Qumica de los Alimentos

Volumen 119, Nmero 2 , 15 de marzo de 2010, Pages 851-858

Mtodos analticos
Extraccin asistida por ultrasonido de polifenoles (glucsidos
flavanona) de naranja ( Citrus sinensis L.) Peeling
Muhammad Kamran Khan ,
Maryline Abert-Vian ,
Anne-Sylvie Fabiano-Tixier ,
Olivier Dangles ,
Farid Chemat
,

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DOI: 10.1016/j.foodchem.2009.08.046
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Abstracto
En el presente estudio sobre la extraccin de polifenoles especialmente flavanonas de naranja
( Citrus sinensis L.) cscara por el uso de etanol como disolvente de calidad
alimentaria. Despus de un estudio preliminar muestran que se alcanz el mejor rendimiento
de extraccin para un tamao de partcula de 2 cm
2
, se puso en marcha una metodologa de
superficie de respuesta (RSM) para investigar la influencia de las variables de proceso en la
extraccin asistida por ultrasonido (Emiratos rabes Unidos), seguido de un diseo central
compuesto enfoque (CCD). El anlisis estadstico revel que las condiciones optimizadas
fueron una temperatura de 40 C, una potencia de sonicacin de 150 W y una mezcla 4:1 (v /
v) de etanol: proporcin de agua. El contenido de fenoles totales alta (275,8 mg de cido glico
equivalent/100 g FW), las concentraciones de flavanona (70,3 mg de naringina y 205,2 mg de
hesperidin/100 g FW) y rendimiento de extraccin (10,9%) obtenidos a partir optimizado EAU
ha demostrado su eficacia a la hora en comparacin con el mtodo convencional. Adems, la
actividad antioxidante determinado por las pruebas de DPPH y ORAC confirm la idoneidad de
EAU para la preparacin de extractos de plantas ricos en antioxidantes.
Palabra clave
Ultrasonido , Extraccin , Antioxidante , Subproducto , cscara de naranja

