhado?
1. Contando-se o nmero de clulas ao longo do cultivo
- Quero traar uma Curva de Crescimento Bacteriano. Como o
crescimento da cultura bacteriana pode ser acompanhado?
2. Acompanhando-se o aumento da turvao ao longo do cultivo
- Quero traar uma Curva de Crescimento Bacteriano. Como o
crescimento da cultura bacteriana pode ser acompanhado?
1. Contando-se o nmero de clulas ao longo do cultivo
2. Acompanhando-se o aumento da turvao ao longo do cultivo
3. Outras possibilidades....
1. 2. Nutrientes Necessrias
~ soluo fisiolgica (09% NaCl)
Osmolaridade
- Acidfilos
- Neutrfilos (pH 5-9)
- Alcalfilos
pH
- Vitaminas
- Aminocidos
- Fatores presentes no SANGUE
Fatores de Crescimento
- Na
+
, K
+
, Mg
++
, Fe
+++
- traos de Zn
++
, Mn
++
, Co
++
, Mo
+++
, Se
++
Fontes de outros Elementos
- HP0
4
2-
- SO
4
2-
Fontes de P e S
- Orgnicos: NH
4
+
- Inorgnicos: N
2
(fixadoras de nitrognio), NO
2
-
, NO
3
-
Fontes de N
- Orgnicos (Heterotrficos): Acares, Protenas
- Inorgnicos (Autotrficos): CO
2
Fontes de Carbono
- Orgnicos
- Inorgnicos
- Luz
Fontes de Energia
Vitaminas Comuns necessrias para a nutrio de algumas bactrias
Electron transport processes Quinones and napthoquinones Vitamin K
Transfer of methyl groups Cobalamine coupled to adenine nucleoside Vitamin B
12
Decarboxylation of keto acids and transaminase reactions Thiamine pyrophosphate (TPP) Thiamine (B
1
)
Oxidoreduction reactions
FMN (flavin mononucleotide) and FAD (flavin
adenine dinucleotide)
Riboflavin (B
2
)
Transamination, deamination, decarboxylation and
racemation of amino acids
Pyridoxal phosphate Pyridoxine (B
6
)
Oxidation of keto acids and acyl group carriers in metabolism
Coenzyme A and the Acyl Carrier Protein
(ACP)
Pantothenic acid
Electron carrier in dehydrogenation reactions
NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and
NADP
Nicotinic acid
CH
4
production by methanogens Coenzyme M
Mercaptoethane-
sulfonic acid
Transfer of acyl groups in oxidation of keto acids Lipoamide Lipoic acid
Biosynthetic reactions that require CO
2
fixation Biotin Biotin
Transfer of one-carbon units and required for synthesis of
thymine, purine bases, serine, methionine and pantothenate
Tetrahydrofolate Folic acid
Precursor for the biosynthesis of folic acid -
p-Aminobenzoic
acid (PABA)
Function Coenzyme form
Vitamin
Growth rate vs pH for three environmental classes of procaryotes. Most free-living
bacteria grow over a pH range of about three units. Note the symmetry of the curves
below and above the optimum pH for growth.
1. 3. pH
pH Mnimo, timo e Mximo para o crescimento de alguns procariotos
10.0 7.6-8.6 6.6 Nitrobacter sp
8.3 7.8 6.5 Streptococcus pneumoniae
9.0 7.0 5.7 Thiobacillus novellus
8.0 6.6-7.0 5.6 Pseudomonas aeruginosa
9.3 7.1 5.6 Erwinia caratovora
8.5-9.0 6.0-7.6 5.0-5.8 Clostridium sporogenes
9.0 6.0-7.0 4.4 Escherichia coli
9.3 7.0-7.5 4.2 Staphylococcus aureus
6.8 5.8-6.6 4.0-4.6 Lactobacillus acidophilus
7.5 5.5-6.0 3.5 Zymomonas lindneri
6.0 4.0 2.0 Bacillus acidocaldarius
5.0 2.0-3.0 1.0 Sulfolobus acidocaldarius
4.0-6.0 2.0-2.8 0.5 Thiobacillus thiooxidans
pH mximo pH timo pH mnimo
Organismo
1.4. Condies Fsicas (Fatores Ambientais)
- Psicrfilos
- Mesfilos
- Termfilos
Temperatura
Thermus
aquaticus
Min. 40
o
C
tima:70-72
o
C
Mxima: 79
o
C
- Aerbios Obrigatrios
- Facultativos
- Anaerbios
(Facultativos Estritos)
A) 2 0
2
+ 2 H
2
H
2
0
2
B) H
2
0
2
H
2
0 + 0
2
Presena de Oxignio
(atmosfera)
Superxido dismutase
catalase
The action of superoxide dismutase, catalase and peroxidase.
