BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

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PRCTICA N03:

1.- TITULO:

2.- INTRODUCCION:

Las curvas de crecimiento comprenden varias fases. Fase de latencia: Es la primera
parte de la curva, en la que el nmero de ufc permanece constante aproximadamente,
es una fase de adaptacin al medio. Aunque no tiene lugar divisin alguna, se da una
considerable actividad bioqumica, especialmente sntesis de protena y de ARN.
La duracin de la fase lag depende de varios factores, principalmente de la temperatura
de incubacin, la composicin del medio de crecimiento, su pH y potencial redox y del
estado fisiolgico del inculo. Fase logartmica o exponencial: Es cuando la
multiplicacin de las clulas de los microorganismos se da a velocidad ptima, el log de
los nmeros de ufc frente al tiempo muestra una relacin en lnea recta, la velocidad de
crecimiento durante esta fase se puede calcular a partir de la pendiente de la curva de
crecimiento y un modelo matemtico. Fase estacionaria: Las ufc permanecen
aproximadamente constantes durante un tiempo variable. No hay reproduccin o el
ritmo de multiplicacin y el ritmo de muerte son ms o menos iguales. Fase de muerte:
la muerte de las clulas va seguida de autolisis.
Esta libera de nuevo al medio diversos componentes celulares que proporcionan
nutrientes para que otras clulas viables se multipliquen. Disminucin paulatina de
clulas vivas.

3.- OBJETIVOS:

- Estudiar las fases de crecimiento de las levaduras en un mosto de fruta bajo
condiciones ptimas de desarrollo.
- Obtener las curva de crecimiento para una determinada cepa e interpretar los
resultados aplicando los conocimientos de cintica de crecimiento de los
microorganismos.

4.- FUNDAMENTO TEORICO:

A) FORMULACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los componentes de
los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean
un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del
crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.
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No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes
categoras de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por
litro.
c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes
orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin
metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en:

Medios sintticos o medios qumicamente definidos.
Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.
que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente
indefinidas y de composicin variable

B) CRECIMIENTO CELULAR

Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque es
necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose
el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una fermentacin. Sin conocer
estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por
ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar,
cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc.

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que
pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han
podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una clula en hacer.
Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica,
siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones
transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:

Llamando T al tiempo de generacin y t al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin
anterior puede transformarse en la siguiente:

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Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es
mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta.
Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los dos
trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de
una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el crecimiento
tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser rpido.Esto es:
el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y en la acumulacin de
metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es paralelo.
Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de
clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe
la cintica es la siguiente:

Esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es
proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de
proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo as
como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado la
transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el
tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin con la
similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y, por consiguiente, que
T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de
crecimiento () y el tiempo de generacin.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular,
etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la
tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero
de clulas, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular

El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo
(lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya
concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.

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C) CINTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA

Una fermentacin aerbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como un
sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estril dentro del fermentador se
inocula con microorganismos y la incubacin se da bajo condiciones fisiolgicas ptimas.
En el transcurso de toda la fermentacin, solo se adiciona oxgeno (en forma de aire), un
agente antiespumante, y un cido o base para el control del pH, con el fin de garantizar
las condiciones ptimas de operacin que permitan obtener una alta concentracin
celular. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de biomasa, y la
concentracin del metabolito cambia constantemente como resultado del metabolismo
celular. En el transcurso de la fermentacin hay 4 fases de crecimiento, por las cuales
pasa el microorganismo a travs el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase
exponencial, fase estacionaria y fase de muerte (Snchez, 2003).


Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.

Fase Lag o de adaptacin: tambin llamada fase de latencia. Cuando las clulas son
transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento en el nmero de
clulas. Durante esta fase los microorganismos se toman un tiempo para adaptarse a su
nuevo ambiente fisicoqumico y en ocasiones se sintetizan nuevas enzimas o
componentes estructurales (Snchez, 2003; Duarte, 1998). La duracin de esta fase
puede variar dependiendo del crecimiento de las clulas en el inculo, el cual debe tener
una edad tal que la mayor parte de las clulas que contiene deben encontrarse en fase
exponencial y metablicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar
inculos entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de
reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).

Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag, las clulas se han adaptado a las
nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las clulas se reproducen sin
limitacin de sustancias nutritivas a velocidad mxima. El crecimiento de las clulas se
puede describir cuantitativamente como la duplicacin del nmero de clulas o biomasa
por unidad de tiempo. A travs de esta fase las clulas alteran el medio constantemente
tomando los sustratos y excretando los productos metabolizados. El crecimiento
permanece constante durante esta fase. La velocidad de crecimiento es independiente
de la concentracin de sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona
con la velocidad de crecimiento especfico y la concentracin de clulas x [clulas/ mL]
segn la ecuacin nmero 1.
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La velocidad de crecimiento especfico , es generalmente una funcin de tres
parmetros: la concentracin del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento mxima
max , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentracin se obtiene la
mitad de la mxima velocidad especfica de crecimiento ( = 0.5 mx. ). Esta relacin
puede ser expresada por medio de la ecuacin de Monod (2):

La velocidad mxima de crecimiento especfico max es de considerable importancia a
nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el valor mximo de a
niveles de saturacin de sustrato, relacionando la dependencia de los microorganismos
con las condiciones del fermentador, donde a medida que aumenta la densidad de
poblacin decrece la concentracin del sustrato limitante del crecimiento, causando un
descenso de . Fase estacionaria: ocurre cuando se agota una sustancia nutritiva y el
sustrato se ha metabolizado, cuando se han formado sustancias txicas o ha ocurrido un
cambio de condiciones como pH, temperatura y concentracin de oxgeno disuelto. El
crecimiento celular desciende lentamente o para completamente y en el caso en el que
aun pueda estar ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o
lisis celular. La biomasa incrementa slo gradualmente o permanece constante durante
la fase estacionaria, aunque la composicin de las clulas puede cambiar (Snchez,
2003; Duarte, 1998).

Fase de muerte: tambin llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva de
energa de las clulas se ha acabado, debido a condiciones de inanicin o como
consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas clulas. El tiempo entre la
fase estacionaria y la fase de muerte depende del microorganismo y el proceso utilizado
(Snchez, 2003; Duarte, 1998).

D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharomyces cerevisiae

La levadura Sacchharomyces cerevisiae es capaz de asimilar una gran variedad de
monosacridos. Tambin puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores,
como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas
necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidn. Estos ltimos substratos deben
ser desdoblados previamente, ya sea por hidrlisis cida y calor (pH 2.5), o por la
actividad de enzimas exgenas de origen microbiano o vegetal: lactasa, glucanasa, a y
b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos industriales, las concentraciones
de carbohidratos fermentables fluctan generalmente entre 6-12% (p/v).

Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a travs
del ciclo de la Gluclisis (o va Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la
energa liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y los usa en la
etapa anablica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos moles de NAD+, mientras
forma los productos de la fermentacin.

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Adems de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga
fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de
micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha
observado un mejor aprovechamiento del nitrgeno cuando sus fuentes son aminocidos
libres o pptidos pequeos, en comparacin con las protenas, porque las proteasas de
la levadura tienen actividad limitada.

La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) est ligada
directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la clula, el
substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento
microbiano y para la formacin de productos excretados. En un cultivo sumergido
discontinuo (cintica) la cintica de consumo de substrato limitante se representa as:

Dnde:

- qs: Velocidad especfica de consumo de substrato
- m: Tasa de mantenimiento

Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:

Velocidad de consumo de substrato para la formacin de los productos ligados al
crecimiento microbiano:


5.- MATERIALES, METODOS Y PROCEDIMIENTOS

MATERIALES.

- Refractmetro, Mosto acondicionado, cepa de Saccharomyces cereviseae.
Termmetro, pH-metro, densmetro 0,9 a 1,1 gr/ml, equipo para medir acidez
titulable.
- Baln de 4 litros, probeta de 250ml.
- Placas petri, pipetas de 10, 5, 2 mL, tubos de ensayo, 3 matraces Erlenmeyer de
litro y de 250 ml.
- Agua peptonada. 200 ml de agar patata glucosa, o OGA o agar suero naranja.

PROCEDIMIENTOS:

Preparar el mosto adecuando la temperatura, Brix, pH, acidez.
Pasteurizar. Enfriar. Inocular la cepa. Iniciar el proceso de fermentacin
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.
Controlar diariamente la temperatura, pH, Y densidad. Airear el mosto. Realizar la
numeracin de levaduras por recuento en placa.

Realizar cuidadosamente las siembras bajo condiciones aspticas, la incubacin y
las lecturas de las placas.

Anotar. Construir la curva de crecimiento de la levadura. Hallar el tiempo de duracin
de las fases lag, logartmica, estacionaria. Hallar el tiempo de duplicacin.
A partir del segundo da de incubacin de levaduras se harn controles de: densidad,
conteo de levaduras utilizando la cmara de neubauer, temperatura, Bx.


Diariamente se hace siembras en
placas petri para tener el recuento de
levaduras que se produce cada da en
la fermentacin.
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Las placas deben ser rotuladas para
hacer el conteo de levaduras y puestas
en anaerobiosis en la cmara de
neubauer

Mediante el contador de colonias
podemos identificar el numero de
microorganismos desarrollados en los
das estudiados.


6.- CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION:

- Curva de crecimiento de levaduras en extracto de manzanas.