1. Introduccin
Los estudios epidemiolgicos han sugerido que los efectos beneficiosos de los ctricos (ricos en
flavanonas) contra muchas enfermedades degenerativas como las enfermedades
cardiovasculares y algunos tipos de cncer ( Benavente-Garca et al., 1997 y Trpoli et al.,
2007 ). Estas influencias positivas en la salud humana se ha incrementado de manera
significativa el consumo de ctricos en los ltimos aos y est aumentando de forma continua
con una produccin mundial estimada de los ctricos hasta 72 millones de toneladas en el
perodo de sesiones 2007-2008, entre las cuales las principales frutas de color naranja de
importancia comercial representa unos 45 millones de toneladas ( USDA, 2008 ). El uso
domstico e industrial de estas grandes cantidades de frutas ctricas, especialmente para la
produccin de jugo, da como resultado la acumulacin de grandes cantidades de subproductos
tales como residuos de cscara, de semillas, de clulas y la membrana que representan
aproximadamente la mitad del peso de la fruta . Estos subproductos se pueden utilizar para la
produccin de melaza, pectinas, aceites esenciales, limoneno y la alimentacin del ganado
( Bocco et al., 1998 , Jeong et al., 2004 , Li et al., 2006a y Li et al., 2006b ).Adems, ctricos
subproductos son una buena fuente de compuestos fenlicos, especialmente los glucsidos de
flavanona caractersticos que incluyen principalmente naringina, hesperidina, Narirutina, y
neohesperidina. En la actualidad, su extraccin de las cscaras de ctricos ha atrado
considerable inters cientfico para usarlos como antioxidantes naturales, principalmente en los
alimentos para prevenir la rancidez y la oxidacin de los lpidos ( Anagnostopoulou et al.,
2006 , Peschel et al., 2006 y Zia-ur-Rehman, 2006 ). De hecho, en los ltimos aos, una gran
cantidad de investigacin se ha centrado en las plantas y sus subproductos para extraer los
antioxidantes naturales y de bajo costo que pueden reemplazar los aditivos sintticos tales
como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT), que podra ser el hgado -
daar, carcingeno ( Ak y Glin, 2008 ) y ms generalmente txicos ( Moure et al., 2001 ).
Hasta ahora, varias tcnicas de extraccin convencionales han sido reportados para la
extraccin de fenoles a partir de cscaras de ctricos como la extraccin con disolvente
( Anagnostopoulou et al., 2006 ,Jeong et al., 2004 , Li et al., 2006a , Manthey y Grohmann,
1996 , Xu et al., 2007 y Zia-ur-Rehman, 2006 ), la extraccin de agua caliente ( Xu et al.,
2008 ), la extraccin alcalina ( Bocco et al., 1998 y Curto et al., 1992), basada en la extraccin
de resina ( Calvarano et al., 1996 y Kim et al., 2007 ), la enzima de extraccin asistida ( Li et
al., 2006b ), haz de electrones y basados -irradiacin de extracciones ( Kim et al.,
2008 y Oufedjikh y col ., 2000 ) y la extraccin de fluido supercrtico ( Giannuzzo, Boggetti,
Nazareno, y Mishima, 2003 ). Estas tcnicas de extraccin convencionales o ms innovadoras
pueden ya sea causar la degradacin de los compuestos especficos debido a las altas
temperaturas y largos tiempos de extraccin como en la extraccin de solventes, o plantear
algunos riesgos relacionados con la salud, debido a la falta de conciencia de los criterios de
seguridad durante la irradiacin. Adems, la extraccin de la enzima asistida es limitado debido
a problemas de desnaturalizacin de la enzima. Con el desarrollo del concepto de "Qumica
Verde" durante los ltimos aos, las tcnicas respetuosas del medio ambiente se estn
volviendo ms y ms atractivo. La extraccin de compuestos bioactivos con irradiacin de
ultrasonido (20-100 kHz) es una de las tcnicas de extraccin prximas que puedan ofrecer
una alta reproducibilidad en tiempos ms cortos, manipulacin simplificada, reduccin de
consumo de disolvente y la temperatura y menor consumo de energa ( Chemat, Tomao, y
Virot, 2008 ).
Durante la sonicacin, el proceso de cavitacin provoca la inflamacin de las clulas o la
ruptura de las paredes celulares, lo que permite altas tasas de difusin a travs de la pared
celular en el primer caso o una simple eliminacin por lavado de los contenidos de las celdas
en la segunda ( Vntoru, 2001 ). Adems del disolvente, temperatura y presin, mejor
recuperacin de contenido de la celda se pueden obtener mediante la optimizacin de factores
de aplicacin de ultrasonido, incluyendo frecuencia, potencia y tiempo de sonicacin, as como
la distribucin de ondas ultrasnicas ( Wang y Weller, 2006 ). Optimizacin de la extraccin
asistida por ultrasonido (EAU) se ha descrito recientemente para extraer hesperidina de