These enzymes detoxify oxygen radicals that are inevitably
generated by living systems in the presence of O
2
. The
distribution of these enzymes in cells determines their ability
to exist in the presence of O
2
1.4. Condies Fsicas (Fatores Ambientais)
Presena de Oxignio
(atmosfera)
Presena de Oxignio
(atmosfera)
Presena de Oxignio
(atmosfera)
Aerbios Obrigatrios
Ex. Pseudomonas spp.
Facultativos
Ex. Escherichia coli
Anaerbios Obrigatrios
Ex. Clostridium tetani
1
Agar tioglicolato
3
1
2
3 2
1.4. Condies Fsicas (Fatores Ambientais)
2. Metabolismo
2. Metabolismo
Metabolismo Heterotrfico
(quimioheterotrfico)
fermentao
respirao
- Capacidade de hidrolisar os mais diversos materiais
- Diversidade metablica
- Variedade de Enzimas produzidas (induzidas ou no)
- Produo de Toxinas
Metabolismo Autotrfico
(quimiolitotrfico, Fotolitrotrfico)
Substncias
Orgnicas
(Bactrias de interesse
clnico)
Substncias
Inorgnicas
(CO2, N2, Luz)
Catabolismo Anabolismo
Metabolismo Heterotrfico
(quimioheterotrfico)
As clulas oxidam molculas orgnicas para obter energia (CATABOLISMO)
Ento usam esta energia para sintetizar material celular (ANABOLISMO)
- Animais,
- muitas bactrias (de interesse clinico, biodegradao ambiental),
- poucas arqueias (as que vivem em associao com animais)
2. 2. Metabolismo
- Como a Clula Funciona?
- A Moeda da clula o ATP
Fermentao
Respirao
Glicose Piruvato + 2 ATP
Glicose CO
2
+ H
2
0 + 2 ATP
Presena de O2
Ausncia de O2
Glicose CO
2
+ H
2
0 + 36 ATP
- Aceptor final de eletrons: NO
3
-
ou SO
4
++
- Menor rendimento de ATP que microrganismos aerobios
3. Meios de Cultura Bacterianos
1. Meio Mineral (Meio Mnimo)
3. Meio Diferencial
2. Meio Completo
4. Meio Seletivo
Sais Minerais e Fonte de Carbono (acar). Ex. Meio M9
Protena hidrolisada com ou sem acar.
Ex. - Caldo Nutriente / gar-Nutriente
- LB / LA
- TSB / TSA
Contem protena hidrolisada e outras substncias que
permitem a DIFERENCIAO VISUAL DAS COLNIAS
Ex. - gar sangue
- gar Mac-Conkey
Contem protena hidrolisada e outras substncias que
permitem que SOMENTE COLNIAS DE ALGUMAS
BACTRIAS CRESAM
Ex. - gar Mac-Conkey
Questes para Estudo:
1. Desenhe uma Curva de crescimento bacteriano e explique cada uma das fases.
2. Quais so os nutrientes mnimos necessrios para o crescimento bacteriano?
3. O que meio diferencial? Cite um exemplo.
4. Como feito o cultivo de bactrias anaerbias?
5. Quando uma clula da bactria E. coli semeada em meio slido Agar Nutriente e cultivada
a 37oC, ela se divide em duas a cada 20 minutos, aps ter atingido a fase exponencial de
crescimento.
Se em uma aula prtica de uma tera-feira forem semeadas, por esgotamento, colnias
de E. coli (10:00), imaginando-se que h uma fase lag de 2 horas, quantas bactrias podem
estar presentes em cada colnia na quarta-feira as 9:00hs?