DISEO EXPERIMENTAL

Primeramente se prepararon o se obtuvieron los cultivos con diferentes cualidades o

aportes al microorganismo, esto a fin de evaluar la participacin de los componentes
propios de cada medio, en la tabla siguiente se muestra la distribucin de dichos
componentes as como las condiciones de crecimiento.

Obtencin de Cultivos
MATRAZ KNO3 OLIGOELEMNTOS CONDICIONES
1 - + Anaerbicas
2 + + Anaerbicas
3 + - Anaerbicas
4 + + Aerbicas

Se observa la participacin de los oligoelementos (cofactores), del nitrato
(componente para respiracin) y por ultimo las condiciones de medio que
determinaran el proceso que realizara el microorganismo usando as determinadas
enzimas, y evaluando su actividad.

Determinacin de la actividad de la formiato deshidrogenasa.

En la actividad de formiato deshidrogenasa se adiciono 2-6Diclorofenolindofenol
siendo este un aceptor de electrones, sufriendo as una reduccin y cambiando su
coloracin, por lo que el anterior compuesto utilizado adems de ser aceptor acta
tambin como un indicador de la actividad enzimtica siendo que a mayor
desaparicin de color mayor actividad enzimtica existir. Por otro parte se adiciono
formiato de sodio (enzima), metasulfato de fenazina siendo este ltimo un acarreador
de electrones, ya por ltimo se adicionaron los 4 diferentes extractos celulares y se
evala la actividad enzimtica del microorganismo por variaciones de absorbancia a
diferentes tiempos, tal que este sea comparable con una curva tipo realizada
previamente. (La cual no tendr actividad Enzimtica).

La oxidacin del formiato de sodio, catalizada por la FDH, genera electrones que
reducen el compuesto metosulfato de fenazina (PMS) que posteriormente reducir la
2,6 diclorofenol indofenol (DCIP).


Determinacin de la actividad de nitrato reductasa.

Para la actividad de nitrato reductasa se adiciono nitrato el cual actuara de aceptor
final de electrones sustituyendo as al oxgeno en condiciones de anaerobiosis, se
adiciono benzil viologeno el cual es un acarreador que recibir los electrones
provenientes del hidrosulfito y posteriormente transformara el nitrato a nitrito para
las funciones metablicas del microorganismo, posteriormente se determin la
actividad enzimtica del complejo compuesto de las 2 enzimas anteriores.
Reduccin del bencil viologno:




Determinacin de Nitritos

Para ambas actividades se determin la presencia de nitritos por un mtodo
espectrofotomtrico (Mtodo de Griess).



Determinacin de protena por el mtodo de Lowry
Ya por ltimo se determin la protena por el mtodo de Lowry, a fin de cuantificar la
actividad enzimtica por miligramo de protena presente en el medio dentro del cual
se desarroll el microorganismo.

Mtodo de Lowry
Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se
aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad
de color de la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley
de LambertBeer.
Este mtodo consta de dos etapas:
Los iones Cu
2+
, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu
2+
-protena tienen un
color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de
la protena, exponindose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reaccin. El Cu
2+
se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo
con tartrato.
La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos
fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando
el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el
cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos
fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.







Reaccin entre la protena y lo reactivos