Penggan ( Citrus reticulata ) peel ( Ma, Chen, Liu, y Ye, 2008 a), cidos fenlicos y glucsidos
flavanona de Satsuma mandarina ( Citrus unshiu Marc) cscara ( Ma et al., 2009 y Ma et al.,
2008b ) y el contenido total de fenlicos de Penggan cscara ( Ma, Chen, Liu, y Ye, 2008a )
(vase el cuadro 1 ). En estas obras, metanol surgi como una extraccin de disolvente
adecuado para alcanzar buenos rendimientos de los compuestos fenlicos mencionados
anteriormente. Sin embargo, la calidad alimentaria disolventes orgnicos ambientalmente
benignas y no txicos, como el etanol, n -butanol e isopropanol son recomendados por la Food
and Drug Administration de EE.UU. para fines de extraccin ( Bartnick, Mohler, y Houlihan,
2006 ).
Tabla 1.
Publicaciones recientes sobre la extraccin de polifenoles bajo irradiacin de ultrasonido.
El material vegetal Los analitos Comentarios Referencias
Satsuma mandarinaCitrus
unshiuMarc
Los cidos
fenlicos (PA)
Tiempo UAE = 10-40
min; Maceracin durante 8 horas
para obtener rendimientos similares
de PA
Ma et al. (2009)
Du Zhong Vosotros Folium
eucommiae
Los flavonoides Emiratos rabes Unidos se encontr
ms eficiente que la calefaccin,
microondas-y extracciones con
enzimas asistida
Huang, Xue, Niu,
Jia y Wang (2009)
El salvado de trigo Triticum
aestivum
Heteroxilanos
Fenoles-ricos
Tiempo de extraccin redujo de 60
min (extraccin convencional) a 5
min (Emiratos rabes Unidos)
Hromdkov,
Kot'lov y
Ebringerov
El material vegetal Los analitos Comentarios Referencias
(2008)
Penggan C.reticulata Hesperidina Rendimientos comparables con
EAU, pero menos degradacin de
hesperidina en comparacin con la
extraccin de Soxhlet
Ma et al. (2008c)
Satsuma
mandarina C.unshiu Marc
Los cidos
fenlicos y
glucsidos
flavanona
Aumento en el contenido de
polifenoles y la actividad
antioxidante de los extractos
obtenidos por EAU en comparacin
con maceracin
Ma et al. (2008b)
Penggan C.reticulata Contenido de
fenoles totales
(TPC)
TPC aument en el aumento de
tiempo de irradiacin y la
temperatura
Ma et al. (2008a)
Winged zarza
ardienteEuonymus alatus
Los flavonoles
rutina y quercetina
Eficiencia EAU monitoreado por
microscopa
Yang y Zhang
(2008)
Opciones de la tabla
Una bsqueda en la literatura no di ninguna referencia acerca de los informes anteriores
sobre los Emiratos rabes Unidos de los compuestos fenlicos de las cscaras de naranja por
el uso de disolventes de grado alimentario. El objetivo de este trabajo es dar una idea de la
potencialidad de los Emiratos rabes Unidos en la preparacin rpida de los extractos ricos en
polifenoles (glucsidos especialmente flavanona) de cscaras de naranja con buenos
rendimientos. Varios parmetros que podran afectar a la eficacia de la extraccin fueron
evaluados y optimizados utilizando un enfoque estadstico del diseo experimental. Por ltimo,
los resultados de los EAU optimizados obtenidos se compararon con los obtenidos mediante el
uso de un mtodo de extraccin convencional.
2. Materiales y mtodos
2.1. El material vegetal
Cerca de 10 kg de naranja ( Citrus sinensis L. Osbeck de Valencia late cultivar, Espaa)
cscaras despus de la extraccin de jugo se recogieron de forma local desde una industria de
jugos ctricos (Vaucluse, Francia). Se almacenaron en un congelador a -20 C.
2.2. Productos Qumicos
Los disolventes utilizados fueron de grado analtico y suministrados por VWR International
(Darmstadt, Alemania). Flavanona glucsidos (naringina, hesperidina) fueron adquiridos de
Extrasynthese (Genay, Francia), cido cafeico de Sigma-Aldrich (Steinhaus, Alemania), y
Trolox de Acros Organics (Slangerup, Dinamarca). DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), AAPH
(2,2 '-azobis (2-metil) dihidrocloruro propionamidina) y fluorescena se obtuvieron de Alfa Aesar
(Karlsruhe, Alemania), Sigma-Aldrich (Steinhaus, Alemania) y Acros Organics (Morris Plains,
Estados Unidos), respectivamente.
2.3. Instrumentacin
2.3.1. Aparato de sonicacin
Extraccin asistida por ultrasonido (EAU) se realiz con un PEX 3 Sonifier (REUS, Contes,
Francia), compuesto por una jarra de inox con 23 13,7 cm Dimensiones internas con una
capacidad mxima de 3 L, y un transductor, en la base de la jarra , que funciona a una
frecuencia de 25 kHz con una potencia mxima de entrada de 150 W. El manto de doble capa
nos permiti controlar la temperatura del medio de refrigeracin por sistemas de calefaccin
/. La potencia de salida del generador es de 150 W, mientras que la potencia disipada en el
medio es aproximadamente de 60 W, como se mide por calorimetra. El diagrama detallado del
aparato se muestra en la fig. 1 .

