Métodos de Separación, Analítica III

Encabezamiento
Cuerpo
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Notas
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METODOS INSTRUMENTALES DE
AN
ALISIS
Edineldo Lans Ceballos. M.Sc
Octubre 16 del 2013
2
Contenido
1 CROMATOGRAF
IA 1
1.1 Clasicaci on de los metodos cromatogracos . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.1 Cromatografa en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2 Cromatografa plana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Clasicaci on de los metodos cromatogracos en columna . . . . . . . . . . 2
1.2.1 Cromatografa de Gases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Cromatografa lquida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.3 Cromatografa de udos supercrticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 Algunos terminos y ecuaciones utilizados en cromatografa . . . . . . . . . 3
1.4 Velocidades de separaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.5 Tiempo de retenci on Vs coeciente de partici on . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.6 Relaci on entre el tiempo de retenci on y la constantes de distribuci on . . . . 7
1.7 Asimetra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.8 Tipos de fuerzas que estan presentes en un sistema cromatograco . . . . . 8
1.8.1 Interacciones i onicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.2 Fuerzas de enalce de hidrogeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.3 Fuerzas de repulsi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.9 Bases fsicas de la cromatografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.9.1 Eciencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.9.2 Numero de plato te orico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.9.3 Resolucion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.9.4 Difusi on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.9.5 Ecuaci on de Van Deemter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.10 Ejercicios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA 20
2.1 Ventajas de la cromatografa en capa na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2 Adsorbentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
i
ii
2.2.1 Proceso de adsorcion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.2 Adsorbentes utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 Preparaci on de placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4 Aplicacion de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.5 Eleccion del eluyente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.6 Desarrollo de la cromatografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.7 Evaluacion de un cromatograma de capa na . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.7.1 An alisis cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.7.2 An alisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8 Localizacion de sustancias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8.1 Metodos qumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.8.2 Metodos fsicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.9 Constante Rf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3 CROMATOGRAFIA DE GAS 26
3.1 Cromatograf gas lquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.2 Fase m ovil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Columnas tubulares abiertas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3.1 WCOT :wall coated tubular column . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.2 SCOT: support coated open tubular column. . . . . . . . . . . . . . 27
3.3.3 PLOT: porous layer open tubular column . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.4 Ventajas de las open tubular column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.5 Clases de fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.6 Escogencia de la fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.7 Columnas empacadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.8 Indice de retenci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.9 Programacion de temperatura y presion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.10 Carrier gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.11 Inyecci on de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.1 Inyecion split . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.2 Inyecci on splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.11.3 Inyecci on on column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.12.1 Claseses de detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.13 Preparaci on de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.13.1 Seleccion del metodo en cromatografa de gas . . . . . . . . . . . . 34
3.14 Escogencia del modo de inyecci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.15 An alisis cuantitativo y cualitativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
iii
4 ESPECTROMETR
IA DE MASAS 40
4.1 Cualidades de la espectrometra de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1 Cualidades de indenticaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.2 Cuantica e identica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.3 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.4 Universal y especca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.5 Informaci on estructural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.6 Rapidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2 Tecnicas de ionizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3 Ionizaci on por impacto electr onico (EI) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.4 Ionizaci on qumica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.5 Ionizaci on Qumica negativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.6 Ionizaci on por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.7 Fuentes de desorci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.8 Desorcion por campo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.9 Bombardeo por

Atomos R apidos (FAB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.10 Ionizaci on electrospray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11 Espectr ometro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11.1 Camara de ionizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.11.2 Analizador de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.12 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.12.1 Channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.12.2 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.13 Metodos acoplados a masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.13.1 Aplicaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.13.2 Desventajas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.13.3 Identicaci on de compuestos puros por espectrometra de masas . . 49
4.13.4 Analizador de trampas de iones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCI
ON (HPLC) 50
5.1 Proceso cromatograco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.1.1 Efectos del tama no de las partculas en HPLC . . . . . . . . . . . . 51
5.1.2 Columnas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.3 Columnas analticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.4 Fase estacionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.5 Proceso de elucion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.2 Clasicaci on de la cromatografa lquida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.1 Cromatografa en fase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.2 Cromatografa en fase normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
iv
5.2.3 Cromatografa lquido-lquido o de partici on . . . . . . . . . . . . . 53
5.2.4 Cromatografa de adsorcion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.2.5 Eleccion del solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.3 Gradiente de elucion isocr atica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.4 Seleccion del modo de separaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.5 Solventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.6 Criterios para una buena separaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.6.1 Atributos de una buena separaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.7 Optimizacion con un solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.7.1 Orden de escogencia de un solvente org anico . . . . . . . . . . . . . 58
5.8 Optimizacion con dos o tres solventes org anicos . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.9 Temperatura como una variable en separaciones isocr atica . . . . . . . . . 59
5.9.1 Como se consigue una buena separaci on? . . . . . . . . . . . . . . 59
6 CROMATOGRAF
IA DE FLU
IDOS SUPERCR
ITICOS 61
6.1 Deniciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.2 Car actersticas de un udo supercrtico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3 Analitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.4 Fase Movil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.5 Cosolventes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.5.1 Fludos usados para extracci on supercrtica . . . . . . . . . . . . . . 63
6.6 Forma e inyecci on de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.7 Columnas y fases estacionarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.8 Detectores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.9 Areas donde se utilizan los udos supercrtico . . . . . . . . . . . . . . . . 64
7 ELECTROFORESIS 66
7.1 Introducci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2 Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.2.1 Tipos de electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.2 Electroforesis convencional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
7.2.3 Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
7.2.4 Cambio de sentido del ujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . 71
7.3 Instrumentaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.3.1 Introducci on de la muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
7.4 Sistema de detecci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.4.1 Metodos de absorbancia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.5 Modalidades de la electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
7.5.1 Electroforesis capilar por zona (CZE) . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
v
7.5.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
7.5.3 Isotacoforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Bibliografa 76
Lista de tablas
vi
Lista de guras
1.1 Cromatografa en columna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Asimetra de un pico cromatograco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3 Curva Gaussiana ideal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4 Resolucion de un cromatograma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.5 Ensanchamiento de banda debido a la difusion . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.6 Aplicacion de la ecuacion de Van Deemter en cromatografa de gas . . . . 16
1.7 Isotermas comunes y formas de las bandas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.8 Silanizacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1 Placa cromatograca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2 Siembra de la muestra en una placa cromatograca . . . . . . . . . . . . . 23
2.3 Placa cromatograca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.1 Diagrama esquematico de un cromatografo de gas . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2 Inyecci on split/splitless . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.3 Detector de ionizacion por llama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1 Ionizaci on por impacto electronico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2 Partes de un espectrometro de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3 Esquema interno de un espectr ometro de masas . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.4 Detector channeltron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.5 Copa de faraday . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.1 Cromatografa fase inversa.(Fase m ovil de baja polaridad) . . . . . . . . . 54
5.2 Cromatografa fase normal.(Fase m ovil de polaridad media) . . . . . . . . . 55
5.3 Cromatografa en fase normal.(Fase m ovil de polaridad media) . . . . . . . 55
5.4 Cromatografa en fase inversa.(Fase m ovil de alta polaridad ) . . . . . . . . 55
7.1 Flujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
7.2 Perl del ujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
7.3 Direcci on del ujo electroosmotico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
vii
viii
7.4 Componentes basicos de un sistema de electroforesis capilar . . . . . . . . 72
7.5 Metodos de introducci on de muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.6 Dise nos de celda para mejorar la sensibilidad de detecci on por medida de
absorbancia aumentando el camino optico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Captulo 1
CROMATOGRAF
IA
Ciencia y arte de separar los componentes de una mezcla. Estos componentes son trans-
portados a traves de una fase estacionaria, por el ujo de una fase m ovil, donde la fase
m ovil puede ser un lquido o un gas.
Aunque esta es una denici on facilmente entendible en principio, puede presentar algunas
limitaciones, estas limitaciones se deben basicamente al desarrollo de la cromatografa de
udos supercrticos en la decada de los sesenta, donde la fase movil no es ni un gas ni un
lquido sino un udo surpercrtico. Por ello es mas conveniente relacionar la cromatografa
como un metodo separativo y aceptar m as bien la denici on dada por Guiddings que la
dene como un metodo de migracion en zonas; esto con el n de aceptar los cambios que
se puedan dar con el avance de las ciencias.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracion entre los distin-
tos componentes de la mezcla. La cromatografa, fue originalmente descrita por Tswett en
el 1906. Tswett ideo un metodo para separar pigmentos de plantas utilizando un tubo de
vidrio lleno con CaCO
3
,agrego un extracto de planta a la colmna no sin antes lavarla con
un solvente org anico y observo que se separaban diferentes bandas coloreadas en el interior
de la columna.A la separaci on de bandas coloreadas le di o el nombre de cromatografa,
de la palabra griega Chromatos que signica color.
En la gura 2.1 se muestra una solucion que contiene una mezcla la cual se coloca
sobre una columna empacada con partculas solidas y llenado con solvente. Vemos como
los solutos que conforman la mezcla uyen hacia abajo de la columna a medida que se
le agrega solvente fresco.De los distintos solutos que conforman la mezcla el primero que
eluye es el menos adsorbido por la fase estacionaria y el que eluye de ultimo es el mas
adsorbido por esta, completandose as la separaci on.
En general podemos decir que en la cromatografa no se incluyen separaciones que em-
plean campos electricos para impulsar las moleculas con cargas, de modo que se separen.
1
2 E.Lans
Este tipo de metodos se clasican como electroseparaciones.
1.1 Clasicaci on de los metodos cromatogracos
Los metodos cromatogracos son de dos tipos
1.1.1 Cromatografa en columna
La fase estacionaria esta contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase m ovil
a traves del tubo ya sea a presion o gravedad
1.1.2 Cromatografa plana
La fase estacionaria esta sostenida sobre una placa plana, o en los poros de un papel. Aqu
la fase m ovil se desplaza a traves de la fase estacionaria por capilaridad, o por efectos de
la gravedad.
1.2 Clasicaci on de los metodos cromatogracos en
columna
Los metodos cromatogracos se clasican seg un la fase m ovil, si esta es un gas se denomina
cromatografa de gas, si es un lquido toma el nombre de cromatografa lquida y si es un
udo supercrtico se le da el nombre de cromatografa de udos supercrticos.
1.2.1 Cromatografa de Gases
Gas-Lquido:La fase estacionaria es un lquido y la fase m ovil es un gas.
Gas-Solido: Donde la fase estacionaria es un solido y la fase m ovil es un gas.
1.2.2 Cromatografa lquida
Lquido-Lquido o de reparto:La fase estacionaria es un lquido.
Lquido - S olido:La fase estacionaria es un solido.
Intercambio i onico:La fase estacionaria es una resina de intercambio i onico.
Exclusi on por tama no:La fase estacionaria es un lquido en los intersticios de un solido
polimerico.
Anidad:La fase estacionaria es un lquido con grupos especcos unidos a una supercie
Conceptos generales 3
Figura 1.1: Cromatografa en columna
solida.
1.2.3 Cromatografa de udos supercrticos
Fase m ovil es un udo supercrtico.
Como se puede notar las diferentes clases de cromatografa se clasican de acuerdo a la
fase m ovil, como se dijo anteriormente.
1.3 Algunos terminos y ecuaciones utilizados en cro-
matografa
Para tener un entendimiento mas preciso, sobre los procesos cromatogracos, se hace
necesario que el lector tenga claro algunos conceptos utilizados en cromatografa. Res-
olucion de una columna:Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar los
analitos pesentes en una mezcla.
Retencion relativa o factor de selectividad: Es la retenci on de un compuesto con
respecto a otro, tambien la podemos denominar como velocidad de migracion diferencial.
=
t
,
r2
t
,
r1
(1.1)
4 E.Lans
Entre mas grande el tiempo de retenci on relativa, mas grande es la separaci on entre
componentes.La retenci on relativa es independiente de la velocidad de ujo por que puede
ser usado para identicar picos cuando la velocidad de ujo cambia.
=
K
B
K
A
(1.2)
La especie B es mas fuertemente retenida que la especie A, por tanto, siempre va a ser
mayor que la unidad.
=
(t
r
)
B
t
m
(t
r
)
A
t
m
(1.3)
=
K
B
K
A
=
K
B
K
A
(1.4)
Altura de plato H : Es una medida de la eciencia de una columna.
Fase estacionaria:Material solido en cuya supercie se enlazan las moleculas.
Eluyente:Disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a traves
de una fase estacionaria.
Eluato:Fase m ovil que sale de la columna.
Cromatograma:Es una gr aca de alguna se nal de la concentraci on de un soluto en
funcion del tiempo de elucion o el volumen de elucion.
Factor de capacidad(K
):Es un par ametro importante que con frecuencia se utiliza

para describir las velocidades de migracion de los analitos en las columnas.Para una especie
A:
K
=
K
A
V
S
V
M
(1.5)
K
A
= constante de distribucion de la especie A
V
S
= volumen de la fase estacionaria(analito)
V
M
= volumen del analito en la fase m ovil
De un cromatograma se puede calcular K
de la siguiente ecuacion, teniendo en cuenta

las ecuaciones 1.6 a 1.12 as:
L
t
r
=
L
t
m
1
1 +K
A
Reordenando tenemos:
K
A
=
t
r
t
m
t
m
(1.6)
Con esta ecuacion se puede calcular K
A
para un compuesto A desde un cromatograma.
Tiempo de retencion:Tiempo que transcurre despues de la inyecci on de la muestra para
que el pico del analito alcance el detector, el tiempo de retenci on para una especie Bviene
dada por la siguiente ecuacion:
(t
r
)
B
=
16R
2
s
H
1
)
2
(1 +K
B
)
3
(K
B
)
2
(1.7)
Tiempo muerto: Tiempo para que la especie no retenida alcance al detector; es decir la
velocidad de migracion de la especie no retenida coincide con la velocidad promedio del
movimiento de las moleculas de la fase m ovil.
Tiempo de retencion ajustado (t
r
): Es la diferencia entre el tiempo de retenci on del
analito y el tiempo muerto.
t
r
= t
r
t
m
(1.8)
t
r
=
(t
r
)
B
t
m
(t
r
)
A
t
m
(1.9)
1.4 Velocidades de separaci on
La efectividad de una columna cromatograca para separar dos analitos depende en parte
de las velocidades relativas con la que eluyen las dos especies. Estas velocidades estan
determinadas por la magnitud de las constantes de los equilibrios de distribuci on de las
especies entre las fases estacionaria y m ovil.
K =
C
s
C
m
(1.10)
K = Constante de distribucion, raz on de distribucion o coeciente de distribuci on. C
s
=
Concentracion molar del analito en la fase estacionaria.
C
m
= Concentracion molar del analito en la fase m ovil.
Idealmente K debe ser constante en un amplio intervalo de concentraciones,o sea que
C
s
C
m
V =
L
t
r
(1.11)
donde