Fecha temperatura densidad pH
Levaduras
ufc/ml
observaciones
27/05/13 21 1.079 3.5 2x10
6
Inicia la
fermentacin
28/05/13 22 1.076 3.5 14x10
6

El olor se siente
ms acentuado
29/05/13 23 1.054 3.5 65x10
6

Continua la
fermentacin
30/05/13 22 1.034 3.5 60x10
6

La fermentacin
disminuye
31/05/13 21 0.98 3.5 60x10
6

La fermentacin
llega a su etapa
final
03/06/13 20.5 0.96 3.5 30x10
6
Prcticamente
termino la
fermentacin
04/06/13 21 0.95 3.5 25x10
5

Se paralizo la
fermentacin.


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5.1. DISCUSION DE RESULTADOS

La levadura del vino en este caso la Saccharomyces cerevisiae es un hongo, unicelular,
sus clulas son ovoides y se reproduce por gemacin, miden entre 5 y 10 micras, vienen
estado aislado hasta que adquieren el tamao necesario para dividirse, taxonmicamente
pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden
Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le
permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann,
2005).

Adems posee alta actividad metablica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por
la produccin de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la produccin de etanol,
fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aerbica, ya que la
levadura presenta una fase de adaptacin para producir las enzimas necesarias (tipo
invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y as alcanzar la biomasa adecuada
para la fermentacin en donde la mayor parte del carbono se emplea como energa y slo
el 2% se asimila como material celular (Snchez, 2010).

En el transcurso de la fermentacin hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptacin en
el que no hay incremento en el nmero de clulas, sino que se adaptan al medio y en
ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales; 2) exponencial o log, donde
las clulas se reproducen sin limitacin de de sustancias nutritivas a velocidad mxima y
toman sustratos, excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la estapa
donde el crecimiento celular desciende o para completamente ya que se han
transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el
medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las clulas mueren, debido a que su
reserva de energa se ha agotado (Snchez, 2003).

0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
80000000
0 2 4 6 8 10
u
f
c
/
m
l

dias de fermentacion
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Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de
cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y etanol
durante el proceso de fermentacin (Feldmann, 2005).

En esta prctica se monitore el crecimiento de Saccharomyses cerevisiae, con el fin de
medir el cambio de diferentes parmetros, como pH, acidez y unidades formadoras de
colonias, as como la duracin de cada etapa del crecimiento. Y as adquirir
conocimientos para realizar experimentos de este tipo y adems aplicarlo en la
elaboracin de productos fermentados.

7.- CONCLUSIONES:

La fermentacin de verduras es una de la formas de conservar alimentos que est
ms extendida por el mundo. El comer pickles en cada comida puede ayudar a la
digestin y asimilacin de lo comido.
El primer microorganismo en crecer en vegetales puesto a fermentar, es el
Leuconostoc mesenteroides el cual degrada la glucosa por va heterofermentativa
produciendo CO2, cido lctico, etanol, etc.
Los lactobacilos que no producen gas, principalmente especies de Lactobacillus
plantarum, contienen la produccin de cido, elevando la acidez al 1,5 2,0 %, esta
bacteria produce cido lctico a partir de la fermentacin de los azcares.
Los principales organismos para producir cido lctico son: el Streptococccus y el
Lactobaccillus, dependiendo del uso que se le da para obtener un producto tratado
con dicho cido, el beneficio que nos presta este cido es el de conservar los
alimentos sin alterar nutrientes ni su composicin qumica.
En esta prctica se monitore la cintica de crecimiento de levaduras, evaluando
parmetros como pH, acidez, consumo de sustrato, densidad y unidades formadoras
de colonias; y de esta forma conocer cmo varan cada uno de ellos con respecto al
tiempo (manteniendo constantes las condiciones de operacin), adems se llev a
cabo la medicin del crecimiento de levaduras, que arroj una grfica en la que se
observ claramente las cuatro etapas del crecimiento, conforme pas el tiempo, la
levadura metaboliz el sustrato acidificando el medio, aumentando las unidades
formadoras de colonias y disminuyendo la cantidad de glucosa en el medio. El
monitoreo de la cintica de crecimiento de microorganismos es de gran importancia,
en especial la de Saccharomyces cerevisiae, por sus tantas aplicaciones, ayudando
as a obtener productos con la calidad o caractersticas deseadas u optimizar
procesos.
En la prctica de crecimiento de levaduras se hizo uso del azcar del vino para el
crecimiento de levaduras; donde se le dio condiciones adecuadas de temperatura,
acidez, los Brix; esto durante una semana en biorreactores dio un favorable
crecimiento; solo que puede haber existido pequeos errores de conteo que se
puede reflejar en la curva; ya que no se control durante los ltimos das, sin
embargo se debi dar un crecimiento ptimo.

8.- BIBLIOGRAFIA:

- Biosca J., Fernndez R., Larroy C., Gonzlez E. y Pars X. (2002). Descripcin y
funciones metablicas de las alcohol deshidogenadas de Saccharomyces cerevisiae.
Algunos aspectos de ingeniera metablica aplicados a la fabricacin de la cerveza.
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Ciencias.
Universidad Autnoma de Barcelona. Espaa.