La figura. 1.
Aparato de ultrasonidos utilizado por los Emiratos rabes Unidos.
Opciones Figura
2.3.2. El anlisis por HPLC
Anlisis de HPLC se realizaron utilizando un sistema de HPLC Waters (Milford, MA) que consta
de una bomba Waters 600E, un inyector automtico Waters 717, un detector de matriz de
fotodiodos Waters 2996.El sistema de bombas de HPLC, muestreador automtico, temperatura
de la columna y de red de diodos se supervisa y controla mediante el uso de programas de
software Waters Empower 2 Cromatografa de datos.La longitud de onda utilizada para la
cuantificacin de las flavanonas glucsidos con el detector de diodo era 280 nm. La separacin
cromatogrfica se llev a cabo en una columna de taponado terminalmente Purospher estrella
RP-18 (250 x 4 mm DI; 5 m de tamao de partcula de VWR), con una columna de guardia de
RP-18 (4 4 mm DI; tamao de partcula 5 m Tambin de VWR). La columna de la columna y
el protector protegido terminalmente se llevaron a cabo a 37 C y el caudal se fij en 1 ml /
min. La fase mvil consisti de dos disolventes: cido actico 0,5% (A) y 100% de acetonitrilo
(B). El gradiente de disolvente en relaciones de volumen fue la siguiente: 10-30% de B durante
20 min. El gradiente de disolvente se aument a 35% de B en 25 min y se mantuvo a 35% de B
durante 5 min. El volumen de inyeccin fue de 20 l. Los anlisis se realizaron al menos tres
veces y slo se informaron los valores medios. La cuantificacin se llev a cabo utilizando el
mtodo estndar externo y las concentraciones finales se calcularon en mg/100 g de peso
fresco.
2.3.3. Espectrofotmetros
Las medidas de absorbancia se realizaron en un Spectronic GENESYS 5 UV-Visible
espectrofotmetro (longitud de onda: 200-1100 nm) equipado con un soporte multicelular de
ocho posiciones. Las mediciones de la intensidad de la fluorescencia se llevaron a cabo en un
SPEX-Fluoromax 2 espectrofluormetro de Jobin Yvon.
2.4. Procedimiento de extraccin
Un estudio comparativo ha sido realizado entre las tcnicas convencionales y asistida por
ultrasonido despus de la optimizacin de este ltimo. EAU : en experimentos dirigidos a
optimizar la temperatura de extraccin, potencia de ultrasonidos, y el porcentaje de etanol,
cscaras de naranja (0,25 g / ml) se sometieron a ultrasonidos en el disolvente (mezcla de
etanol-agua) durante 30 min. Los parmetros ptimos se utilizaron adems para investigar el
tiempo de extraccin requerida para el rendimiento mximo.extraccin con disolventes ( SE ): a
la extraccin de control se llev a cabo mediante el uso de la temperatura y el porcentaje de
etanol que se encontraron ptimo para los Emiratos rabes Unidos.
2.5. Estudio Tamao de partcula
Una serie de cinco experimentos con cinco tamaos de partcula diferentes (0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y
2,5 cm
2
) se llev a cabo mediante el procedimiento de extraccin con disolvente convencional
con las condiciones de punto central (25 C, solucin de etanol-agua 1:1, agitacin, 30
min). Pelar partculas que tienen un espesor de aproximadamente 0,5 cm se cortaron al azar
con ayuda de cubos de acero calibradas.
2.6. Contenido de fenoles totales (TPC)
El TPC de las muestras se midi con un kit (SEPPAL (Isitec-Lab), Francia) especialmente
adecuado para la medicin de TPC de alimentos y bebidas. Este kit incluye el reactivo A
(reactivo de Folin-Ciocalteu modificado), el reactivo B (tampn alcalino) y una solucin de cido
glico (3 g / l). Un pequeo volumen (20 l) de H 2 O la solucin (en blanco), cido glico
(estndar) o el extracto (muestra) se mezcl con el reactivo A (2 ml). Despus de 1 min, se
aadi 1 ml de reactivo B para cada muestra. Las mezclas se dejaron reposar durante 30 min
en la oscuridad a temperatura ambiente. Entonces, su absorbancia se midi a 760 nm. TPC se
calcularon utilizando las frmulas siguientes: TPC = 3 (muestra de absorbancia - absorbancia
del blanco) / (absorbancia estndar - absorbancia del blanco). Mediciones del TPC se
realizaron tres veces y los valores medios, expresados como mg glico acid/100 g de peso
fresco (mg GA/100 g FW), fueron reportados.
2.7. Rendimiento determinacin
Se elimin el etanol a partir de los extractos por evaporacin bajo vaco a 40 C en un
evaporador rotatorio.Entonces, las muestras se congelaron y se liofilizaron para eliminar el
agua. Finalmente, el rendimiento de cada extracto se calcula a partir de su peso y se expresa
en porcentaje.
2.8. Diseo del experimento
Diseo de Box-Wilson, tambin llamado diseo central compuesto (CCD), se usa para
conseguir el mximo de informacin sobre el proceso a partir de un nmero mnimo de posibles
experimentos. El tipo de CCD utilizado en este estudio fue de diseo central centrada en las
caras (CCF) compuesto experimental para determinar las condiciones ptimas de los Emiratos
rabes Unidos. La aplicacin de un diseo CCF es una manera conveniente para optimizar un
proceso con tres niveles (-1, 0 y 1) para cada factor. En este diseo, los puntos de estrella
estn en el centro de cada cara del espacio factorial, por lo tanto alpha = 1. Se necesita
este diseo para evaluar los efectos e interacciones de tres variables independientes, es decir,
la temperatura ( C) ( X 1), potencia (W) ( X 2) y etanol: proporcin de agua (% v / v) ( X 3). Los
niveles codificados y los valores naturales de los factores usados en este diseo experimental
se muestran en la Tabla 2 en paralelo. Un total de 20 combinaciones diferentes, incluyendo
seis repeticiones del punto central, cada uno designado por el valor codificado 0, fueron
elegidos de forma aleatoria de acuerdo con una configuracin de CCF por tres factores. Los
parmetros de optimizacin seleccionados fueron TPC despus de 30 minutos (mg glico
acid/100 g de peso fresco) ( Y 1), la concentracin de naringina (mg/100 g PF) ( Y2), la
concentracin de hesperidina (mg/100 g PF) ( Y 3 ), el rendimiento de los extractos (%) ( Y 4) y
constante de velocidad de extraccin (min
-1
) ( Y 5).
Tabla 2.
Diseo central compuesto de tres variables con sus respuestas observadas.
Exp.No
.
Variables
codificadas