V = velocidad lineal media de migracion del analito
L = Longitud de la columna
=
L
t
m
(1.12)
6 E.Lans
= velocidad lineal media del movimiento de las moleculas de la fase m ovil
Entre m as rapido es la velocidad lineal media de migracion del analito ( ujo lineal),
menos tiempo gasta en la columna y menos ensanchamiento de banda ocure debido a
lo difusion longitudinal.Las velocidades lineales de ujo en cromatografa de lquidos son
signicativamente menores que las que se utilizan en cromatografa de gas.
Cuando el factor de capacidad K
de una especie dada es menor que la unidad, es

por que la elucion es tan rapida que es difcil determinar con exactitud los tiempos de
retenci on. Cuando el K
es del orden de 20 a 30 o mayores,es porque los tiempos de re-

tencion son demasiado largos; idealmente las separaciones se realizan en unas condiciones
en las que los factores de capacidad oscilan entre 1-5. El factor de capacidad K
,
para
cada uno de los picos en un cromatograma esta denido como:
K
=
t
r
t
m
t
m
(1.13)
Para vericar la eciencia de una columna es bueno monitorear perodicamente mediendo
el factor de capacidad de un estandar, el n umero de platos y la asimetra de los picos.
Cambios de estos factores reejan degradaci on de la columna.
V =
moles de analito en la fase m ovil
moles totales de analito
(1.14)
V =
1
1 +K
A
V
S
V
M
(1.15)
1.5 Tiempo de retencion Vs coeciente de particion
La denici on del factor de capacidad es equivalente a decir:
K
,
=
tsgfe
tsgfm
(1.16)
Donde tsgfe, tsgfm = tiempo del soluto gastado en la fase estacionaria y tiempo soluto
gastado en fase m ovil respectivamente.
Si tenemos en cuenta la ecuacion(1.13), podemos armar que:
Si el soluto gasta todo el tiempo en la fase m ovil, entonces el factor de capacidad K
,
= 0
por que el tiempo de retenci on sera igual a t
m
.
Si el soluto gasta igual tiempo en la fase m ovil y la fase estacionaria, entonces el t
r
= 2t
m
,
por lo queK
,
= 1
Si el soluto gasta tres veces igual tres veces m as tiempo en la fase estacionaria que en la
fase m ovil, entonces el t
r
= 4t
m
, as,K
,
= 3
De lo anterior podemos deducir que habra tres veces m as moles de soluto en la fase esta-
cionaria.
K
,
=
C
s
V
s
C
m
V
m
(1.17)
Donde C
s
es la concentracion de soluto en la fase estacionaria, V
s
volumen de la fase
estacionaria, C
m
, concentracion de soluto en la fase m ovil y V
m
volumen en la fase m ovil.
como K
,
=
C
s
V
s
C
m
V
m
y K =
C
s
C
m
entonces,
K
,
= K
V s
V m
(1.18)
como K
,
=
t
r
t
m
t
m
=
t
,
r
t
m
K
,
= K
V s
V m
=
t
,
r
t
m
(1.19)
K
,
=
t
,
r
t
m
(1.20)
1.6 Relacion entre el tiempo de retencion y la con-
stantes de distribucion
V = fraccion de tiempo que el analito reside en la fase m ovil
V =
C
m
V
m
C
m
V
m
+C
s
V
s
=
1
1 +
C
s
V
s
C
m
V
m
(1.21)
V =
1
1 +
KV
s
V
m
(1.22)
8 E.Lans
Como K
A
=
K
A
V
s
V
m
entonces:
V =
1
1 +K
A
(1.23)
1.7 Asimetra
La asimetra de un pico puede tener distintas causas: Aplicacion de un exceso de analito,
error en la tecnica de inyecci on o columna degradada.
Picos no simetricos generalmente indican que interacciones no deseadas han ocurrido du-
rante el proceso cromatograco.
Picos anchos son comunes en columnas empacadas,indicando que la cinetica de la trans-
ferencia de masas es demasiado lenta.
En algunas aplicaciones con columnas empacadas poco se puede hacer al respecto, sin
embargo, el objetivo del cromatograsta es lograr unos picos estrechos tanto como sea
posible, para lograr mejores separaciones.
La simetra de los picos se puede clasicar como Tailing o Fronting dependiendo de la
localizacion de la asimetra. El alcance de la asimetra es denido como Tailing Factor
(TF).
TF =
b
a
(1.24)
Tanto a como b son medidos sobre el 10% de la altura del pico. Figura 1.2 en la pagina
9. De acuerdo a la ecuacion (1.3) un pico con tailing tendra un TF mayor que la unidad,
y un pico con fronting su TF es menor que la unidad. Todos los picos que necesiten ser
medidos deben ser simetricos con un TF en el rango de 0,9 a 1,5.
1.8 Tipos de fuerzas que estan presentes en un sis-
tema cromatograco
En un sistema cromatograco existen varios tipos de interacciones a saber:
1. Interacciones i onicas
2. Fuerzas de enlace de hidrogeno
3. Fuerzas de repulsi on
4. Fuerzas de Van Der Walls
Figura 1.2: Asimetra de un pico cromatograco
1.8.1 Interacciones i onicas
Ocurren entre el soluto y una fase o ambas, cuando tienen cargas permanentes. Este tipo
de interacciones me da la cromatografa i onica, que resulta de la interacci on entre los i ones
de soluto y los iones de la fase estacionaria.
1.8.2 Fuerzas de enalce de hidr ogeno
Ocurren entre molelculas que tienen el hidrogeno unido a un peque no atomo bastante
electronegativo como los alcoholes, aminas y agua los cuales pueden ser donores o acep-
tores de protones. Los esteres, aldehdos, cetonas y eteres solo pueden ser aceptores de
protones y forman enlace de hidrogeno con compuestos donores de protones
1.8.3 Fuerzas de repulsion
Las fuerzas de repulsi on se dan entre cargas iguales, la energa de orientaci on aumenta
con forme aumenta el momento dipolar.
1.8.4 Fuerzas de Van Der Walls
Las fuerza de Van Der Walls son de tres tipos:
1. Orientaci on (dipolo-dipolo) o de Keesom. Se dan entre moleculas con dipolo per-
manente.
2. Induccion (dipolo inducido-dipolo) o Debye
10 E.Lans
3. Dispersi on (dipolo inducido-dipolo inducido)o London
Las fuerzas de London son debiles y se dan entre moleculas simetricas ej: SO
3
,SO
2
,O
2
,N
2
,Br
2
etc. ocurren entre una fase y el soluto donde ambas son neutros o polarizables.
1.9 Bases fsicas de la cromatografa
Entre m as grande la razon de los coecientes de partici on mas grande es la separaci on
entre los componentes de una mezcla.
Las ecuaciones(1.18) y (1.2) relacionan el tiempo de retenci on, coeciente de partici on y
el volumen de las fases estacionaria y m ovil.
Debido a que t
,
r
K
,
K la retenci on relativa() puede ser expresada como:
=
t
,
r2
t
,
r1
=
K
,
r2
K
,
r1
=
K
2
K
1
1.9.1 Eciencia
Existen dos factores que contribuyen a la eciencia de una separaci on:
1-La diferencia del tiempo de elucion entre picos, entre mas grande es esta diferencia
mejor la separaci on.
2-El ancho de los picos. Entre mas ancho sean los picos mas pobre es la separaci on.
La eciencia de una columna se mide por la altura de plato H. El nombre proviene de
la teora de la destilaci on, en la cual la separaci on puede ser llevada a cabo en escalones
discretos llamados Altura equivalente o un plato teorico.
El ensanchamiento de banda (ancho de los picos)tambien se produce como consecuencia
de la velocidad nita con la que ocurren los distintos procesos de transferencia de masa
durante la migracion de una especie a lo largo de la columna.
La desviaci on estandar de una banda =
2Dt.
Donde D = coeciente de difusion
t = tiempo
Si un soluto viaja a una distancia x a una velocidad de ujo lineal
m
s
=
x
el tiempo que
gasta este al viajar por una columna sera: t =
x
x
, por lo tanto:
2
= 2D
x
x
=
2D
x
x, si
2D
x
= H
2
= Hx
H =
2
x
(1.25)
Donde H es la altura de plato,
es la desviaci on estandar de la curva gausiana
y x es la distancia que viaja a traves de la columna.
De las ecuaciones anteriores podemos concluir que la altura de plato es la constante
de proporcionalidad entre la varianza
2
de la banda y la distancia (x)que ha viajado.
Fsicamente NO EXISTEN estos platos en cromatografa, de tal manera que uno debe
considerar la altura de plato como un termino que relaciona el acho de una banda con la
distancia recorrida en una columna. La altura de plato H es proporcional a la varianza
de una banda cromatograca.Cuanto mas peque no es la altura de plato mas estrecho es
el ancho de una banda.
La capacidad que tiene una columna para separar una mezcla de componentes es mejo-
rada por la disminucion en la altura de plato.
Diferentes solutos que pasan a traves de una misma columna, tienen diferentes alturas
de plato, por que ellos tienen diferentes coecientes de difusion.
Las alturas de platos en cromatografa de gas son aproximadamente de 0,1 a 1mm, en
HPLC 10m y < 1m en electroforesis capilar.
1.9.2 Numero de plato teorico
El n umero de plato te orico de una columna con longitud L es:
N =
L
H
=
L
2
x
=
LX
2
, si hacemosx = L
LX
2
=
L
2
2
De la gura 1.3 pagina 13 =
W
4
as que N =
L
2
W
2
16
= 16
L
2
W
2
Si expresamos L y W en unidades de tiempo, en vez de longitud,Nsera adimensional;
as obtenemos la expresion mas util para N
N =
16t
2
r
W
2
(1.26)
12 E.Lans
Si usamos la achura de la altura media en vez de la base, entonces:
N = 5.5
t
2
r
w
2
1/2
(1.27)
La ecuacion anterior se deduce teniendo en cuenta la gura 1.3 y usando la anchura de la
altura media, en vez de la anchura de la base.
1.9.3 Resolucion
La resolucion de una columna es el grado de separaci on que realiza una esta de los com-
ponentes de una mezcla.Figura 1.4
El movimiento del soluto a traves de la columna cromatograca, se propaga en forma
gausiana con una desviaci on estandar de .
Entre mas tiempo gasta un soluto pasando a traves de la columna, mas ancha es la banda.
Medidas comunes al ensanchamiento de la banda son la anchura media del pico W
1/2
, me-
dida a la mitad de la altura del pico y la anchura de la lnea base W. Figura 1.3
La resolucion esta dada por, R
s
=
t
r
W
av
=
V
r
W
av
t
r
y V
r
son las diferencias de tiempo de retenci on y volumen respectivamente entre
picos y W
av
es el promedio de la anchura base de ambos picos en sus unidades correspon-
dientes.
Para analisis cuantitativo una resolucion >de 1.5 es altamente deseada.
Factores que afectan la resoluci on
La resolucion de una columna se ve afectada por el n umero de plato te orico N, la retenci on
relativa y el factor de capacidad K
,
como se observa en la siguiente ecuacion:
R
s
=
N
4
(
1
)(
K
,
2
1 +K
,
av
) (1.28)
Donde N es el n umero de platos te oricos en la columna, es la retenci on relativa de
los dos picos K
,
2
es el factor de capacidad para el componente m as retenido y K
,
av
es el
promedio de los factores de capacidad para ambos picos. De la ecuacion anterior se deduce
que la resolucion es proporcional a
N, de tal modo que si doblamos la longitud de la

columna, se incrementa la resolucion en
2. Igualmente podemos decir que la resolucion

Figura 1.3: Curva gausiana ideal muestra como w y w
1/2
son medidos. El valor de w es obtenido
extrapolando las tangentes en el punto de inecci on de la linea base
Figura 1.4: Resolucion de un cromatograma
14 E.Lans
se incrementa cuando aumenta y el factor de capacidad K
,
2
.
La manera de cambiar la retenci on relativa es cambiando en cromatografa de gas la fase
estacionaria y en HPLC cambiando la fase estacionaria o fase m ovil.
1.9.4 Difusi on
Una causa del ensanchamiento de la banda es la difusion. Una banda del soluto se ensan-
cha a medida que se va moviendo a traves de la columna.Figura1.5
El coeciente de difusion mide la velocidad a la cual una substancia se mueve aleatoria-
mente de una regi on de alta concentracion a otra regi on de baja concentraci on.
El n umero de moles que cruzan en un metro cuadrado por segundo, se llama ujo y es
proporcional al gradiente de concentracion.
F =
mol
m
2
S
J (1.29)
J = D
dc
dx
(1.30)
De donde D es el coeciente de difusion, y el signo negativo se debe a que el ujo neto va
de una regi on de alta concentracion a otra de baja concentraci on
dc
dx
son la variacion de
la concentracion molar con respecto a la distancia recorrida
1.9.5 Ecuacion de Van Deemter
La ecuacion de Van Deemter nos dice como la columna y la velocidad de ujo afecta
la altura de plato.La ecacia de las columnas cromatogracas pueden evaluarse por la
Figura 1.5: Ensanchamiento de banda debido a la difusi on
ecuacion 1.31
H A+
B
x
+Cu
x
(1.31)
H= altura de plato en cm A= termino de los m ultiples pasos, factor de tortuicidad, o
difusion de Eddy. Cu
x
= termino de transferencia de masas, es decir tiempo nito re-
querido para que el soluto alcance el equilibrio entre la fase m ovil y la fase estacionaria.
x
= velocidad lineal de la fase m ovil
cm
s
.
B = difusion longitudinal.
La altura de plato debido al termino de transferencia de masa es:
H =
K
d
2
x
(K
+ 1)
2
D
C
ux
(1.32)
K
= factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coeciente de difusi on

