DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE

BRADFORD
(no sacar esta hoja)

Blanco: Este tubo no contiene proteína, se reemplaza la muestra por agua y se le

agrega el correspondiente volumen de reactivo. Se realiza para determinar la
absorbancia del reactivo, este valor se descuenta de la absorbancia del resto de los
tubos.
Curva de calibración: Para su realización se utilizará la solución testigo de
concentración conocida. Con la medida de absorbancia de cada tubo y conociendo la
cantidad de proteínas que contiene cada uno de los tubos, es posible realizar una
curva de calibración (gráfico A595 vs µ g de proteína). Es necesario realizarla cada vez
que se procesen las muestras. La concentración del TESTIGO es 100 µ g/ml.
Muestra incógnita: se procesa en simultáneo y en las mismas condiciones que la
curva de calibración. El tubo contiene la muestra y la misma cantidad de reactivos
que los anteriores. Para conocer la cantidad de proteínas de la muestra (µ g), se
determina la absorbancia de la misma y se interpola en la curva de calibración. Cada
grupo procesa una sola Muestra incógnita (A o B).
Protocolo:

Tubo H2O Testigo Muestra Reactivo de Proteína Absorbancia

(µ l) (µ l) AoB Bradford (µ g) a 595 nm
(µ l) (ml)
Blanco 600 -------- ---------- 2

1 450 150 ---------- 2

2 300 300 ---------- 2

3 ------- 600 ---------- 2

-
Muestra ------- ------- 600 2
AoB -

Procedimiento:
Pipetear en el orden de la tabla:
- Primero el AGUA con la pipeta de 1 ml (rotulada H2O).
- El TESTIGO con otra pipeta de 1 ml (rotulada T) respetando el orden de los
tubos: 1,2 y 3.
- Luego con otra pipeta de 1 ml (rotulada A o B según corresponda) la MUESTRA
INCÓGNITA en su tubo correspondiente.
-Por último, el reactivo de Bradford con la pipeta de 5 ml (rotulada R).
- Mezclar el contenido de los tubos.
- Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
Observar el color de la curva de calibración y comparar con el color de la muestra
incógnita con la curva. De esta manera estimar los valores de proteínas de la muestra
incógnita. Luego leer en el fotocolorímetro tanto la curva y como la muestra incógnita.
Completar la tabla con los valores de absorbancia y realizar el gráfico A595 vs µ g de
proteína.
 Interpolar en el gráfico el valor de absorbancia de las muestras incógnita en dicha
curva y determinar µ g de proteína de las muestras y en luego determinar su
concentración µ g/ml. Analizar si existe concordancia con el valor estimado
visualmente.

Al finalizar el trabajo práctico es IMPORTANTE que todo el material quede

limpio y en su lugar.
Se enjuagarán las pipetas con agua. Para limpiar los tubos de Bradford los alumnos
contarán con una pizeta con etanol. Primero se descartará el contenido de los tubos
en las piletas. Luego se enjuagarán los tubos con un poco de etanol y por último con
abundante agua.