Variables de
Decoded

Respuestas

X
1
X
2
X
3
T

TPC 30
min
(mg
GA/10
0 g)
Naringin
a
(mg/100
g)
Hesperidin
a (mg/100
g)
Rendimient
o (%)
Constant
e de la
tasa de
extracci
n (min
-1
)
1 0 0 0 2
5
10
0
5
0
185.49
3
36.193 119.290 7.8 0.0260
2 1 1 1 4
0
15
0
8
0
233.46
0
48.610 146.729 10.03 0.0402
3 0 0 0 2
5
10
0
5
0
185.06
8
32.721 112.853 7.77 0.0197
4 1 -1 1 4 50 8 197.64 33.347 113.332 8.09 0.0170
Exp.No
.
Variables
codificadas

Variables de
Decoded

Respuestas

X
1
X
2
X
3
T

TPC 30
min
(mg
GA/10
0 g)
Naringin
a
(mg/100
g)
Hesperidin
a (mg/100
g)
Rendimient
o (%)
Constant
e de la
tasa de
extracci
n (min
-1
)
0 0 6
5 -1 -1 -1 1
0
50 2
0
121.25
9
17.831 71.692 6.27 0.0126
6 0 -1 0 2
5
50 5
0
162.48
0
28.247 93.183 6.97 0.0150
7 0 0 0 2
5
10
0
5
0
183.53
1
35.694 118.834 7.81 0.0215
8 0 0 0 2
5
10
0
5
0
185.99
4
33.295 113.186 7.76 0.0210
9 -1 1 1 1
0
15
0
8
0
187.27
6
34.007 117.123 7.93 0.0253
10 1 -1 -1 4
0
50 2
0
140.35
2
21.640 86.740 6.81 0.0152
11 0 0 -1 2
5
10
0
2
0
174.47
2
30.860 99.236 7.14 0.0153
12 0 0 1 2
5
10
0
8
0
192.35
2
32.260 110.866 7.96 0.0189
13 0 0 0 2
5
10
0
5
0
184.66
6
32.051 112.310 7.78 0.0208
14 -1 1 -1 1
0
15
0
2
0
169.91
8
29.345 96.847 7.09 0.0292
15 -1 0 0 1
0
10
0
2
0
159.21
7
29.531 98.749 6.89 0.0164
16 1 1 -1 4
0
15
0
2
0
225.30
2
36.469 124.489 9.59 0.0353
17 1 0 0 4
0
10
0
5
0
190.87
8
31.257 106.286 8.15 0.0186
18 -1 -1 1 1
0
50 8
0
155.25
8
24.561 87.903 6.86 0.0125
19 0 0 0 2
5
10
0
5
0
186.49
6
34.051 118.650 7.75 0.0211
20 0 1 0 2
5
15
0
5
0
213.18
8
35.146 119.252 8.93 0.0326

T = X 1 = temperatura ( C); P = X 2 = potencia (W); E = X 3 = etanol: proporcin de agua (% v / v).
Opciones de la tabla
Los diseos experimentales usados fueron construidas y se procesaron los resultados
experimentales utilizando el software Statgraphics Plus (versin 5.1, Estadsticos Grficos
Corporation, Rockville, EE.UU., 2000). A continuacin, se realiz un anlisis de varianza
(ANOVA) con el nivel de confianza del 95% para cada variable de respuesta con el fin de
probar la importancia de modelo y de idoneidad. El F -valor en ANOVA es la relacin de error
cuadrtico medio para el error puro obtenido a partir de las repeticiones en el centro de diseo
y la P -valor define la importancia de las diferentes variables. Una descripcin de los efectos
significativos obtenidos de ANOVA para TPC (30 min) fue presentado por un grfico de Pareto
Estandarizado.
2.9. Los estudios cinticos
2.9.1. Constante de la tasa de extraccin ( k )
Durante cada proceso de extraccin, la absorcin de 1 ml de la mezcla se realiz a 5, 10, 20 y
30 min para determinar los valores de TPC correspondientes. Suponiendo una acumulacin de
primer orden de fenoles totales en solucin ( . Fig. 4 ), se puede escribir:
TP C t = TP C ( 1 - e
-
k t )
Gire MathJaxen