del soluto en la fase estacionaria
La altura de plato es reducida con el termino de transferencia de masa disminuyendo el
espesor de la fase estacionaria y aumentando la temperatura ya que as se aumenta el coe-
ciente de difusion del soluto en la fase estacionaria. Las alturas de plato en cromatografa
lquida son un orden de magnitud menores que las correspondientes en cromatografa de
gas; sin embargo en cromatografa lquida el largo de las columnas no son mayores de 25
a 50 cm, ya que no se pueden mantener la alta presion a longitudes mas grandes; cosa
que no ocurre en cromatografa de gas. As vemos que esta contraresta a la H peque na
en cromatografa lquida dado que en cromatogrfa de gas las columnas pueden alcanzar
hasta 50 m de longitud, la altura de plato(H) y por ende la ecacia de la columna son
mayores con frecuencia en cromatografa de gas.
La expresion 1.31 es llamada ecuacion de Van Deemter la cual se usa para tratar de
explicar las complejas interacciones fsicas y los efectos que conducen al ensanchamiento
de banda.
Si cambiamos la columna y la fase estacionaria cambian tambien los valores de A, B
y C. Seg un la ecuacion de Van Deemter hay mecanismos de ensanchamiento de la banda
que son proporcional, e inversamente proporcional e independiente a la velocidad de ujo.
Figura 1.6
En las columnas empacadas todos los tres terminos contribuyen al ensanchamiento de
banda. Para las columnas open tubular el termino A es 0, de modo que el ancho de banda
disminuye, aumentanto por tanto la resolucion.
Cuando la altura de plato es mas peque na, m as estrecha es la banda; as que la ecuacion
de Van Deemter nos dice como afecta la velocidad de ujo y la columna la altura de plato.
16 E.Lans
Figura 1.6: Aplicacion de la ecuaci on de Van Deemter en cromatografa de gas
(Harris 1999)
En electroforesis capilar tanto el termino A como el C son 0 disminuyendo la altura
de plato a valores considerablemente bajos hasta niveles de micrometros produciendo un
poder extraordinario de separaci on.
Una graca de C
s
versus C
m
(a una temperatura dada) es llamada isoterma. Figura
1.7. En cromatografa se pueden presentar a menudo cromatogramas con picos no muy
bien denidos, presentandose picos con cola, como se puede ver en la parte inferior de
la gura1.7 En la gura 1.7 la isoterma de la izquierda ocurre cuando ha sido agregado
demasiado soluto a la columna, sobrecargandola. Cuando la concentraci on del soluto se
incrementa es porque el soluto es mas soluble en la fase estacionaria ; hay tanto soluto en
la fase estacionaria que esta tiende a parecerse al soluto.(semejante disuelve semejante).
Una cola surge cuando algunos sitios retienen soluto mas fuertemente que otros.
La isoterma de abajo de la gura 1.7 ocurre cuando peque nas cantidades de soluto son
retenidas mas fuertemente que cantidades grandes.
Como se dijo anteriormente, sitios que retienen solutos fuertemente causan cola ; as
los grupos hidroxilos que forman enlaces de hidrogenos con solutos polares producen colas
muy marcadas. La silanizacion reducen las colas porque bloquean a los grupos hidroxilos
con otros grupos no polares, como el trimetilsilil. Figura 1.8
Figura 1.7: Isotermas comunes y formas de las bandas
(Harris 1999)
Figura 1.8: Silanizaci on
18 E.Lans
Las columnas de vidrio o de slice usadas en cromatografa de gas o lquida tambien
se pueden silanizar para minimizar la interacci on del soluto con los puntos activos de la
columna.
1.10 Ejercicios
1. Considere un experimento cromatograco en la cual dos componentes con factores
de capacidad de 4,0 y 5,0 respectivamente, son inyectados en una columna con 1x10
3
platos teoricos. El tiempo de retenci on para el compuesto menos retenido es t
r1
=
10,0 min.
a)Calcular el t
m
y t
r2
b) Encontrar W
1/2
y W
c)Calcular la resolucion de los dos picos.
Rta.
a)t
m
= 2 min.; t
r2
= 12 min.
b)w
2
= 1, 52 min. ;W
1
= 1, 26;w
1/2
pico 1 = 0, 74;w
1/2
pico 2 = 0,89
c) Resolucion = 1,44
2. La retenci on relativa de dos compuestos en cromatografa de gas es 1,068 en una
columna con una altura de pico de 0,520 mm. El factor de capacidad para el com-
puesto 1 es 5,16.
a)Cual sera la longitud de la columna requerida para separar los compuestos con
una resolucion de 1?
b) El tiempo de retenci on para el aire en la columna(a) es de 2.0 min.. Si el n umero
de platos es el mismo para ambos compuestos. Encontrar los tiempos de retenci on
y la anchura de cada uno de los picos.
c) Si la razon fase estacionaria fase m ovil es 0,30, encontrar el coeciente de par-
ticion para el componente 1.
Rta.
a) L = 2,71 m
b) t
r1
= 12, 32 min. ; t
r2
= 13, 02 min. ; W
1
= 0, 68 min. ; W
2
= 0, 72 min.
c) K = 17
3. Las areas obtenidos de picos por cromatografa de gases para una mezcla de ac-
etato de metilo, propionato de metilo y n-butirato de metilo fueron 17,6 ; 44,7 y
31,1 respectivamente. Calcular el porcentaje de cada compuesto si las respectivas
respuestas de detecci on relativa fueron 0,65; 0,83; y 0,92.
Captulo 2
CROMATOGRAFIA EN CAPA
FINA
La cromatografa en capa na se basa en la preparacion de una capa uniforme, de un
adsorbente, mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
para la cromatografa en capa na son, pues : un adsorbente, placas de vidrio, un disposi-
tivo que mantenga las placas durante la extension, otro para aplicar la placa de adsorbente
y una placa en la que se desarrollan las placas cubiertas.La fase m ovil es lquida y la fase
estacionaria un solido.
La fase estacionaria sera un componente polar y el eluyente ser a por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de modo que los solventes que se desplacen con mayor
velocidad seran menos polares. Figura2.1
2.1 Ventajas de la cromatografa en capa na
1. La instrumentaci on utilizada es mas simple.
2. El tiempo para conseguir las separaciones es mucho menor.
3. El metodo es simple y los resultados son reproducibles, lo que la hace un metodo
adecuado para nes analticos.
2.2 Adsorbentes
Al elegir un adsorbente se debe tener en cuenta el tama no de las partculas. Cuanto m as
namente dividido este, mayor sera su adhesion al soporte.
20
Cromatografa en capa na 21
Figura 2.1: Placa cromatograca
2.2.1 Proceso de adsorci on
La muestra aplicada en la capa, es adsorbida en la supercie del material por la acci on
de fuerzas electrost aticas (fuerzas de van der waals). Luego cuando la placa es expuesta
a un ujo por acci on capilar, se inicia una competencia de enlaces entre sitios activos del
adsorbente y la sustancia con el solvente.
2.2.2 Adsorbentes utilizados
Los adsorbentes m as utilizados son la celulosa, el almidon, los azucares, slica gel entre
otros, oxido de aluminio (al umina) entre otros.
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y
animales.
2.3 Preparacion de placas
Para la preparacion de las placas se sigue el siguiente procedimiento:
Mezclar en un erlenmeyer el agua y el adsorbente
Agitar fuertemente
Extender la muestra sobre el soporte de vidrio
Hacer oscilar la mezcla de un lado para otro
22 E.Lans
El espesor de la placa suele ser de 0.1 a 0,2 mm para separaciones analticas. La placa
debe quedar libre de grumos y rugosidades que afectaran el desarrollo del proceso cro-
matograco. Las placas se dejan en reposo un corto tiempo despues de cubrirlas; luego
se colocan en bandejas metalicas.En este momento se puede activar el adsorbente, bien
dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, o calentandola durante
30-60 minutos a 105-110 grados Celsius, para as expulsar el aire.
2.4 Aplicacion de las muestras
Los productos a examinar se disolver an, cuando sea posible en un disolvente org anico no
polar que tenga un punto de ebullici on lo sucientemente bajo para que se evapore despues
de su aplicacion. Para sembrar la muestra se utilizan micropipetas o un tubo capilar. El
proceso de siembra se hace tocando con la punta del capilar la placa preparada dejando
una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacion
de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la
placa solo quedara la muestra a analizar.
2.5 Eleccion del eluyente
La elecci on del eluyente depender a l ogicamente del componente que se va a separar y del
material en que la separaci on se llevar a a cabo.
Entre los principales eluyentes en orden creciente de polaridad tenemos:enemos:Eter de
petroleo,eter dietilico,ciclohexano,acetato de etilo,tetracloruro de carbono,piridina, ben-
ceno, etanol,cloroformo,metanol,diclorometano,agua y Acido acetico.
Entre los factores para la elecci on del eluyente se encuentran: Precio,pureza, no utilizar
mezclas de eluyente,no utilizar compuestos muy vol atiles, evitar que contengan trazas de
metales (catalizadores)
La elecci on del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez mas polares hasta dar con el m as apropiado.
Otra tecnica para realizar consiste en sembrar varias muestras distanciadas suciente-
mente y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra.
Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de tal forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separaci on se realiza de una manera ecaz.Figura 2.2
Figura 2.2: Siembra de la muestra en una placa cromatograca
2.6 Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa na se realiza normalmente por el metodo
ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi vertical, por
la acci on de la capilaridad.
Generalmente el eluyente se introduce en una camara una hora antes del desarrollo
para permitir la saturaci on de la atmosfera. El tiempo de desarrollo, por lo general no
llega a los 30 minutos.Figura 2.3 Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo pre-
jado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia ja desde el origen. Esto
se hace para estandarizar los valores de Rf.Frecuentemente esta distancia es de 10 cms.
La mejor posicion de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen
y el frente del eluyente ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor
o menor velocidad.
2.7 Evaluacion de un cromatograma de capa na
Para llevar a cabo una evaluacion de un cromatograma en capa na se puede realizar por
analisis cualitativo y analisis cuantitativo.
24 E.Lans
Figura 2.3: Placa cromatograca
2.7.1 Analisis cualitativo
Medida de Rf
Comparacion visual de color/intensidad.
2.7.2 Analisis cuantitativo
Comparacion visual del di ametro y la intensidad del color de la mancha contra una serie
de manchas patrones de concentracion conocida.
2.8 Localizaci on de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicion de dichos
compuestos. Para ello existen dos metodos:Metodos qumicos y Metodos fsicos.
2.8.1 Metodos qumicos
Consisten en realizar una reaccion qumica entre un reactivo revelador y los componentes
separados. Para ello se atomiza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de
atomizador. Si el reactivo atomizador es muy corrosivo o peligroso, la atomizaci on deber a
hacerse en una vitrina de gases.Como reactivo revelador generalmente se utiliza yodo,
el cual forma complejos coloreados con los componentes org anicos (con tonos amarillo-
marr on) pero las manchas desaparecen con el tiempo por lo que es conveniente se nalar
las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el acido sulf urico, que reacciona con los
componentes org anicos produciendo manchas negras. El tama no de las manchas no esta
relacionado con la cantidad de componente separado.
2.8.2 Metodos fsicos
El m as com un consiste en a nadir al adsorbente un indicador uorescente. De tal manera
que al colocar la placa bajo una l ampara ultravioleta, y dependiendo del indicador y la
longitud de onda aparecen manchas uorescentes en las zonas en las que hay componentes.
Los compuestos que poseen uorescencia se pueden detectar directamente bajo la luz
ultravioleta.
2.9 Constante Rf
La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar la posicion de un
compuesto sobre una placa como una fraccion decimal, mide la retenci on de un compo-
nente. Se dene como:
Rf= distancia recorrida desde el origen por el compuesto/distancia recorrida desde el
origen por el compuesto de referencia
Rf =
X
f
(2.1)
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la
mancha. Para que los Rf sean reproducibles se deben jar una serie de condiciones tales
como espesor de la pelcula, fase estacionaria, fase m ovil y cantidad de muestra.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa
y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf, y si son
distintos puede decirse con toda seguridad que no se trata del mismo compuesto.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa
con el mismo eluyente, u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separaci on mnima.
Captulo 3
CROMATOGRAFIA DE GAS
En cromatografa de gas el analito es transportado a traves de la columna por una fase
m ovil gaseosa llamda Carrier gas
3.1 Cromatograf gas lquido
Llamada tambien de partici on, la fase estacionaria es un lquido no vol atil que cubre la
parte interna de la columna, o esta sobre un soporte solido.
3.2 Fase movil
En cromatografa de gas la fase movil es un gas generalmente He, N
2
, o H
2
y la fase
estacionaria es generalmente un liquido no vol atil y algunas veces un solido. El analito
debe estar en forma gaseosa o como un lquido vol atil
La columna debe estar lo sucientemente caliente para proveer presi on de vapor del
analito y pueda ser eluato en un tiempo razonable. El detector es mantenido a una
temperatura mas alta que la columna as que todos los analitos seran gaseosos.
Existen dos clases de columnas en cromatogrfa de gas, las tubulares abiertas lla-
madas tambien open tubular column y las empacadas.
3.3 Columnas tubulares abiertas
La mayora de los analisis usan open tubular column, largas y estrechas hechas de slica
fundida (SiO
2
) y revestida con poliamida (un pl astico capaz de resistir hasta 350
o
C) para
26
Cromatografa de gas 27
Figura 3.1: Diagrama esquem atico de un cromat ografo de gas
soporte y proteccion de la humedad atmosferica. El diametro interno de las columnas esta
entre 0.100.53 mm y la longitud de 15100 m.
3.3.1 WCOT :wall coated tubular column
Caractersticas:El espesor de la pelcula de la fase estacionaria en el interior de la
columna esta entre 0.15m. Disminuyendo el espesor de la pelcula de la fase esta-
cionaria aumenta la resolucion, disminuye el tiempo de retenci on y disminuye la cantidad
de muestra. La fase estacionaria esta adherida a las paredes internas de la columna.
3.3.2 SCOT: support coated open tubular column.