TPC t : valor TPC en el momento t , TPC : valor TPC final (determinado en t = 8 h), k :
constante aparente de velocidad de primer orden de extraccin. Por lo tanto, a partir de los
grficos lineales de Ln-(1 - (TPC t / TPC )) contra el tiempo (coeficiente de correlacin en el
intervalo de 0,90-0,99), los k valores podran ser determinados.
2.9.2. La energa de activacin ( E a )
A partir de la ecuacin de Arrhenius, las energas de activacin para la extraccin de fenoles
totales en los Emiratos rabes Unidos y SE se determinaron a partir de grficas de Ln k frente
a 1 / T , donde T es la temperatura absoluta (283, 298 y 313 K).
2.10. Pruebas de antioxidantes
Como no existe un mtodo estandarizado para evaluar el potencial antioxidante de los
alimentos y los sistemas biolgicos, se recomienda para evaluar la actividad antioxidante
mediante diversos mtodos (Frankel & Meyer, 2000 ).
2.10.1. Ensayo de DPPH
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) es un establo muy coloreado de los radicales libres que
pueden abstractas lbiles tomos de hidrgeno de los antioxidantes fenlicos con la formacin
concomitante de una hidrazina incoloro (DPPH-H) ( Diouf, Stevanovic, y Cloutier, 2009 ) . La
actividad de eliminacin de radicales libres (FRSA) de un extracto puede ser expresado como
el porcentaje de DPPH reducida por una cantidad dada de extracto. El FRSA de los extractos
se evalu de acuerdo con el mtodo descrito por Mimica-Dukic, Bozin, Sokovic, y Simin
(2004) , con algunas modificaciones. El extracto se disolvi en 50% (v / v) de metanol acuoso
con una concentracin final de 5 g / L. Un pequeo volumen (0,1 ml) de la solucin de extracto
se mezcl con 2,0 ml de una solucin 0,1 mM de DPPH en MeOH y la mezcla se dej en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 60 min. La absorbancia se midi a 517 nm. El FRSA
total de cada extracto se expres como el porcentaje de DPPH reducida y se calcul mediante
la siguiente ecuacin: FRSA = 100 (absorbancia inicial - absorbancia final) / absorbancia
inicial. La absorbancia inicial y la absorbancia final son los valores de absorbancia de DPPH a
tiempo cero y despus de 60 min, respectivamente.
2.10.2. ORAC (capacidad de absorcin de radicales de oxgeno) de ensayo
En este mtodo, los radicales peroxilo (ROO hidrfilos ) Generado por la descomposicin
trmica de la AAPH compuesto diazo oxidar la sonda fluorescente FL, causando as una
extincin de la fluorescencia.Por lo tanto, la inhibicin de este enfriamiento rpido por un
antioxidante es una medida de su capacidad para reducir ROO ( Gomes, Fernandes, y Lima,
2005 ). El mtodo ORAC empleada es una adaptacin de un mtodo descrito previamente
por Ou, Hampsch-Woodill, y Prior (2001) . Todos los reactivos se prepararon en un tampn
fosfato 75 mM a pH 7,4. Trolox (0-75 mM) se utiliz como el estndar. Una mezcla de la sonda
fluorescente de fluorescena (FL, 2 ml de una solucin 26 nM en tampn de fosfato) y extraer
(15 l de una solucin de 5 g / L en MeOH) se pre-incubaron durante 10 min a 37 C. A
continuacin, se aadi 1 ml de una solucin 664 mM AAPH en el tampn fosfato. La
intensidad de fluorescencia se midi cada 2 min durante 40 min con longitudes de onda de
excitacin y emisin fijados en 490 y 511 nm, respectivamente. Su decadencia se refiere a FL
oxidacin por los radicales peroxilo derivados AAPH. El valor ORAC se calcula a partir del rea
bajo la curva que expresa la extincin de fluorescencia de FL en presencia del extracto en
comparacin con las curvas construidas con concentraciones conocidas de Trolox. Las
mediciones se realizaron por triplicado. El rea bajo la curva (AUC) se calcul como AUC = 1
+ f 2 / f 0 + f 4 / f 0 ... + f i / f 0donde f i es la lectura de fluorescencia en el tiempo i (en s). El
AUC neto se obtuvo restando el AUC de la pieza en bruto (sin antioxidante). Los resultados se
expresaron como milimoles de equivalentes Trolox (TE) por gramo de muestra sobre una base
de peso fresco (TE/100 mmol g FW). Ambas pruebas antioxidantes (DPPH y ORAC) se
realizaron al menos tres veces para cada extracto y slo se registraron valores medios.
3. Resultados y discusin
3.1. Influencia del tamao de partcula
A partir de estudios anteriores ( Cuoco et al., 2009 , Garca-Ayuso y Luque de Castro,
1999 , Vilkhu et al., 2008 y Wang y Weller, 2006 ), el tamao de partcula se considera uno de
los factores importantes que pueden afectar a la eficiencia de extraccin de polifenoles de las
cscaras de naranja. Por lo tanto, los experimentos preliminares sobre cscaras de naranja de
0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 cm
2
dieron rendimientos finales de 3,44%, 3,65%, 4,32%, 4,41% y
4,38%, respectivamente. Un tamao de 2 cm
2
fue seleccionado como un ptimo para nuestros
experimentos de extraccin. El rendimiento ligeramente inferior observado con partculas de
tamao ms pequeo podra ser debido a las partculas que permanecen en la superficie del
disolvente durante la extraccin, lo que limita su exposicin a las ondas ultrasnicas.
3.2. Compuestas central resultados de diseo
Los valores codificados y descodificados de las variables independientes y las respuestas
obtenidas en el estudio multivariante para cada experimento se muestran en la Tabla 2 . En
esta segunda parte del estudio, el efecto de la temperatura ( C) X 1, de energa ultrasnica
(W) X 2 y etanol: proporcin de agua (% v / v) X 3 en la UAE de polifenoles cscara de naranja
en trminos de TPC (mg GA/100 g FW) Y 1, la concentracin de naringina (mg/100 g PF) Y 2 y
la concentracin de hesperidina ( mg/100 g PF) Y 3 se evalu mediante la metodologa de
superficie de respuesta. Identificacin de naringina y hesperidina se logr mediante la
comparacin de sus tiempos de retencin y los espectros UV con las normas ( . Fig. 2 ). El
rendimiento (%)Y 4 y la constante de velocidad de extraccin ( k ) (min
-1
) Y 5 tambin se
determinaron. ANOVA para la determinacin de TPC (30 min) dio un coeficiente de
determinacin ( R
2
) de 98,3%, lo que indica una estrecha concordancia entre los valores
experimentales y predictivos. Datos del ANOVA de TPC tambin se muestran en un grfico de
Pareto ( . Fig. 3 ), que representa los efectos significativos de todas las variables (lineales y
cuadrticas) y sus interacciones. La longitud de las barras es proporcional a la magnitud
absoluta de los coeficientes de los efectos estimados mientras que la lnea discontinua
representa la magnitud mnima de efectos estadsticamente significativos (95% de intervalo de
confianza) con respecto a la respuesta. Se puede observar que el poder de ultrasonido tiene la
influencia ms importante en el TPC seguido por la temperatura, etanol: proporcin de agua, la
interaccin de la energa y etanol: proporcin de agua, ajustado plazo de la temperatura y la
interaccin de la energa y la temperatura. La falta de significacin de los trminos de
productos cruzados sugiere la ausencia de interacciones entre las variables en el rango
estudiado.

La figura. 2.
El anlisis por HPLC de un extracto obtenido por extraccin asistida por ultrasonido de las cscaras de
naranja.
Opciones Figura

La figura. 3.
Diagrama de Pareto para el contenido de fenoles totales (mg GA/100 g) a 30 min.
Opciones Figura
Los datos experimentales construidas despus de correr 20 ensayos nos permiti encajar
todas las respuestas en funcin de la temperatura, la potencia y el etanol: la relacin de
agua. Los de segundo orden ecuaciones polinmicas de las superficies de respuesta obtenidos
son los siguientes:
ecuacin( 1 )

Gire MathJaxen

ecuacin( 2 )

Gire MathJaxen

ecuacin( 3 )

Gire MathJaxen

ecuacin( 4 )

Gire MathJaxen

ecuacin( 5 )

Gire MathJaxen

donde T es la temperatura ( C), P la potencia de ultrasonidos (W) y E el etanol: proporcin de
agua (% v / v).
3.3. Las condiciones ptimas
Optimizacin de superficie de respuesta se puede encontrar en funcin de las tres variables
clave, a saber, la temperatura, la energa y etanol: proporcin de agua. Las condiciones
ptimas obtenidos a partir de las primeras derivadas de la ecuacin polinmica de segundo
orden se derivaron un segundo tiempo. Los derivados se igualaron a continuacin, a 0 y
resueltos en un sistema de ecuaciones. Los valores codificados obtenidos a partir de estas
ecuaciones fueron por lo tanto decodificados y redondeadas con el fin de ser aplicado al
dispositivo. Los valores naturales obtenidos correspondientes a las condiciones ptimas para
cada respuesta fueron como sigue: Y 1 = 40 C, 150 W, 80%; Y 2 = 40 C, 150 W, 80%; Y 3 =
40 C, 150 W , 80%; Y 4 = 40 C, 16 W, 80%; Y 5 = 39 C, 50 W, 69%. Como se esperaba y
de acuerdo con las superficies de respuesta, la eficacia de la extraccin en trminos de TPC,
las concentraciones naringin y hesperidina aumenta mediante el aumento de todos los tres
factores. En todas estas respuestas, los valores ptimos fueron ms all de los lmites que
hemos seleccionado. Por lo tanto, los valores finalmente seleccionados corresponden a los
valores mximos seleccionados para definir el dominio experimental (Lucchesi, Smadja,
Bradshaw, Louw, y Chemat, 2007 ). Sobre la base de nuestros principales respuestas
( Y1, Y 2, Y 3), la temperatura de 40 C, la potencia de ultrasonido de 150 W y etanol:
proporcin de agua (v / v) de 80% fueron elegidos como valores ptimos para ir con nuestros
experimentos. Un estudio de repetibilidad se llev a cabo mediante el uso de estas condiciones
ptimas para evaluar la capacidad de prediccin de los modelos y se encontr que los
resultados de acuerdo con los obtenidos en el segundo juicio {1 (40 C), 1 (150 W), 1 (80% de
etanol)} de diseo experimental. Varias investigaciones recientes sobre la extraccin de
contenidos fenlicos de piel de ctricos tambin han sugerido condiciones de funcionamiento
similares a las recomendadas en este estudio ( Li et al., 2006a , Ma et al., 2008c y Ma et al.,
2009 ).
3.4. Comparacin de los Emiratos rabes Unidos vs SE
TPC extrae de las cscaras de naranja por los Emiratos rabes Unidos (40 C, 150 W, 80% de
etanol, agitacin) y SE (idem excepto sonicacin) que se muestra en la figura. 4 . El TPC
obtenido por EAU durante 15 min fue significativamente mayor que por SE durante 60
min. Debido a los efectos mecnicos sobre las paredes celulares evidenciadas por microscopa
electrnica de barrido ( Balachandran et al., 2006 y Li et al., 2004 ), EAU permite rendimientos
de extraccin ms altos en perodos de tiempo ms cortos, reduciendo de este modo la entrada
de energa.