Caractersticas:Partculas solidas con la fase estacionaria liquida estan adheridas a las
paredes internas de la columna.
3.3.3 PLOT: porous layer open tubular column
Caractersticas:La fase estacionaria solida esta unida a las paredes internas de la columna.
Para aumentar el area de contacto se tratan las paredes de la columna con HF, luego se
deposita alla la fase estacionaria. La eciencia de las SCOT es intermedia entre las WCOT
y las columnas empacadas.
3.4 Ventajas de las open tubular column
comparadas con las columnas empacadas las open tubular ofrecen:alta resolucion,tiempo
de analisis mas cortos,gran sensibilidad y mas baja capacidad de muestra.
Las narrow open tubular column ofrecen mas alta resolucion que las wider open tubular
pero requieren mas alta presion para operar y tienen menos capacidad de muestra.
28 E.Lans
3.5 Clases de fase estacionaria
(Diphenyl)x(dimethyl)1-x polysiloxane.
(Cyanopropylphenyl)0.14(dimethyl)0.86 polysiloxane:Polaridad intermedia.
Carbowax (poly(ethyleneglycol)) :Fuertemente polar.
(biscyanopropyl)0.9((cyanopropylphenyl)0.1 polysiloxane: Fuerte polaridad.
3.6 Escogencia de la fase estacionaria
La escogencia de una fase estacionaria dada para un problema dado se basa en la regla:
semejante disuleve semejante. Columnas no polares son mejores para solutos no polares
las de polaridad intermedia son mejores para solutos de polaridad intermedia.
Advertencia:Las altas temperaturas y la exposicion al oxigeno causan degradaci on de
la columna y producen cola en los cromatogramas.
Entre solidos usados para columnas PLOT tenemos al umina Al
2
O
3
la cual es una fase
estacionaria que separa hidrocarburos en cromatografa de adsorcion gas solido.
Para evitar da nos a las columnas por impurezas de los gases, estos pueden ser seca-
dos utilizando trampas que contienen Mallas Moleculares ya que el agua es fuertemente
retenida por estas. Las mayas moleculares son material inorg anico o polmeros org anicos
con grandes cavidades dentro de las cuales peque nas moleculas entran y son parcialmente
retenidas. Moleculas, tales como H
2
, O
2
, CO
2
, CH
4
pueden ser separadas una de otras.
Las mallas inorg anicas pueden ser regeneradas calentando a 300
o
C al vacio o bajo ujo
de N
2
.
3.7 Columnas empacadas
Contienen un soporte solido no con un lquido no vol atil como fase estacionaria o solo
el soporte solido puede actuar como fase estacionaria. Las columnas son generalmente
hechas de acero inoxidable, nkel o vidrio. El di ametro interno es de 3 - 6 mm y la longitud
es de 5 y 20 cm, el soporte solido a menudo es de diatomea que es silanizado..
En las columnas empacadas el tama no uniforme de las partculas disminuye el ter-
mino m ultiples caminos (A) en la ecuacion de VAN DEEMTER reduciendo as la altura
de plato y aumentando por ende la resolucion.
El peque no tama no de las partculas disminuye el tiempo requerido para que el soluto
alcance el equilibrio mejorando la eciencia de la columna, sin embargo entre mas peque no
es el tama no de las partculas se requiere mas presion para que la fase m ovil pase a traves
de la columna.
El tama no de las partculas se expresa en micrometros o tama nos MESH esto se reere
al tama no del tamiz a traves del cual las partculas son pasadas o retenidas. Una partcula
de 100/200 mesh pasa a traves de un tamiz de 100 mesh pero no a traves de uno de 200.
Es decir el mesh da la apertura por pulgada lineal del tamiz.
3.8 Indice de retencion
Los ndices de retenci on de Kovats (I) para alcanos es igual a 100 veces el n umero de
atomos de carbono. Para el octano el (I) es de 800 para el nonano es de 900.
3.9 Programaci on de temperatura y presion
En la programaci on de la temperatura, la temperatura de la columna es subida durante
la separaci on para incrementar la presion de vapor de soluto y disminuir el tiempo de
retenci on de los compuestos eludos.
A temperatura constante en una mezcla los compuestos m as vol atiles pueden emerger
juntos y los menos vol atiles pueden a un no ser eludos de la columna.
Si la temperatura es incrementada de 50 a 250
o
C a una velocidad de 8
o
C/min, todos
los compuestos son eludos y la separaci on de los picos son uniformes. Hay que evitar
subir la temperatura demasiado para prevenir descomposicion termica del analito o la
fase estacionaria.
La programaci on de la presion es util a analitos l abiles que no puedan tolerar altas
temperaturas.
3.10 Carrier gas
La eciencia de la columna y el detector depende de la identidad del gas soporte.
El He, N
2
yH
2
dan alturas de plato optimos a una velocidad de ujo diferente. (ver
curva de van deemter)
Entre m as rapidamente un soluto se difunde entre las fases, mas peque nos es la trans-
ferencia de masa, termino Cu en la ecuacion de van deempter.
Para la eciencia de la columna y la velocidad de analisis el H
2
es un buen gas so-
porte. El H
2
puede reaccionar catalticamente con compuestos insaturados sobre super-
cies met alicas.
Las impurezas en el carrier gas degradan la fase estacionaria.
30 E.Lans
Se deben usar gases de alta calidad y a a un as estos deben pasarse a traves de ltros
para remover el oxigeno , agua y trazas de compuestos org anicos antes de que estos entren
a la columna.
3.11 Inyeccion de la muestra
Los lquidos son inyectados con una jeringa a traves de un serpentn de caucho pasando
por el glass liner silanizado. El gas soporte barre la muestra vaporizada desde el puerto
de inyecci on hacia la columna cromatograca. El volumen de inyecci on es tpicamente 0,1
- 2 L de muestra.
La muestra descompuesta y componentes no vol atiles lentamente se acumulan en el
glass linner el cual debe ser reemplazado periodicamente.
3.11.1 Inyecion split
Medio de introducir peque nos vol umenes de muestra en columnas open tubular. Este
modo se utiliza si el analito de interes constituye mas del 0.1% de la muestra . Para
trabajos de alta resolucion, los mejores resultados son obtenidos con este modo de intro-
ducci on de la muestra, preferiblemente conteniendo menor o igual a 1.0 ng de cada uno
de los componentes.
Una inyecci on split libera solamente 0,2 -2% de la muestra en la columna.
3.11.2 Inyeccion splitless
Modo de inyecci on preferido para analisis a nivel de trazas, el analito constituye menos
del 0,01% en la muestra.
La temperatura de inyecci on para el modo splitless es mas bajo que para el modo
split, aprox 220
o
C por que la muestra gasta mucho mas tiempo en el puerto de inyecci on
y no queremos que ocurra descomposicion terrmica. El tiempo de residencia en el glass
liner es aprox de 1 min por que el gas soporte uye a traves del liner a la columna con
una velocidad de ujo aprox 1 mil/min. En este modo el 80% de la muestra entra a la
columna. Es mejor a niveles de trazas para solutos de alta ebullici on en solventes de baja
ebullici on. Figura 3.3
3.11.3 Inyeccion on column
Se usa para solutos termicamente inestables, y solventes con alto punto de ebullici on. Es
mejor para analisis cuantitativos que la inyecion split/ splitless. La solucion es inyectada
Figura 3.2: Inyeccion split/splitless
directamente en la columna. En este procedimiento la muestra es sometida a la mas baja
temperatura posible para evitar la perdida de soluto.
3.12 Detectores
Un detector no identica que esta eluyendo de la columna, sino que algo esta emergiendo.
3.12.1 Claseses de detectores
Detector de ionizacion por llama (FID)
Es un detector universal ya que responde a todos los compuestos org anicos, entre sus car-
actersticas se encuentran:Sensibilidad, estabilidad,excelente rango lineal,facil operaci on,
mantenimiento y amplia aplicabilidad.Todos estos detalles lo hacen el m as popular de los
detectores en cromatografa de gas. (McNair & Miller 1998)
Figura 3.3: Detector de ionizaci on por llama
32 E.Lans
Principios:Se aplica un voltaje a la boquilla de la llama y al colector. El carrier gas
que sale de la columna es mezclado con hidrogeno y quemado en la punta de la boquilla,
luego se aplica oxigeno como una mezcla de aire en la camara de combusti on para ase-
gurar la eciencia de la ionizacion del euente de la columna. Esta combusti on genera
iones. El movimiento de estos iones desde la llama al colector cargado positivamente pro-
duce una peque na corriente, estando presente siempre una se nal de fondo. Al introducir
un compuesto org anico en la llama produce unos iones que incrementa la corriente de
base. FIGURA Esta se nal es procesada por el registrador en un correspondiente pico
cromatograco.
Detector captura de electrones (ECD)
Es un detector de ionizacion que es especco para compuestos que capturan electrones.Es
usado para analisis de compuestos halogenados debido a la sensibilidad extrema para estos
compuestos.
Principios:Una fuente de electrones de una fuente radiactiva Ni
63
es usado para bom-
bardear el euente de la columna pasando a traves del detector. El make up gas es ionizado
por los electrones libres de la fuente, produciendose un plasma que contiene entre otras
especies electrones termicos. Se aplica una diferencia de potencial a la celda del detector,
el cual permite la captura de iones cargados negativamente y de electrones.Esto crea una
corriente que es la base para todas las medidas. Cuando llegan los compuestos anes
a los electrones estos son capturados produciendose una diferencia de corriente que es
registrada y transformada en una se nal. La cantidad de corriente reducida es una funcion
de la cantidad de compuesto presente y su capacidad de capturar electrones.FIGURA
Detector de conductividad termica (TCD)
Es sensible a todos los compuestos, pero la sensibilidad y la naturaleza casi universal del
FID ha hecho la utilidad del TCD util solamente en areas de aplicacion limitada. Prin-
cipios: Consiste en dos celdas cada una con un lamento calentado cuya resistencia
al ujo de corriente es mantenida electrnicamente. El carrier gas con el compuesto de
interes pasar a traves de una celda, mientras que la otra celda (referencia) recibir a sola-
mente el carrier gas que no ha pasado a traves de la columna. Los lamentos se calientan
simultaneamente; cuando pasa la muestra con el carrier gas hay una absorcion de calor
por la muestra, lo que origina una diferencia de temperatura entre los dos lamentos de
los dos compartimientos. FIGURA Un cambio en la temperatura es medido por el corre-
spondiente cambio en la resistencia del lamento. El cambio resultante en la resistencia
del lamento ( temperatura) es comparado con el lamento de la celda de referencia. La
diferencia entre las corrientes de las dos celdas es la se nal, que es enviada al registrador
para procesarlo en un pico cromatograco.FIGURA
Detector nitrogeno fosforo (NPD)
Es un detector de ionizacion que es selectivo hacia compuestos que contienen atomos de
nitr ogeno o fosforo.
Principios: Funciona casi similar a FID excepto que tiene una sal alcalina sobre la
llama en la camara de combusti on. Una bolita de silicato de aluminio (sulfato de rubidio)
es calentada electricamente a 600 - 800
o
C por aplicacion de una corriente, produciendose
un plasma sostenida por adicion de hidrogeno y aire. Los iones del metal alcalino son
emitidos desde aqu interactuando con el euente de la columna.Una peque na corriente
es producida por los movimientos de iones generados desde el plasma al colector cargada
positivamente. La introducci on de nitr ogeno o fosforo contenidos en los compuestos causa
un aumento en la corriente por encima de la corriente base. Esta se nal es procesada por
el registrador en un pico cromatograco.
Detector fotometrico de llama
Es un detector optico y especco para compuestos que contienen f osforo y sulfuros.
Principios: Se combina H
2
y aire O
2
para producir una llama, el compuesto azufrado
que proviene del euente de la columna se quema en la llama y emite una longitud de
onda caracterstica del S
2
, lo cual es seleccionado por un ltro, luego esta luz emitida es
enviada a un tubo foto multiplicador que la transforma en corriente, la cual es enviada al
registrador para su procesamiento en el correspondiente pico cromatograco.
Compuesto azufrado
H
2
O
2
llama
SO + producto (3.1)
SO + O
3
SO
2
+ O
2
(3.2)
SO
2
SO
2
+ Energa (3.3)
3.13 Preparacion de la muestra
Es un proceso de transformar una muestra en una forma que sea adecuada para el analisis.
El proceso podra evaluar: extracci on del analito en una muestra compleja, precon-
centraci on de analito muy diluida para su medicion, remover o enmascarar las especies
interferentes, o transformar qumicamente el analito en una especie mas conveniente a
una forma mas facilmente detectable. (derivatizaci on.
34 E.Lans
Microextraccion en fase solida
Metodo por medio del cual se puede extraer compuestos de lquidos, aire o lodo sin usar
ning un solvente.
Purga y trampa
Es un metodo para remover analitos vol atiles de lquidos o solidos (tal como aguas sub-
terr anea o suelos)concentrando el analito e introduciendolo en el cromatografo. En con-
traste con la SPME el cual remueve una porci on del analito de la muestra , el objetivo
de purga y trampa es remover el 100% del analito en la muestra. Se burbujea el gas de
purga He en el recipiente donde se encuentra la muestra, el cual es calentado para ayudar
a la evaporaci on del analito, el gas de purga junto con el analito salen y pasan a traves
de un tubo de adsorcion que contiene tres capas de compuestos de adsorbente con fuerzas
adsorbentes diferentes ( bajo, moderado y alto) luego es retirado el tubo con los analitos
adsorbidos e inyectados en el cromatografo de gas, donde empieza la desorci on.
3.13.1 Selecci on del metodo en cromatografa de gas
Para seleccionar un metodo en cromatografa de gas se debe tener en cuenta lo sigu-
iente:Objetivo del analisis,preparacion de la muestra,detector, columna y modo de in-
yecci on.
Objetivo del analisis
Que se requiere del analisis?: La identicaci
on cualitativa de los componentes de una mezcla?. Requiere la separaci on una alta res-
olucion en todo el cromatograma? O una buena resolucion en una porci on de este?. Puede
sacricar resolucion por tiempo de analisis cortos?. Necesita el analisis cuantitativo de
uno o mas componentes?.Necesita alta precision?. Se encuentra el analito en concen-
tracion adecuada o necesita tecnicas especiales para ultra analisis (preconcentraci on y un
detector muy sensible).
Preparaci on de la muestra
La clave para una cromatografa exitosa en una muestra compleja es limpiarla antes de
entrar a la columna, para ello se usa la tecnica SPME o purga y trampa. Otros metodos
incluyen extracci on lquida, extracci on uidos supercrticos, extracci on en fase solida, des-
orci on termica de vol atiles de un material solido. Estas tecnicas aislan el analito deseado
de sustancias interferentes y pueden adem as concentrar analitos diluidos hasta niveles
detectables. Si la muestra no se limpia bien pueden aparecer un gran numero de picos no
resueltos y sustancias no vol atiles pueden arruinar su costosa columna cromatograca.
Escogencia del detector
Para ello se hace necesario si quiere un detector especco para un elemento en particular, o
para una clase particular de compuesto ej: el FID requiere que la muestra contenga mayor
o igual a 10 ppm de cada analito para la inyecci on split. El de conductividad termica
detecta toda clase de compuestos pero no es sucientemente sensible para analisis alta
resolucion y columnas open tubular de di ametro estrecho. El ECD es especco para
moleculas que contienen halogenos, carbonilos conjugados, nitrilos, y compuestos nitro.
La muestra debe contener concentracion mayor o igual a 100 ppb de cada analito. El de-
tector de fotoionizacion es especco para compuestos arom aticos. NPD para compuestos
con nitr ogeno y fosforo, FPD para compuestos que contienen sulfuros.Fotometrico de
llama para elementos como S, P , Pb o Sn.
MS e IR son utilizados para identicar los eluatos.
Selecci on de la columna
Para ello hay que tener en cuenta: la fase estacionaria, el di ametro de la columna, la
longitud y el espesor de la fase estacionaria. Las columnas pueden ser de polaridad
intermedia, no polar y altamente polar: por ejemplo: Para compuestos altamente polar se
necesita una columna fuertemente POLAR. Una columna con fase estacionaria intermedia
har a las mayoras de las separaciones que la columnas no polar no pueden hacer. La
mas alta resolucion es alcanzada con columnas estrechas y una fase estacionaria con
espesor muy delgado. Esta combinacion minimiza la resistencia a la transferencia de
masa termino C en la ecuacion de van deemter, la fase estacionaria y la m ovil reducen
la altura de plato. Columnas de pelculas delgada, estrechas son especialmente buenas
para separaciones de mezclas de compuestos de alto punto de ebullici on que son retenidos
demasiado fuertemente sobre columnas con pelculas gruesas. El tiempo de retenci on corto
provee alta velocidad de analisis, sin embargo pelcula con espesor de pelculas delgado,
di ametro estrecho tienen muy poca capacidad de muestras y requieren un detector con alta
sensibilidad (el FID no es adecuado) no retienen compuestos con bajo punto de ebullici on
y podra sufrir exposicion de sitios activos sobre la supercie de la slice.Columnas con
pelculas gruesa y estrecha dan una buena combinacion entre resolucion y capacidad de
muestra y pueden ser usada con la mayora de los detectores (excepto los TCD y el IR) y
con compuestos de alta volatilidad. Los tiempos de retenci on son m as largos que aquellos
de columnas con pelcula delgada.
36 E.Lans
Columnas con di ametro grande y pelculas gruesa son sugeridas para detectores de
conductividad termica TCD e IR ya que tienen alta capacidad de muestra y pueden
manejar compuestos vol atiles, pero dan baja resolucion y tiempos de retenci on muy largos.
Si una columna en particular satisface la mayora de sus requerimientos pero no provee
suciente resolucion, entonces una columna mas larga del mismo tipo podra ser usada.
Doblando la longitud de la columna dobla el n umero de platos y aumenta la resolucion
en 21/2, aunque esta no es la mejor manera de aumentar la resoluci on por que dobla el
tiempo de retenci on.
Al usar una columna mas estrecha o una fase estacionaria mas delgada incrementa la
resolucion sin perjudicar el tiempo de retenci on. Cambiando completamente el tiempo de
retenci on cambia tambi on la retenci on relativa de los componentes y podra resolver los
componentes de interes.
3.14 Escogencia del modo de inyeccion
Inyecci on split
Es util para analitos altamente concentrados, con este modo de inyecci on se consigue alta
resolucion.
Inyecci on splitless
Es util cuando las muestras estan muy diludas, se consigue igualmente alta resolucion.
Inyecci on on column
Es mejor para analisis cuantitativo y compuestos termicamente sensibles. Es una tecnica
de baja resolucion y no puede ser usada con columnas cuyo di ametro interno sea menor de
0.25 mm. Puede manejar soluciones diluidas o concentradas y vol umenes relativamente
grandes o peque os.
3.15 Analisis cuantitativo y cualitativo
Para identicar compuestos dos detectores son muy comunes. El espectr ometro de masas
y el IR con transformada de fourier. Un pico puede se identicado comparando su espectro
con una biblioteca de espectros que tiene el computador.
Co-Cromatografa
Es una forma mas adecuada de comparar tiempos de retenci on. Una muestra autentica
es agregada a una desconocida. Si el componente agregado es identico a la desconocida,
entonces el area relativa del pico aumenta.
Analisis cuantitativo
Para la cuanticaci on, en cromatografa se utilizan varios metodos, como son el metodo
del estandar interno, metodo del estard externo y el metodo de normalizaci on de area.
Metodo el estandar interno
Un estandar interno es un compuesto distinto al analito de interes pero que tiene propiedades
similares
El metodo del estandar interno se utiliza mucho en cromatografa ya que permite
una mayor precision toda vez que evita las peque nas variaciones de corrida en corrida
difciles de controlar producidas por la inyecci on de la muestra. (Harris 1999). Otra
razon para utilizar el estandar interno es que debido a la peque nas contidades de muestras
inyectadas en cromatografa no son muy reproducibles. El procedimiento consiste en
agregar una cantidad exactamente conocida de un estandar interno tanto a la muestra
como a los estandares,la relaci on de las areas ( o alturas)del analito y de estandar interno,
sirven como par ametro analtico. Para poder aplicar este metodo se requiere que el pico
de estandar interno este bien separado de los picos de los demas componentes de la
muestra,esto se consigue con una resolucion mayor de 1,25 mas o menos; no obstante a lo
anterior se requiere adem as que el pico del estandar este cerca del pico de analito.(Skoog
& Holler 1998)
Para cuanticar por medio de este metodo se utiliza la siguiente ecuacion:
A
x
/[] = F(A
s
/[S]) (3.4)
Donde: A
x
= Area de la se nal del analito
A
s
= Area de la se nal del estandar
[X[ = Concentracion del analito en estudio
[S] = Concentracion del estandar
F = Factor de respuesta
La ecaucion anterior obedece que la respuesta relativa del detector al analito y al
estandar es constante bajo un amplio rango de condiciones; por ejemplo si la se nal de
38 E.Lans
estandar incrementa por el cambio en la velocidad de ujo del solvente, ese mismo incre-
mento lo sufre la se nal del estandar.(Harris 1999)
Metodo de normalizacion de area
Para aplicar este metodo se toman el promedio de 5 replicas(inyecciones) del area del
analito de interes. Se escoge un componente como referencia y la respuesta relativa de
otros componentes se determinan dividiendo el area del pico de interes por el area del
pico de referencia. El factor de respuesta del detector se puede usar para calcular el area
corregida del pico de interes. Este procedimiento aplica para cada uno de los picos de los
componentes a estudiar, determinando su area relativa. Luego se suman todas las areas
corregidas y se divide por el area del pico en cuestion y multiplicandolo por cien.(A. &
F.J 1999).Veamos el siguiente ejemplo.
Para un componente x cuando existen patrones:
F
RD
=
A
x
A
ref
F
Rx
=
A
x
m
x
(3.5)
De donde:
F
RD
= Factor de respuesta del detector
F
Rx
= Factor de respuesta del compuesto x
A
x
=Area de compuesto de interes
m
x
=masa del compuesto de interes
Para el calculo del area corregida de un componente cuando existen patrones, lo cual
nos permite hacer un calculo exacto, se utiliza la siguiente ecuacion:
A
corregida
= F
RD
A
x
(3.6)
%A
x
=
A
corregida
x
A
corregida
100 (3.7)
Como es area es proporcional al peso(aforando al mismo volumen) entonces:
%W
A
=
A
corregida
A
corregida
100 (3.8)
Cuando no existen patrones solo se puede hacer un calculo semicuantitativo, para ello
se utiliza la siguiente formula:
%A
x
=
A
x
Ai
100 (3.9)
Para la exactitud del metodo se deben tener en cuenta los siguientes criterios:
1. Todos los analitos deben ser eludos
2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener igual sensibilidad (respuesta/masa)
Metodo del estandar externo
Uno de los metodos m as sencillos es este, el cual consiste en preparar una serie de disolu-
ciones patron de composicion pararecida a la muestra. Luego se obtienen los cromatogra-
mas de los patrones, representados en las alturas de plato o areas de pico en funcion de
la concentracion. Esta graca debera originar una lnea recta que pasa por el origen de
coordenadas. Para mejor exactitud en la medida se le debe hallar su pendiente con su
el intercepto con sus desviaci ones estandar, el coeciente de determinaci on r
2
y chequear
frecuentemente despues de varias corridas. Una vez hecha la curva se toma la lectura de
la muestra y se interpola en la graca, lograndose as la concentraci on buscada.
Captulo 4
ESPECTROMETR
IA DE MASAS
La espectrometra de masas da el nombre a un conjunto de tecnicas utilizadas para la
medida de las masas de los iones y su abundancia en la fase gaseosa.
El conjunto de tecnicas llamadas espectrometra de masas es una de las mas versatiles
e importantes instrumentos de analisis qumicos
4.1 Cualidades de la espectrometra de masas
4.1.1 Cualidades de indenticaci on
Puede identicar cualitativamente de forma inequvoca casi cualquier tipo de sustancia.
4.1.2 Cuantica e identica
Puede identicar y cuanticar la concentracion de la sustancia bajo estudio.
4.1.3 Sensibilidad
Detecta en el orden de ppq (ICP-MS) y tiene capacidad de separar mezclas complejas.
4.1.4 Universal y especca
Analiza sustancias o mezclas de sustancias solidas, lquidas y gaseosas. Es capaz de
detectar y separar una sustancia en presencia de una matriz compleja.
40
Espectrometra de masas 41
4.1.5 Informaci on estructural
Suministra informacion estructural de la molecula.
4.1.6 Rapidez
Puede realizar un espectro en decimas de segundos.
4.2 Tecnicas de ionizacion
Dependiendo de la naturaleza del compuesto a analizar o del interes del investigador
se utilizan varias tecnicas de ionizacion. Entre ellas tenemos: Ionizaci on por impacto
electr onico(EI),ionizacion qumica(CI) ,ionizaci on por campo(FD), desorci on por campo(FD),bombeo
con atomos rapidos(FAB),electrospray ( ES, ESI), ionizacion a presi on atmosferica.
Las tres primeras fuentes requieren la volatilizaci on de la muestra antes de la ionizacion;a
ellas se les llama fuentes de fase gas; por tanto solo se pueden usar para compuestos
termicamente estables que tengan puntos de ebullici on menores de 500
o
C. Mayoritaria-
mente las fuentes de gas estan limitadas a compuestos con pesos moloculares menores de
10
3
daltons.
4.3 Ionizacion por impacto electronico (EI)
Es el mas utilizado. Cuando las moleculas se encuentran en la camara de ionizacion son
sometidas a un bombardeo con una corriente de electrones provenientes de un lamento.
El n umero de electrones es controlado por la temperatura del lamento, mientras que su
energa lo es por el potencial a que se mantiene el lamento. El potencial del lamento
se puede variar. 70 eV es el mas usual.Figura 4.1
M + e
M
+
+ 2 e
(4.1)
4.4 Ionizacion qumica
En las fuentes de ionizacion qumica se utiliza un gas reactivo ( metano, amonaco, arg on,
isobutano etc) para suavizar las condiciones de ionizacion de la muestra . Por tal raz on
hay menos energa en exceso y por ende menos fragmentaci on que el EI ( por encima de
la que se necesita para la ionizacion). Se introduce el gas en la camara de ionizacion a
una presion de 10
3
torr, su concentracion es mucho m as alta que la de la muestra. Se
42 E.Lans
Figura 4.1: Ionizacion por impacto electronico
(Esteban 1993)
ioniza el gas con un haz de electrones y a traves de su subsiguientes reacciones acepta
protones para formar iones moleculares.
Si se usa metano el i on primario formado es el CH
5
+
, este, transere un proton a las
moleculas de analito que tienen mayor anidad por el proton, mediante la reaccion:
CH
5
+
+ M MH
+
+ CH
4
(4.2)
4.5 Ionizacion Qumica negativa
La reaccion m as frecuente es la abstraccion protonica.
MH + R
+ RH + Energa (4.3)
El exceso de energa producido en la reaccion suele quedar en forma de energa vibracional
asociada al enlace RH de la especie neutra formada, lo que hace que la especie M
formada sea muy estable y halla una ausencia casi total de fragmentaci on.
4.6 Ionizacion por campo
Aqu los iones se forman bajo la inuencia de un campo electrico elevado al aplicar altos
voltajes (10 a 20 kV) a emisores que contienen numerosas puntas nas de di ametros
menores de 1m. Estos emisores adquieren la forma de un no hilo de tungsteno en la
cual se han hecho crecer centenares de agujas microscopicas de carbon por pirolisis de
benzonitrilo que emergen desde la supercie del hilo.
La muestra gaseosa se difunde en el area del campo elevado alrededor de las micropun-
tas donde se concentra este. En las micropuntas es donde tiene lugar la ionizacion donde
los electrones del analito son extrados. En este caso el analito adquiere poca energa
vibracional y rotacional por lo que se produce poca fragmentaci on.
4.7 Fuentes de desorci on
Son aquellas donde no es posible la ionizacion de analitos termicamente inestables y no
vol atiles.
Los metodos de desorci on prescinden de la volatilizaci on y la posterior ionizacion.
En su lugar se suministra energa a la muestra lquida o solida de modo que se provoca
la formaci on directa de iones gaseosos. Como consecuencia, los espectros aparecen muy
simplicados y a menudo consisten solo en el i on molecular o el i on molecular protonado.
Con esta tecnica se puede obtener informacion sobre espectros de masas de especies bioqu-
micas y especies con PM por encima de 10.000 daltons.
4.8 Desorci on por campo
Se utiliza un emisor con multiples puntas como se describio anteriormente. En este caso
el electrodo se monta sobre una sonda que puede separarse del compartimiento de la
muestra y mojarse con una solucion de la muestra. Despues la sonda se reinserta en el
compartimiento de la muestra, la ionizacion tiene lugar por la aplicacion de un potencial
elevado a este electrodo.
4.9 Bombardeo por