La figura. 4.
Comparacin de los contenidos de fenoles totales (mg GA/100 g) de la extraccin asistida por
ultrasonido (UAE) y extraccin con disolventes (SE) .
Opciones Figura
Los principales glucsidos flavanona encuentran en naranja ( C. sinensis ) son naringina y
hesperidina, siendo estos ltimos ms abundantes que las primeras ( Wang, Chuang, y Hsu,
2008 ). Ambos se titularon simultneamente por HPLC de las muestras obtenidas por los
Emiratos rabes Unidos y SE despus de 60 min. Las cantidades de naringina y hesperidina
desde Emiratos rabes Unidos (70,3 y 205,2 mg/100 g de peso en fresco, respectivamente)
fueron considerablemente ms altos que los obtenidos de SE (50.9 y 144.7 mg/100 g PF,
respectivamente). No hay evidencia de la degradacin flavanona bajo tratamiento con
ultrasonidos se pudo encontrar. De hecho, la degradacin de ultrasonidos de fenoles es
tpicamente lento en comparacin con compuestos aromticos ms voltiles que se difunden
ms fcilmente en la burbuja de cavitacin para la pirlisis ( Chowdhury y Viraraghavan,
2009 ). Adems, la degradacin del fenol se ve favorecida a frecuencias ms altas (requerido
para la generacin de radicales hidroxilo por homlisis agua) que la seleccionada en este
trabajo (20 kHz). El rendimiento de extraccin es un factor importante para evaluar la respuesta
de un proceso de extraccin. Se estima que el 10,9% y el 8,6% para los Emiratos rabes
Unidos y SE, respectivamente. Esto es consistente con EAU que tiene un potencial para
extraer productos naturales en mejores rendimientos que las tcnicas convencionales, no slo
en la escala de laboratorio, sino tambin en la escala de planta piloto ( Boonkird, Phisalaphong,
y Phisalaphong, 2008 ).
La extraccin de fenoles totales se encontr CA . 3 veces ms rpido bajo ultrasonidos ( k =
0,10 ( 0,01) min
-1
) como en el procedimiento convencional ( k = 0,03 ( 0,01) min
-1
). En
consonancia, la energa de activacin (6,34 kJ / mol para los Emiratos rabes Unidos vs 34,21
kJ / mol para SE) es menor. Efectos cinticos similares fueron evidenciados por Chemat,
Lagha, AITAMAR, Bartels y Chemat (2004) de los Emiratos rabes Unidos de semillas de
alcaravea en hexano.
3.5. Capacidades antioxidantes
Emiratos rabes Unidos y SE fueron finalmente evaluados comparando el potencial
antioxidante de los extractos correspondientes. Antioxidantes fenlicos son normalmente
capaces de reducir rpidamente las especies reactivas del oxgeno (ROS) que incluyen los
radicales libres, protegiendo as biomolculas ( por ej., cidos grasos poliinsaturados) contra la
oxidacin ( Dangles, 2006 ). El valor FRSA fue del 54% y del 42% para los extractos obtenidos
por los Emiratos rabes Unidos y SE, respectivamente. El aumento en FRSA observ con
Emiratos rabes Unidos, aunque modesto, est de acuerdo con la concentracin de fenoles
totales superior estimada por los Emiratos rabes Unidos y confirma la correlacin habitual
entre la actividad antioxidante y TPC ( Anagnostopoulou et al., 2006 y Ma et al., 2008b ). Se
calcularon los valores ORAC ser 712 mmol TE/100 g FW y 509 mmol TE/100 g FW para los
Emiratos rabes Unidos y SE extractos, respectivamente.
Mientras que los Emiratos rabes Unidos durante 60 min resultados en un aumento del 35-
40% en el TPC vs SE, el FRSA estimado por el ensayo DPPH se incrementa en menos del
30% y el valor ORAC en un 40%.Por lo tanto, el ensayo ORAC aparece ms consistente con el
aumento en el TPC que el ensayo de radical de DPPH. De hecho, el principal flavanonas
naranja naringenina y hesperetina son antioxidantes relativamente dbiles, ya que no muestran
un grupo catecol (1,2-dihidroxibenceno), que es el determinante estructural crtica de fuertes
antioxidantes fenlicos ( Goupy, Loonis, Dufour, y Dangles, 2003 ). Como consecuencia, se
espera que reaccionan muy lentamente con el establo radical DPPH. Por lo tanto, es mucho
ms reactiva radicales, tales como los radicales peroxilo entregados en la prueba ORAC, estn
obligados a expresar plenamente el electrn / actividad H-donacin de flavanonas naranja
( TABART, Kevers, Pincemail, Defraigne, y Amas, 2009 ). Tambin hay que sealar que los
antioxidantes no fenlico, tales como ascorbato (que es sensible a la prueba para la
determinacin de TPC) pueden ser parcialmente responsable de la actividad antioxidante de
los extractos general, especialmente en el ensayo de DPPH donde se espera que las
flavanonas para hacer un menor contribucin.
4. Conclusin
Los Emiratos rabes Unidos de antioxidantes fenlicos de las cscaras de naranja con
mezclas de etanol-agua pareca muy eficaz en comparacin con el procedimiento
convencional. Los resultados de CCD sealaron la potencia de ultrasonidos como el factor ms
influyente en el proceso de los Emiratos rabes Unidos, seguido por la temperatura y etanol:
proporcin de agua. Aunque se utilizaron los mismos volmenes de disolvente en ambos
procesos de extraccin, la duracin del proceso asistida por ultrasonido y en consecuencia la
entrada de energa se redujeron drsticamente sin afectar el rendimiento global. Por lo tanto,
los Emiratos rabes Unidos puede ser llamado una o tcnica 'ecolgico', 'verde'. En general, la
extraccin asistida por ultrasonido de los polifenoles de la comida abundante subproductos
tales como cscaras de naranja y mediante el uso de disolventes de grado alimentario tiene un
fuerte potencial de desarrollo industrial como un proceso eficiente y favorable al medio
ambiente para la preparacin de extractos ricos en antioxidantes naturales dirigido a la
sustitucin de los antioxidantes sintticos.