Atomos Rapidos (FAB)
Es importante para el estudio por espectrometra de masas para compuestos de elevado
peso molecular. La muestra condensada (a menudo en glicerol) se ionizan por bombardeo
con atomos de elevada energa de xenon o arg on. Tanto los iones negativos y positivos
del analito son expulsados de la supercie de la muestra por un proceso de desorci on.
44 E.Lans
Este procedimiento permite un calentamiento rapido de la muestra reduciendo su frag-
mentaci on.
4.10 Ionizacion electrospray
4.11 Espectrometro de masas
Un espectr ometro de masas4.2 consta de:
1. Una fuente de ionizacion
2. Un analizador
3. Transductor(dectector)
4.11.1 Camara de ionizacion
Zona donde se introducen la moleculas ( pueden ser gaseosas, lquidas o solidas), se evap-
ora, se ioniza y se aceleran. (las muestras gaseosas se ionizan entre dos placas cargadas).
Los iones formados son de masas diferentes.
4.11.2 Analizador de masas
Despues de ser acelerados los iones pasan al analizador de masas que son de varios tipos,
donde se separan de acuerdo a su masa. Figura 4.3. En general en el analizador se necesita
un vaco del orden 10
7
torr o mejor. Para lograrlo se debe utilizar un sistema eciente
de bombeo.(?)
Figura 4.2: Partes de un espectrometro de masas
Figura 4.3: Esquema interno de un espectr ometro de masas
4.12 Detectores
Como ya lo habiamos dicho un detector es aquel que convierte una propiedad qumica de
un analito en una se nal subsectible de ser medida. En masas el detector m as utilizado
es el channeltron.El efecto es muy parecido al fotomultiplicador. Es un tubo de vidrio
abierto con un cono en una terminacion. Para la detecci on de iones positivos, el cono es
sometido a un alto potencial negativo (aproximadamente 3kV ).
4.12.1 Channeltron
Cuando los iones salen del analizador de masas, son atrados por el potencial negativo
del cono. Cuando los iones chocan con su supercie,as se originan uno o m as electrones
secundarios. El potencial dentro del tubo vara continuamente con la posicion, tal que
los electrones secundarios se mueven hasta llegar a otra zona donde se originan otros
electrones secundarios, y as sucesivamente.Figura 4.4
El tubo esta cubierto por un material semiconductor. La vida media del multiplicador
esta determinada por la carga total acumulada.
4.12.2 Copa de faraday
El analizador del gas consiste en una fuente del Ion, un espectr ometro total, y una seccion
de la medida. Se ioniza el gas residual cuando choca con los lamentos termoelectr onicos
cargados de alta temperatura, y los iones que se crean, se aceleran y convergen sobre
46 E.Lans
Figura 4.4: Detector channeltron
Figura 4.5: Copa de faraday
el espectr ometro total. En el espectr ometro total, los voltajes de la corriente alterna se
aplican a los cuatro electrodos cilndricos (quadropole), que permite que los iones sean
separados de acuerdo a su realci on masa/carga. Los iones separados son detectados como
corriente electrica por la Copa de Faraday. La corriente del on es proporcional a la masa
(presion parcial) del gas. Figura 4.5
4.13 Metodos acoplados a masas
Aunque la espectrometra de masas es una poderosa herramienta para la identicaci on
de compuestos puros es insuciente para el analisis de incluso mezclas simples ya que
la identicaci on esta limitada por el inmenso n umero de fragmentos de diferentes valores
m/z producidos.
Cromatografa de gas/masas- cromatografa lquida/masas
Es una buena herramienta para el analisis de mezclas org anicas y bioqumicas complejas.
En este caso se efect uan los espectros de los compuestos que salen de la columna cro-
matograca;los cuales son almacenados en un ordenador para el siguiente proceso.
Los espectr ometros de masas tambien se pueden acoplar a cromatografa lquida MS/LC
para el analisis de muestras que tienen constituyentes no vol atiles. El inconveniente que
se presenta en los acoplamientos anteriores es que la muestra en el cromatografo esta
diluda por el gas o el lquido portador de la columna; por lo que es necesario eliminar el
eluyente antes de la introducci on de la muestra en el espectr ometro de masas.
El detector de masas mas simple para cromatografa de gases es el detector de trampa
de iones (ITD)
Espectrometra de masas en tandem MS/MS
Consiste en acoplar un espectr ometro de masas a otro. El primer espectr ometro sirve
para aislar los iones moleculares de varios componentes de una mezcla. Estos iones se
introducen uno de tras otro en un segundo espectr ometro de masas. En un instrumento
en tandem el primer espectr ometro esta equipado con un metodo de ionizacion suave(
ionizacion qumica) para que la salida sea mayoritariamente de iones moleculares o iones
moleculares protonados.Estos iones pasan entonces a la fuente de ionizacion del segundo
espectr ometro. Esta fuente de iones consiste en una camara de colisiones sin campo en
la que se bombea helio. Las colisiones entre los iones progenitores y los atomos de helio
producen fragmentaciones de iones progenitores dando numerosos iones hijos. El espectro
48 E.Lans
de estos iones hijos se efect ua por un segundo espectr ometro. El primer espectrometro
tienen la misma funcion que la columna en GC/MS o GC/LC.
Aplicaciones de la espectrometra de masas en tandem
La espectrometra de masas en tandem parece ofrecer las mismas ventajas que GC/MS y
LC/MS pero es m as rapida.
La espectrometra de masas en tandem es potencialmente m as sensible que las dos
tecnicas cromatogracas acopladas, ya que el ruido asociado a su uso es menor.
4.13.1 Aplicaciones
Se ha utilizado en la determinaci on cualitativa y cuantitativa de los componentes de
una amplia variedad de materiales complejos encontrados en la naturaleza y la indus-
tria.Ejemplos
1. Identicaci on y determinaci on de metabolitos de drogas.
2. Feromonas de insectos.
3. Alcaloides en las plantas.
4. Trazas de contaminantes en el aire.
5. Secuencia de polmeros.
6. Compuestos petroqumicos.
7. Bifenilos policlorados.
8. Gases de escape de automotores.
9. Olores en aire.
4.13.2 Desventajas
Una desventaja de la cromatografa de masas en tandem con respecto a los otros proced-
imientos cromatogracos es el alto costo del equipo requerido.
4.13.3 Identicaci on de compuestos puros por espectrometra
de masas
El espectro de masas de un compuesto puro nos da informacion a cerca de:
1. Peso molecular del compuesto.
2. De su formula qumica.
3. Sobre la presencia de varios grupos funcionales, estudiando el modelo de frag-
mentaci on y comparando el espectro del compuesto con uno conocido hasta su total
coincidencia.
4. Relaci on con los picos debido a impurezas. Cuando existen dudas se deben utilizar
los espectros de ionizacion qumica o ionizacion por campo.
4.13.4 Analizador de trampas de iones
En este instrumento, los iones se generan a partir de la muestra eluda, por impacto
electr onico o ionizacion qumica y luego se almacenan en un campo de radiofrecuencia. A
continuacion los iones atrapados se expulsan del area de almacenamiento hacia un detector
multiplicador de electrones. La expulsion se lleva a cabo de tal forma que es posible un
barrido en funcion del cociente/masa carga.
Captulo 5
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ALTA RESOLUCI
ON (HPLC)
La cromatografa lquida es muy importante porque la mayora de los compuestos no son
lo sucientemente vol atiles para analizarse por cromatografa de gas.
En HPLC se usa alta presion para forzar el solvente a pasar a traves de una columna
que contiene unas partculas muy nas que dan alta resolucion a las separaciones. El
sitema HPLC involucra:
1. Un sistema de entrega de solvente.
2. Una v alvula de inyecci on de la muestra.
3. Una columna que resiste alta presion.
4. Un detector.
5. Un computador para el control del sistema. Modernamente se usa un sistema para
el control de la temperatura.
5.1 Proceso cromatograco
En cromatografa de gas para incrementar la eciencia se incrementara la velocidad de
transferencia de masas entre la fase estacionaria y la fase m ovil. Para una columna
open tubular esto es adecuado ya que disminuyendo el espesor de la pelcula de la fase
estacionaria y reduciendo el di ametro de la columna las moleculas pueden difundirse
50
Cromatografa lquida de alta resolucion 51
rapidamente.
La difusion de los lquidos es 100 veces mas lento que la difusi n de los gases. Por tanto
en cromatografa lquida no es generalmente factible usar columnas open tubular, por que
el di ametro de los canales del solvente es demasiado grande para ser atravesado por una
molecula de soluto en corto tiempo. De modo que la cromatografa lquida es llevada a
cabo en columnas empacadas.
5.1.1 Efectos del tama no de las partculas en HPLC
La eciencia de una columna empacada se incrementa cuando el tama no de las partculas
de la fase estacionaria decrece ya que disminuye la altura de plato. En condiciones
optimas el n umero de platos te oricos en una columna de longitud L (cm) es: N =
3.500L(cm)/dp(m)
dp = tama no de las partculas en micrometro.
Una razon de porque las partculas peque nas dan mejor resolucion es que ellas proveen
un ujo mas uniforme a traves de la columna, por tanto reducen el termino de m ultiples
pasos A en la ecuacion de Van Deempter.
Una segunda razon es que la distancia a traves de la cual el soluto debe difundirse en
la fase m ovil entre partculas se debe al tama no de estas. Cuando las partculas son
peque nas, hay menos distancia entre ellas, para que el soluto se difunda mejor en la fase
m ovil. Este efecto disminuye el termino C en la ecuacion de Van Deemter, dando un
tiempo nito entre equilibrio.
El inconveniente del peque no tama no de las partculas es la resistencia al ujo del
solvente, es por ello que requiere alta presion ( 70-400 atm).
5.1.2 Columnas
Las columnas en HPLC pueden ser de pl astico, vidrio o acero inoxidable con longitudes
entre 5 y 30 cms, con un di ametro interno de 1-5 mm. Las columnas son costosas,
facilmente degradables debido al polvo o partculas que se encuentran en la muestra o
el solvente, por lo que se requiere de un guarda columna. Un guarda columna es
una columna corta que contiene la misma fase estacionaria que la columna principal. Las
partculas nas e impurezas son retenidas por el guarda columna, la cual es periodicamente
reemplazado.
Si se calienta la columna generalmente disminuye la viscosidad del solvente, aumentando
su velocidad de ujo y reduciendo la presion requerida.
52 E.Lans
Igualmente incrementando la temperatura disminuye el tiempo de retenci on mejorando
la resolucion, ya que aumenta la difusion del soluto; no obstante este aumento de tem-
peratura puede degradar la fase estacionaria disminuyendo la vida util de la columna.Si
calentamos la columna unos pocos grados sobre la temperatura ambiente, mejora , la pre-
cision (reproducibilidad y repetibilidad) del analisis cuantitativo y el tiempo de retenci on.
5.1.3 Columnas analticas
El tama no de las partculas de relleno en esta columnas son de 3-10 m.
La columna m as utilizada es la de 25 cm con tama no de partculas de 5 my di ametro
interno de 4.6 mm.
Estas columnas alcanzan unas alturas de platos te oricos de 40.000 a 60.000.
5.1.4 Fase estacionaria
Existen dos tipos basicos de relleno pelicular y de partcula porosa. La mas com un son
partculas microporosas esfericas de slica que son permeables al solvente y tienen un
area de supercie bastante grande. Las esferas son de vidrio o polmeros con di ametro
de 30 a 40 m. En la supercie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa
de slice, al umina o resina de intercambio i onico.Estas esferas tambien se pueden tratar
qumicamente para obtener una capa supercial org anica.
Los tpicos rellenos de partculas porosas en cromatografa de lquidos estan formados
por micro partculas porosas con di ametros de 3 a 10 m.
5.1.5 Proceso de elucion
En la cromatografa de adsorcion las moleculas de solvente compiten con las moleculas de
solutos por los sitios activos de la fase estacionaria.
Las capacidades relativas de los diferentes solventes para eluir un soluto dado del
adsorbente son casi independiente de la naturaleza del soluto.
La eluci on se puede describir como un desplazamiento de soluto a traves la fase esta-
cionaria por el solvente.
Fuerza del eluente
o
Es una medida de la energa de adsorcion del solvente, la cual es cero (0) para el pentano
para adsorcion sobre slica. Entre m as polar es el solvente m as fuerza de elusion tiene
sobre la slica. Entre mas grande sea la fuerza del eluente mas rapidamente sera eludo
de la columna.
La cromatografa de adsorcion sobre slica bare es un ejemplo de cromatografa en
fase normal en la cual usamos una fase estacionaria polar y un solvente menos polar. Un
solvente mas polar tiene una fuerza de eluente mas alta.
5.2 Clasicaci on de la cromatografa lquida
La cromatografa lquida la podemos clasicar como:
5.2.1 Cromatografa en fase reversa
Es la mas com un donde el solvente es polar y la fase estacionaria es a polar o ligeramente
polar. Aqu un solvente menos polar tiene una fuerza de elucion mayor. Generalmente el
solvente es un hidrocarburo.
En la cromatografa en fase reversa se eliminan picos con cola (tailing) por que la
fase estacionaria tiene pocos sitios que puedan adsorber fuertemente al soluto como para
producir el tailing. La cromatografa en fase reversa es menos sensible a las impurezas
polares (como agua) en el eluente. En esta cromatografa los componentes mas polares
aparecen primero y un aumento en la polaridad de la fase m ovil disminuye el tiempo de
elucion.
5.2.2 Cromatografa en fase normal
En cromatografa en fase normal la fase estacionaria es polar y la fase m ovil es apolar;
el soluto menos polar se eluye primero debido a que es m as soluble en la fase m ovil y un
aumento en la polaridad en la fase m ovil aumenta el tiempo de elucion.
5.2.3 Cromatografa lquido-lquido o de partici on
En esta cromatografa las moleculas de soluto se distribuyen entre dos lquidos, uno de
ellos hace la veces de fase estacionaria y el otro de fase m ovil, esta ultima se encuentra
homogeneamente dispersa en un soporte solido.
Este tipo de cromatografa presento inconvenientes mayores como el hecho de que:1)se
requera presaturar la fase m ovil con la fase estacionaria.2)era necesario disolver la muestra
en la fase m ovil presaturada con la fase estacionaria y 3)no se podan llevar a cabo
gradientes de elucion.
54 E.Lans
Ejemplos
El siguiente ejemplo muestra el comportamiento de elucion de los distintos componentes
teniendo en cuenta su polaridad y la clase de polarografa utilizada.(Skoog & Holler 1998)
5.2.4 Cromatografa de adsorci on
Llamada cromatografa liquido-solido. Las unicas fases que se utilizan en HPLC lquido-
solido son la slice y la al umina, siendo la slice la que m as es utilizada, se usa para
casi todas las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y mayor diversidad de
presentaciones.
En cromatografa lquido-solido la unica variable que se puede utilizar para optimizar
K y es la composicion de la fase m ovil.
La cromatografa de adsorcion es m as adecuada para compuestos no polares con masas
moleculares inferiores a 5000.
Esta cromatografa es m as adecuada para muestras que son solubles en disolventes
no polares, por lo que tiene una solubilidad limitada en los disolventes acuosos utilizados
en cromatografa de fase inversa. Una caracterstica particular de la cromatografa de
adsorcion es su capacidad de diferenciar isomeros.
5.2.5 Eleccion del solvente
Para elegir el solvente adecuado se vara la relaci on entre los disolventes y se obtiene as
un valor adecuado de k
. Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor

de
o
por lo general disminuye 3 o 4 veces el valor de k
.
Con estas combinaciones se pueden encontrar la relaci on que favorezcan los tiempos
de retenci on para cualquier mezcla, pero por desgracia la relaci on de volumen no es lineal
con
o
.
Figura 5.1: Cromatografa fase inversa.(Fase m ovil de baja polaridad)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.2: Cromatografa fase normal.(Fase m ovil de polaridad media)
Figura 5.3: Cromatografa en fase normal.(Fase m ovil de polaridad media)
Polaridad de los componentes: A>B>C
Figura 5.4: Cromatografa en fase inversa.(Fase m ovil de alta polaridad )
56 E.Lans
5.3 Gradiente de eluci on isocratica
La elucion isocr atica es llevada a cabo con un solo solvente (o mezcla constante de sol-
vente). Cuando un solvente no es capaz de dar una elucion rapida de todos los compo-
nentes, entonces se usa el gradiente de elucion, que no es mas que hacer cambios
continuos en la composici on del solvente para aumentar su fuerza.
El gradiente de elucion en HPLC es analogo a la programaci on de temperatura en
cromatografa de gas.Aumentando la fuerza del solvente se eluye m as rapidamente el
soluto retenido.
5.4 Selecci on del modo de separaci on
Hay varias formas de separar un componente de una mezcla dada. En cualquier caso la
primera pregunta que se debe hacer es si es soluble en agua o en un solvente org anico.
Si el soluto se disuelve en un solvente no polar o debilmente polar, usaremos la cro-
matografa en fase reversa. Si el peso molecular del soluto es mayor de 2000 y son solubles
en solventes org anicos con di ametro molecular menor de 30 nm escogemos cromatografa
fase reversa (C
18
, C
8
, C
4
).
Si el peso molecular es mayor de 2000 y es soluble en solvente org anico y el tama no
molecular esta entre 30-400 nm la cromatografa a escoger es la exclusion por tama no.
Si el peso molecular del soluto es menor de 2000 y es soluble en agua y es i onico la
cromatografa a escoger es la i onica.
5.5 Solventes
Se requieren solventes grados HPLC muy puros para evitar la degradaci on de la columna
debido a las impurezas y minimizar la se nal de fondo del detector debido a contaminantes.
Para evitar esto se utilizan ltros para retener las partculas con tama nos de las micra.
La muestra y el solvente son pasados a traves de un guarda columna. A un contando
con un guarda columna se recomienda el lavado periodico de la columna analtica para
prolongar su vida util.
Antes del uso del solvente estos son purgados con He para remover el aire disuelto, ya
que las burbujas de aire les causan problemas a las bombas,a las columnas y detectores.
Las separaciones en fase normal son muy sensibles al agua en el solvente.
Una buena cromatografa con fases m oviles interactivas, requiere un equilibrio ade-
cuado entre las fuerzas intermoleculares entre los tres participantes activos en el proceso
de separaci on soluto, fase movil y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares
se describen en terminos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos.
Para una separaci on cromatograca de reparto la polaridad de la fase estacionaria ha de
ser similar a la del analito y para la elusion se requiere entonces una fase m ovil de una
polaridad considerablemente distinta. La polaridad de los grupos funcionales viene dada:
HIDROCARBUROS<ETERES <ESTERES <CETONA<ALDEHIDOS<AMIDAS <AMINAS
<ALCOHOLES. En conclusion podemos decir que para que ocurra una buena separaci on
las polaridades del soluto, fase m ovil y la fase estacionaria deben armonizarse, por que si
el soluto tiene mucha mas anidad con la fase m ovil, los tiempos de retenci on seran de-
masiado cortos para nes pr acticos, y si tiene demasiada anidad con la fase estacionaria
los tiempos de retenci on se hacen demasiado largos.
5.6 Criterios para una buena separaci on
El factor de capacidad es una medida del tiempo de retenci on (t
r
) en unidades de tiempo.
Separaciones razonables demandan que el factor de capacidad para todos los picos
deben estar en el rango 0,5-20. Si el factor de capacidad es demasiado peque no el primer
pico es distorcionado por el frente del solvente. Si el factor de capacidad es demasiado
grande el tiempo de analisis es muy prolongado.
Cuando no se observa perturbacion en la lnea base de un cromatograma el tiempo muerto
se puede estimar con la ecuacion :
t
m
=
Ld
c
2F
(5.1)
Donde L = longitud de la columna
d
c
= di ametro interno de la columna
F = velocidad de ujo
En cromatografa en fase reversa el t
m
puede ser medido pasando un soluto no retenido
(por ej. uracil detectado a 260 nm) a traves de la columna.
Para la cuanticaci on una resolucion mnima entre dos picos vecinos de 1.5 es deseada.
Para mayor robustez una resolucion de 2 es mucho mejor.
Otro criterio para una adecuada separaci on cromatograca es no exceder la presi on de
operaci on por encima de 15 MPa (150 atm) esto prolonga la vida de la bomba, v alvulas,
sellos y el automuestreador.
Todos los picos que necesiten ser medidos deben ser simetricos con un factor de
asimetra A/B en el rango de 0.9-1.5
58 E.Lans
5.6.1 Atributos de una buena separaci on
Para que se produzca una buena separaci on, se deben cumplir las siguientes condiciones:
1. 0,5 K
20
2. Resolucion 2
3. 0.9 factor asimetra 1.5
4. Presi on de operacion 15 MPa ( 150 atm)
5.7 Optimizacion con un solvente
Combinaciones de acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano(THF) con agua (buer acuoso)
son muy adecuados para separar un gran n umero de compuestos por cromatografa en
fase reversa.
La primera mezcla a probar sera acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una vis-
cosidad baja que permite operar a presiones relativamente bajas, y permite detecci on UV
por debajo de los 190 nm.
A esta longitud de onda un gran n umero de analitos presentan absorcion.
El metanol es el segundo solvente escogido por que tiene una alta viscosidad y un
cut-o(longitud de onda a la cual no hay absorcion del solvente por parte del detector)
en el UV mas grande.
El THF es la tercera mezcla escogida por que tiene un rango menor utilizable en el
UV, es lentamente degradado por oxidaci on y se equilibra mas lentamente con la fase
estacionaria.
5.7.1 Orden de escogencia de un solvente organico
1. ACETONITRILO
2. METANOL
3. HF
1
1
El acetonitrilo es un reactivo peligroso por lo que sus desechos deben ser hidrolizados con acetato de
sodio y vertidos al drenaje.
5.8 Optimizacion con dos o tres solventes organicos
Cuando se requieren dos o tres solventes organicos, se requiere primeramente una opti-
mizaci on, para ello se deben seguir los siguientes pasos:
Paso 1: Se optimiza la separaci on con acetonitrilo/buer para generar un cromatograma
A.
Paso 2: Se optimiza la separaci on con metanol/buer para generar un cromatograma
B.
Paso 3: Se optimiza la separaci on con THF/buer, para generar un cromatograma
C. Paso 4: Se mezclan los solventes, de los pasos 1,2 y 3 en proporciones 1:1 para generar
los cromatogramas D, E y F.
Paso 5: Hacer una mezcla de acetonitrilo, metanol y THF en proporci on 1:1:1 para
generar un cromatograma G.
Paso 6: Si alguno de los resultados mostrados en los cromatogramas de A a G, es
adecuado, seleccionelo.
Si la separaci on no se consigue con ninguno de los pasos anteriores es necesario que usted
pruebe una columna diferente u otra forma de cromatografa.(Harris 1999)
5.9 Temperatura como una variable en separaciones
isocratica
Cambiando la temperatura de la columna puede afectar la retenci on relativa de los difer-
entes compuestos en una mezcla, la temperatura tiene mucha inuencia en compuestos
i onicos( cationes amonio, cationes carboxilatos)y moleculas con m ultiples sustituyentes
polares.
Para elevadas temperaturas de operacion, el pH debe estar por debajo de 6 para
retardar la disolucion de la fase estacionaria de slica.
5.9.1 Como se consigue una buena separaci on?
Para hacer una buena separaci on se debe aumentar la resolucion, para ello usted debe:
1. Disminuir la velocidad del ujo.
2. Incrementar la longitud de la columna.
3. Disminuir el tama no de las partculas en la columna.
60 E.Lans
Resolucion =
t
r
W
av
=
t
r
1.70w1
2
(5.2)
t
r
= Separaci on entre picos
W
av
=Promedio del ancho de la lnea base
W1
2
=Promedio del ancho de pico a la mitad de la altura
Captulo 6
CROMATOGRAF
IA DE FLU
IDOS
SUPERCR
ITICOS
6.1 Deniciones
La cromatografa de udos supercrticos es una tecnicas se separaci on llamada tambieen
estraccion supercrtica.La cromatografa de udos supercrticos tiene importancia por que
permite la separaci on y la determinaci on de un grupo de compuestos que no se pueden
analizar adecuadamente ni por cromatografa de gas ni por cromatografa lquida
Los udos supercrticos combinan caractersticas de gases y lquidos Ej.: los coecientes
de difusi on y viscosidad de los FSC son semejantes a la de los gases de arrastre en cro-
matografa de gas, mientras que sus densidades se aproximan a la de los lquidos.
Estos compuestos son los no vol atiles o termicamente l abiles a los que no se pueden aplicar
los procedimientos de cromatografaa de gas y aquellos que no contienen grupos funcionales
que hagan posible su detecci on por las tecnicas espectrosc opicas o electroqumicas que se
utilizan en cromatografa lquida
En CFS es posible hacer variar tres condiciones que son similares a los que se hacen
variar en HPLC: Temperatura, composicion del eluyente y la velocidad de la fase m ovil
Fludo supercrtico:Sustancia llevada mediante operaciones mec anicas a unas
condiciones operativas de presion y temperatura crtica.
Temperatura crtica:Temperatura por encima de la cual no puede existir una fase
lquida independientemente de la presion.
Presion crtica:Es la presion de vapor de una sustancia a temperatura crtica.
Punto crtico:Temperatura y presion superiores pr oximas a la presi on y temper-
atura crtica.
61
62 E.Lans
6.2 Caractersticas de un udo supercrtico
Gran poder disolvente junto con una enorme capacidad de penetraci on en solidos,
lo que permite el agotamiento rapido y pr acticamente total de los solidos extrables.
A diferencia en HPLC y GC en los FSC el aumento de presi on a una temperatura
dada incrementa la densidad la cual aumenta la solubilidad de la mayora de los
analitos.
Otra caracterstica de los FSC es que un aumento de temperatura a determinada presi on
produce una menor densidad del udo, lo que conduce a una menor solubilidad. Como
resultado, incluso cuando la temperatura y la composicion del eluyente son constantes, la
cada de presion desde la entrada hasta la salida de la columna signica que las solubil-
idades de los analitos disminuye conforme estos avanzan por la columna. Para resumir
podemos decir que el metodo es menos sencillo que en GC y HPLC.
6.3 Analitos
En la actualidad la CFS no es tan popular como GC o HPLC. Es una tecnica casi ideal
para realizar separaciones de algunos surfactantes y polmeros. Se preere la CFS para
estos compuestos por que no es necesario la volatilizaci on para obtener un gas, y la
transferencia de masas es un orden de magnitud mayor que en las fases m oviles de HPLC.
Esto implica una reducci on signicativa del tiempo de analisis, pues logra un equilibrio
m as rapido entre la fase m ovil y la estacionaria.Tambien se ha demostrado que CFS es
util para separar algunos compuestos quirales. El orden de retenci on suele ser el mismo
que para HPLC quiral, pero las separaciones son mas rapidas.
6.4 Fase Movil
La fase m ovil en CFS se inicia en un cilindro de gas a alta presi on, pero el udo per-
manece comprimido y se calienta por encima de su temperatura critica, para as obtener
condiciones supercrticas. El di oxido de carbono es la fase m ovil que se emplea con mayor
frecuencia, debido a su bajo costo, no es inamable ni toxico. Como no es polar se le
agregan modicadores polares para permitir el analisis de compuestos polares.
Los modicadores que se agregan con frecuencia incluyen metanol y etanol, para sustan-
cias basicas, aminas. Los gradientes en CFS se obtienen cambiando las condiciones que
modican la solubilidad del analito en la fase m ovil supercrtica.
Cromatografa de udos supercrticos 63
6.5 Cosolventes
Sustancia que se le agrega al sistema para aumentar la selectividad y el poder disolvente
del udo, con caractersticas similares a las del soluto. Se agrega en una concentraci on
mayor que la del soluto pero menor que la del disolvente.
Las diferencias de solubilidad de distintas sustancias en Fludos supercrtico se deben a
las caractersticas de los solutos solidos tales como presion de vapor y a las interacciones
particulares que se establecen entre un soluto dado con el disolvente supercrtco.Como
consecuencia de esto moleculas muy parecidas pueden tener solubilidades muy diferentes
ej:La extraccon con CO
2
supercrtico la cafena de los granos del cafe y de la teo-
bromina de las hojas del te. Para el extracci on de la cafena el proceso es excelente
y no lo es as para la extracci on de la teobromina del te a pesar de que la unica difer-
encia entre ambas moleculas es que donde tiene la teobromina un atomo de hidrogeno,
la cafena tiene un grupo CH
3
.La extracci on de cafena es uno de los procesos m as ex-
itosos de extraccon supercrtica, mientras que la baja solubilidad de la teobromina en
CO
2
supercrtico impide el uso de este proceso para extraerla. Cerca de 100, 000 toneladas
de cafe son tratadas anualmente con CO
2
supercrtico para extrarerlo totalmente.
6.5.1 Fludos usados para extracci on supercrtica
Para la extracci on en udos supercrticos se utilizan las siguientes fases m oviles: CO
2
,
H
2
O, C
2
H
6
, C
2
H
4
,C
3
H
8
,Xe,N
2
O.
El CO
2
cuya temperatura crtica de 31, 2
o
C cercana a la ambiente, se convierte en el
disolvente apropiado para manejar sustancias l abiles a pesar de que sus propiedades como
disolvente son mucho m as modesta que las del agua. Por ejemplo son insolubles en CO
2
,
incluso a altas densidades, las sustancias polares y muchas no polares. La solubilidad de
una sustancia en un disolvente superctico es en general menor que en los lquidos con-
vencionales., esto se compensa por que cuando se emplean FSC la separaci on de soluto
y disolvente le logra ecientemente mediante un simple proceso de expansi on. Esto evita
tener que aumentar la temperatura para eliminar el disolvente por evaporaci on, como
sucede con los disolventes adicionales.
Los procesos que emplean FSC son, en general, m as caros que los convencionales debido
a costo de la etapa de compresion y del connamiento de los udos.
6.6 Forma e inyeccion de la muestra
La introducci on del liquido en CFS es similar a la inyecci on en HPLC. Las muestras en fase
gaseosa no son adecuadas para CFS. Los solidos se extraen con los FSC y se concentra el
64 E.Lans
extracto. El tipo de muestra que se emplea en CFS con mayor frecuencia es una solucion.
6.7 Columnas y fases estacionarias
Las columnas para CFS son pr acticamente iguales a las de HPLC y algunas columnas en
GC. Son de acero inoxidable, y se empacan con partculas de 5 m; los calibres peque nos
de 250 y 530m son los mas comunes. Las fases estacionarias pueden ser del tipo que
se emplean en HPLC normal o fase reversa: slica porosa, al umina y slica con grupos
org anicos enlazados.
6.8 Detectores
Los detectores de gases FID y UV en HPLC deben estar construidos para funcionar
con el volumen relativamente grande de gas que se produce al despresurizar el udo
supercrtico. Los detectores similares a los que se utilizan en HPLC se modican para
tolerar las presiones necesarias para mantener a los udos supercrticos.
6.9 Areas donde se utilizan los udos supercrtico
Un area de reciente interes en la aplicacion de los FSC es la de los procesos de descon-
taminacion o desctruccion de residuos t xicos. Suelos o sedimentos uviales con-
taminados con pesticidas, como DDT y otros contaminantes org anicos han sido tratados
exitosamente con CO
2
, mientras que fenoles y productos relacionados han sido extrados
ecientemente de disoluciones acuosas.En lo relativo a los desechos toxicos, el agua su-
percrtica presenta una ventaja respecto a la incineraci on, ya que esta ultima requiere
temperaturas hasta de 1, 200
o
C, provacando la emisi on de sustancias que contaminan el
ambiente, entre ellos las dioxinas producidas por la incineraci on incompleta especialmente
las arom aticas policloradas.. Utilizando agua supercrtica a unos 500
o
C y en presencia
de un oxidante es posible quemar sustancias org anicas completamente en una reaccion
termicamente autosostenida, produciendo solo nitr ogeno, dioxido de carbono y otras sus-
tancias inorg anicas. El inconveniente radica en la alta corrosividad del agua supercrtica
sobre los materiales utilizados, lo que obliga a utilizar aleaciones especiales encareciendo
el proceso.
Otrs areas de utilizacion de FSC son los metodos analticos separativos en cromatografa
utilizando udos supercrtico, obtenci on de productos naturales y alimenticios(extracci on
de aceites vegetales y grasa de semillas, drogas de plantas, aromas,sabores, perfumes
Cromatografa de udos supercrticos 65
y especias, eliminacion de nicotina del tabaco).separaci on de hidrocarburos pesa-
dos(desasfaltado de las fracciones pesadas del petroleo, recuperaci on y puricacion de
lubricantes, licuefacion del carbon etc.) regeneracion(carb on activado, adsorbentes, l-
tros y catalizadores)agua potable a partir de agua de mar(oxidaci on de corrientes
acuosas que contienen productos org anicos).
Captulo 7
ELECTROFORESIS
7.1 Introduccion
Una separaci on electroforetica se lleva a cabo inyectando una peque na parte de la muestra
a una disolucion tamp on que esta alojada en un tubo estrecho o en un medio de soporte
poroso y plano, como un tubo estrecho, papel o un gel semis olido. Seguidamente se aplica
un elevado potencial de corriente continua a traves del tamp on mediante dos electrodos
situados en los extremos del tamp on. El potencial impulsa los iones de la muestra a migrar
hacia uno u otro extremo de los electrodos. La velocidad de migracion de un especie dada
depende de su carga y su tama no.
Las separaciones en consecuencia se basan en las diferencias en la relaci on tama no-
carga entre los diferentes analitos presentes en la muestra.Cuanto mayor es esta relaci on
m as rapido migra un i on en el seno del campo electrico. La separaci on se lleva a cabo en
un medio tamponado que act ua simultaneamente como conductor de la corriente electrica
y controlando o jando la carga electrica de las sustancias a analizar
7.2 Electroforesis
El termino electroforesis se emplea para describir aquellas tecnicas de separaci on que se
basan en la diferente movilidad que tienen las partculas cargadas en el interior de un
campo electrico. Es un metodo de separaci on que se basa en la diferente velocidad de
migracion de las especies cargadas, en el seno de una disolucion amortiguadora, a traves
de la cual se aplica un campo electrico constante.
El par ametro m as importante de esta tecnica es el campo electrico,(E) denido como
el voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separaci on, de acuerdo a esto
prodramos decir que cuanto mayor sea el campo electrico aplicado mayor sera la res-
66
Electroforesis 67
oluci on que se podra obtener, puesto que mayor sera al velocidad de migracion de los
diferentes componentes de la muestra no obstante a campor electricos elevados, la corri-
ente electrica que circula por el medio de separaci on va a ser alta y como consecuencia
se va a generar una cantidad de calor. Este calor es un inconveniente por varias razones
a la hora de llevar a cabo una separaci on por que puede generar gradientes de temperat-
uras, ujos de conveccion del tampon que dicultara la separaci on, desnaturalizacion de
protenas o perdidas de actividades enzimaticas etc.
Para solucionar estos problemas generados por el calor se han utilizado varios proced-
imientos, entre ellos trabajar a campos electricos bajos, pero podramos obtener tiempos
de separaci on muy grandes y mala resolucio. trabajar con medios anticonvectivos, como
los geles de poliacrilamida o garosa que de acuerdo a su naturaleza microporosa son re-
sistentes a la circulaci on del tamp on. trabajar a campos electricos altos pero la separacion
se da dentro de un capilar relleno de tamp no esto ultimo di o origen a la electroforesis
capilar
7.2.1 Tipos de electroforesis
Existen dos tipos de electroforesis, electroforesis capilar y la electroforesis convencional.
7.2.2 Electroforesis convencional
Es utilizada para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interes biol ogico
y bioqumico.
En la electroforesis convencional, las separaciones se llevan a cabo sobre una capa del-
gada y plana o placa de un gel semis olido y poroso que contiene un tamp on acuoso en el
interior de sus poros. En estas placas se pueden separar varias muestras simultaneamente
como en cromatografa en capa na. Las muestras se disponen como manchas o bandas
sobre la placa y se aplica el potencial de corriente continua, a traves de la placa, durante
un perodo de tiempo jo. Cuando creemos que las separaciones se ha completado se
interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se ti nen para visualizarse.
La velocidad de migracion de un i on en centmetros por segundo, en el seno de un campo
electrico es igual al producto de la intensidad del campo electrico por la movilidad elec-
troforetica.
=
e
E (7.1)
E(V cm
1
)
e
(cm
2
V
1
S
1
)
La
e
(movilidad electroforetica) es directamente proporcional a la carga del analito e
68 E.Lans
inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El potencial electrico
act ua sobre los iones por lo que se mover an a traves del tamp on. Las especies neutras no
se separan.
Para iones del mismo tama no la fuerza impulsora sera mayor en el de mayor carga,
y tendr a una movilidad de migracion mas rapida. Para iones que tengan igual carga la
velocidad de migracion sera m as rapida en el i on m as peque no. La relaci on tama no-carga
de los iones cambiaran estos efectos.
7.2.3 Electroforesis capilar
La electroforesis convencional es lenta y laboriosa y adem as no proporciona resultados
cuantitativos precisos.
La electroforesis capilar da lugar a separaciones con vol umenes de muestra de 0.1 a 10
nL, contrario a la convencional que usa volumen de uL.
Aqu en vez de colorear, para identicar la sustancia se utilizan detectores cuantitativos
como los empleados en HPLC.
Velocidad de migraci on
La velocidad de migracion depende de la intensidad del campo electrico aplicado. El
campo electrico (E) se determina por la magnitud del potencial aplicado (V en voltios) y
la longitud sobre la que se aplica.
=
e
V
L
(7.2)
Factores que determinan la resoluci on en electroforesis capilar
N umero de platos:
En cromatografa tanto la difusion longitudinal como la transferencia de masas con-
tribuyen al ensanchamiento de la banda. Como en electroforesis esta implicada una sola
fase, solo se considera la difusion longitudinal. Para electroforesis el n umero de platos
(N) viene dado por la siguiente expresion
N =
e
V
2D
(7.3)
D = Coeciente de difusion del soluto en cm
2
S
1
Como la resolucion se incrementa al aumentar el n umero de platos, se debe aplicar un
Electroforesis 69
elevado potencial para obtener mayores separaciones. Observese que aqu el n umero de
plato no se incrementa con la longitud de la columna.
La electroforesis capilar genera normalmente un n umero de platos comprendido entre
100.000 y 200.000 comparados con los 5.000 y 20.000 obtenidos en HPLC.
Flujo electroomostico
Cuando se aplica un potencial elevado a traves de un capilar que contiene un tamp on, se
origina un ujo llamado, ujo electroosmotico, gracias al cual el solvente migra hacia el
anodo o el catodo.
La causa del ujo electroosmotico es la doble capa electrica que se forma en la interfase
slice/disolucion. Figura 7.1
A valores de pH por encima de 3 la pared interna de un capilar de slice presenta
carga negativa debido a la ionizacion de los grupos silanoles (SiOH) de la supercie.
Los cationes del tamp on se agrupan sobre la supercie negativa de capilar de slice para
formar la doble capa electrica.
Los cationes que estan en la capa exterior de la doble capa, son atrados haca el catodo,
y dado que los cationes estan solvatados arrastran el resto de la disolucion con ellos a lo
largo del capilar. La electro osmosis conduce un ujo en la disolucion que tiene un perl
plano, perpendicular al capilar, contrario del perl parabolico del ujo en cromatografa
lquida, cuyo origen es la presion. Debido a este perl plano el ujo electrosmotico no
contribuye al ensanchamiento de banda de manera signicativa, como s ocurre con el
ujo producido por la presion en HPLC. Figura 7.2.
Aunque los analitos migran seg un su carga dentro del capilar, la velocidad del ujo
electrosmotico es normalmente suciente como para arrastrar todos las especies cargadas
positivamente, los neutros y los cargados negativamente hacia el mismo extremo del capi-
lar, de tal forma que todos ellos pueden detectarse al pasar por un punto com un. El
electroforegrama es similar a un cromatograma. La velocidad de ujo electrosmotico
viene dada por una ecuacion similar a la anteriormente vista, esto es:
=
eo
E (7.4)
En presencia de la electro osmosis la velocidad de un i on es la suma de su velocidad de
migracion y de la velocidad del ujo electrosmotico as:
V = (
eo
+
e
)E (7.5)
e
= En caso de un anion tendr a signo negativo
Como consecuencia de la electro osmosis, el orden de elucion en una separaci on por elec-
troforesis capilar tpica es:
70 E.Lans
Figura 7.1: Flujo electroosmotico
Figura 7.2: Perl del ujo electroosmotico
Electroforesis 71
Primero los cationes m as rapidos, seguido de los m as lentos, segundo las especies
neutras en una zona y nalmente los aniones. Figura 7.3
En algunos casos la velocidad de ujo electrosmotico no es lo bastante grande como
para superar la velocidad a la cual se mueven algunos aniones hacia el anodo, en cuyo
caso estas especies se desplazan hacia el a nodo.
7.2.4 Cambio de sentido del ujo electroosm otico
Se logra agregando un tensoactivo cati onico al tamp on. El tensoactivo se adsorbe sobre
la pared del capilar y hace que esta quede cargada positivamente. Ahora los aniones del
tamp on se agrupan en las proximidades de la pared y son arrastrados hacia el anodo,
electrodo positivo.
Esta estratagema se usa a menudo para acelerar la separaci on de los aniones.
El ujo electroosmotico puede ser eliminado recubriendo la pared interna del capilar con
un reactivo como el trimetilclorsilano para eliminar los grupos silanoles de la supercie.
7.3 Instrumentacion
Consta de un capilar de slice fundida con 10-100 m de di ametro interno de 40 a 100
cm. de longitud y que esta lleno de un tamp on conectado entre si por dos recipientes que
contienen el mismo tamp on, que tambien contienen dos (2) electrodos de platino.
La introducci on de la muestra se lleva a cabo por uno de los extremos y la detecci on
por el otro extremo.Figura 7.4
7.3.1 Introducci on de la muestra
Inyecci on electrocinetica
Un de los recipientes del capilar se retira con su respectivo electrodo. Luego este extremo
es sumergido en el recipiente donde se encuentra la muestra y se le aplica un potencial
determinado hasta que la muestra penetre en el capilar debido a la actuacion conjunta de
los fen omenos de migracion i onico y ujo electroosmotico. Luego el extremo retirado se
coloca nuevamente en la solucion tamp
on original donde se mantiene durante el proceso de separaci on.Figura. 7.5
Inyecci on por presion
Se retira un extremo del capilar y se introduce en el recipiente de la muestra, a la cual se le
aplica una diferencia de presion. Esta diferencia de presion proviene de aplicar vacio en el
72 E.Lans
Figura 7.3: Direccion del ujo electroosm otico
Figura 7.4: Componentes b asicos de un sistema de electroforesis capilar
Electroforesis 73
Figura 7.5: Metodos de introducci on de muestra
extremo del detector o de la aplicacion de presion en el recipiente que contiene la muestra,
o bien por elevacion del extremo que contiene la muestra. En ambos casos el volumen
inyectado se controla por la duracion de la inyecci on. 5-50 nL son los mas comunes.
7.4 Sistema de deteccion
Los detectores son similares en dise no y funcion a los utilizados en HPLC. La diferencia
esta en el comportamiento de estos; en electroforesis capilar cada i on migra a una velocidad
determinada debido a su movilidad electroforetica. Por tanto las bandas del analito llegan
al detector a diferentes velocidades, lo que hace que las areas de los picos sean dependientes
del tiempo de retenci on. En cambio en HPLC todas las especies pasan a traves del detector
a la misma velocidad de la fase m ovil, as que las areas de los picos son independientes
de los tiempos de retenci on.
7.4.1 Metodos de absorbancia
El camino optico para las medidas de absorbancia es muy peque no, y para mejorar estas
medidas se han propuestos varios metodos.
1. a) Celda tipo Z de 3 mm: Se dobla el extremo del calpilar para aumentar el
camino optico
74 E.Lans
2. b)Celda de tipo burbuja de 150 m: Se forma una burbuja cerca del capilar
3. c) Celda de reexiones m ultiples: En el extremo del capilar se deposita un
recubrimiento de plata reectante , y la radiaci on experimenta numerosas reexiones
antes de salir del capilar. Figura.7.6
7.5 Modalidades de la electroforesis capilar
La electroforesis capilar es el nombre generico para una familia de tecnicas relacionadas
que tiene su origen en la electroforesis capilar por zona (CZE) y son: electroforesis capi-
lar por gel(CGE), enfoque isolectrico capilar(CIEF), cromatografa capilar miscelar elec-
trocinetica (MECC) y la isotacoforesis capilar(CITP). Aunque las tecnicas dieren sig-
nicativamente una de otras, se pueden llevar a cabo con la misma instrumentaci on basica.
7.5.1 Electroforesis capilar por zona (CZE)
La composicion del tamp on es constante en toda la zona de separaci on. El potencial
aplicado hace que los diferentes componentes i onicos de la mezcla migren cada uno seg un
su propia movilidad y se separen en zonas.
7.5.2 Electroforesis capilar en gel (CGE)
Se lleva a cabo en una matriz polimerica con estructura de gel poroso, cuyos poros con-
tienen una mezcla tamp on en la que se lleva a cabo la separaci on.
7.5.3 Isotacoforesis capilar
Las bandas de todos los analitos migran nalmente a la misma velocidad, por eso recibe
el nombre de ISO, igual y TACO velocidad. La razon por la cual todas las bandas se
mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace mas reducido para las bandas
m as m oviles, y se hace mas intensa para las bandas mas lentas, de tal forma que la
corriente es la misma en todas las zonas del tamp on. (A. & F.J 1999)
Electroforesis 75
Figura 7.6: Dise nos de celda para mejorar la sensibilidad de detecci on por medida de absorbancia
aumentando el camino optico
Bibliograa
A., B. & F.J, S. (1999), Chromatographic Methods, fth edn, Kluwer Academic Publishers.
Esteban, L. (1993), La Espectrometra de masas en imagenes.
Harris, D. C. (1999), Quantitative Chemical Analysis, Vol. 1, 5a edn, W.H.Freeman and
Company, New York.
McNair, H. M. & Miller, J. M. (1998), Basic Gas Chromatographic, 1 edn, John Wiley
and Sons, INC.
Skoog, D. A. & Holler, F. (1998), Principles of Instrumental Analysis, Vol. 1, fth edition
edn, Harcourt Brace and Company, Orlando Florida.
76
Indice Alfabetico
Adsorbentes, 20
Aplicaciones, 48
Asimetra, 8
Co-cromatografa, 37
Coeciente de difusion, 14
Coeciente de partici on, 6
Columnas, 51
empacadas, 28
tubulares abierta, 26
Columnas analticas, 52
Constante de distribucion, 7
Constante RF, 25
Cosolventes, 63
Cromatografa, 1
capa na, 20
de udos supercrticos, 3
de gases, 2
fase reversa
fase normal, 53
lquida, 2
plana, 2
Cromatografa de adsorcion, 54
Cromatograma, 4
cut-o, 58
Desorcion, 43
desorci on, 41
Detector, 45
FID
ECD, 31
Fotometrico de llamas, 33
TCD
NPD, 32
Difusi on, 68
Dioxinas, 64
Eciencia, 10, 51
Electroforeris
capilar por zona
en gel, 74
Electroforesis
capilar, 68
convencional, 66
Eluato, 4
Eluci on, 52
Eluyente, 4, 22
Factor de capacidad, 4
Fludo supercrtico, 61
Flujo electrosmotico, 69
fuerza del eluente, 52
Fuerzas
i onicas
enlaces de hidrogeno, 9
repulsi on
Van Der Walls, 9
Gradiente, 56
Inyecci on
on column, 36
por presion
electrocinetica, 71
split
77
78 E.Lans
splitless, 36
Ionizaci on
por bombardeo de atomos rapidos
electrospray, 44
por campo, 43
qumica
quimca negativa, 41
ionizacion, 44
EI, 41
ionizacion impacto electr onico, 41
ionizacion por campo, 41
ionizacion qumica, 41
Isotacoforesis, 74
Isoterma, 16
L abil, 63
Metodos
qumicos
fsicos , 24
Masas, 40
N umero de plato, 69
optimizacion con solventes, 58
Placas, 21
Plato te orico, 11
Presi on crtica, 61
Punto crtico, 61
Resolucion, 12, 57, 68
Resolucion de una columna, 3
Retencion relativa, 4
Separaci on, 1, 59
Solventes, 56
Supercrtico, 63
supercrtico, 64
Tailing, 8, 53
Tandem, 47
Temperatura crtica, 61
Tiempo
muerto
retenci on ajustado, 5
Van Deemter, 14

Métodos de Separación, Analítica III

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Encabezamiento

):Es un par ametro importante que con frecuencia se utiliza

de la siguiente ecuacion, teniendo en cuenta

de una especie dada es menor que la unidad, es

es del orden de 20 a 30 o mayores,es porque los tiempos de re-

V = fraccion de tiempo que el analito reside en la fase m ovil

N, de tal modo que si doblamos la longitud de la

2. Igualmente podemos decir que la resolucion

= factor de capacidad d = espesor de la fase estacionaria D = coeciente de difusi on

. Se ha encontrado que un aumento de 0,05 unidades en el valor

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