2013

Protocolos de Microbiologia Ambiental

Parte 1 Mtodos bsicos em microbiologia



Escola Superior Agrria
Instituto Politcnico de Coimbra
Manuela Abelho
Manuela Abelho


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ndice
Introduo ...................................................................................................................................................... 2
Cultura e isolamento de microrganismos ..................................................................................................... 2
Protocolo 1.1 Preparao e distribuio de um meio de cultura slido ........................................... 4
Protocolo 1.2 Obteno de um inculo por diluies decimais sucessivas ...................................... 5
Protocolo 1.3 Sementeira por incorporao ...................................................................................... 5
Protocolo 1.4 Sementeira por espalhamento em placa ..................................................................... 6
Protocolo 1.5 Isolamento por riscado em placa ................................................................................. 6
Caracterizao cultural e bioqumica de microrganismos ........................................................................... 6
Protocolo 1.6 Caracterizao cultural de colnias ............................................................................. 8
Protocolo 1.7 Elaborao de um esfregao e colorao de Gram ..................................................... 8
Elaborao de um esfregao .................................................................................................................. 8
Colorao de Gram ................................................................................................................................. 8
Protocolo 1.8 Actividade da catalase (hidroperoxidase) ................................................................... 9
Protocolo 1.9 Actividade da citocromo-oxidase ................................................................................. 9
Avaliao quantitativa de populaes ........................................................................................................... 9
Protocolo 1.10 Contagem em placas ................................................................................................. 11
Protocolo 1.11 Cmaras de contagem ............................................................................................... 11


Manuela Abelho


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Protocolos de Microbiologia Ambiental
Parte 1 Mtodos bsicos em microbiologia
Introduo
Devido ao seu tamanho microscpico, os microrganismos so normalmente invisveis a olho nu (a
excepo ocorre quando, ao crescerem em populaes com milhes de indivduos, se tornam
macroscopicamente observveis, como acontece por exemplo com as colnias de bactrias ou de
leveduras, com os miclios dos fungos filamentosos ou com algumas das suas estruturas de
reproduo, como os cogumelos). Mas cada clula microbiana microscpica e por esse motivo a
microbiologia fundamentalmente uma cincia laboratorial.
A maioria dos estudos laboratoriais ocorre em culturas puras, podendo assim estudar-se vrias
caractersticas morfolgicas ou bioqumicas da espcie em estudo. Mas na natureza, os
microrganismos no se encontram isolados dos outros seres vivos; de facto, a maioria ocorre em
comunidades diversas com outros microrganismos e com seres macroscpicos, quer plantas quer
animais, em meio terrestre, em meio aqutico e em meio areo. Como so microscpicas, as clulas
microbianas encontram-se aderidas a superfcies vivas (clulas ou tecidos de seres macroscpicos), a
superfcies orgnicas (por exemplo, matria orgnica morta) ou a superfcies minerais. Assim, a sua
observao em ambiente natural torna-se muito difcil, se no mesmo impossvel na maioria dos casos.
Cultura e isolamento de microrganismos
Os microrganismos esto presentes na natureza em comunidades mais ou menos complexas. No
entanto, para o estudo de muitas caractersticas dos microrganismos necessrio o seu isolamento em
culturas puras. A cultura e o isolamento de microrganismos so duas operaes bsicas em
microbiologia. O crescimento de comunidades microbianas em meios de cultura no laboratrio,
permite a obteno de culturas puras culturas que contm apenas um tipo de microrganismo ou de
culturas mistas culturas que tm mais do que um tipo de microrganismo. O isolamento promove a
separao de um microrganismo a partir de comunidades mistas.
Os meios de cultura possibilitam a multiplicao de microrganismos em laboratrio sob condies
controladas, o que permite o seu isolamento e caracterizao morfolgica e bioqumica. As exigncias
metablicas do mundo microbiano so muito diversificadas, pelo que os meios de cultura utilizados
devem corresponder s exigncias especficas do tipo de microrganismo que se quer cultivar. Em
relao sua composio qumica, os meios de cultura quimicamente complexos permitem a
multiplicao da maioria dos microrganismos heterotrficos. J em relao ao seu estado fsico, os
meios de cultura slidos permitem no s a multiplicao, mas tambm o isolamento de
microrganismos, de forma a obter culturas puras.
As culturas puras podem ser obtidas atravs de vrios mtodos e visam o desenvolvimento de uma
populao a partir de uma nica clula inicial:
Mtodo de estrias ou de riscado em placa (Figura 1.1): um mtodo de isolamento
bastante rpido que consiste no espalhamento de uma pequena poro de inculo, colhida
com uma ansa, que sucessivamente riscada na superfcie de um meio de cultura slido. A
execuo do riscado pode ser feita de vrias formas; o importante que pelo menos uma clula
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fique isolada das restantes de forma a obter-se uma colnia derivada da multiplicao dessa
clula original, isto , constituda por clulas geneticamente iguais.
Mtodo das diluies decimais sucessivas (Figura 1.2): consiste na realizao de
diluies decimais (1 para 10) sucessivas da amostra, em condies de esterilidade, e posterior
sementeira de quantidades conhecidas das mesmas em caixas de Petri. A diluio tem como
objectivo a obteno de menos densidade celular por unidade de volume, de forma que, aps
sementeira, pelo menos algumas clulas fiquem isoladas originando colnias formadas por
clulas iguais entre si. A sementeira (operao que consiste em distribuir uniformemente o
inculo em meio de cultura apropriado) pode ser efectuada por vrios mtodos, sendo os mais
comuns o espalhamento superfcie e a inoculao por incorporao.

Figura 1.1. Exemplo de um riscado em placa. Fonte: http://mansfield.osu.edu/~sabedon/biol4035.htm
(consultado em 24-Janeiro-2011).
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Figura 1.2. O mtodo das diluies decimais sucessivas. Fonte:
http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap06/Microbial%20Growth%20ss5.htm
(consultado em 24-Janeiro-2011).
O crescimento dos microrganismos em meio slido d origem formao de colnias (crescimento
macroscopicamente visvel resultante da multiplicao celular). Se as clulas microbianas estiverem
completamente dispersas, cada colnia corresponde a uma bactria inicial em estado vivel e
cultivvel. Se os microrganismos estiverem agregados ou aderentes a pequenas partculas no h
correspondncia entre o nmero de colnias obtido e o nmero inicial de microrganismos. Desta
forma, relativamente origem de uma colnia, ou ao teor de microrganismos determinado por
contagem de colnias, fala-se em Unidades Formadoras de Colnias (UFC).
Aps a obteno de uma cultura pura, a sua manuteno em laboratrio deve garantir que os
microrganismos permaneam viveis, geneticamente homogneos e protegidos de posteriores
contaminaes. As culturas podem ser mantidas por refrigerao (4C), congelao (-20C, -70C ou
em azoto lquido: -180C) ou liofilizadas. Para conservao a longo prazo devero usar-se substncias
crioprotetoras (e.g., glicerol).
Protocolo 1.1 Preparao e distribuio de um meio de cultura
slido
1. Seguindo as instrues da embalagem, pese a quantidade de p necessria para preparar o
volume indicado pelo docente;
2. Transfira para um Erlenmeyer o p que pesou;
3. Mea o volume necessrio de gua destilada numa proveta e transfira para o Erlenmeyer;
4. Coloque um magnete dentro do Erlenmeyer e agite numa placa de aquecimento at obter
uma soluo lmpida, seguindo as instrues da embalagem;
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5. Mea o pH e se necessrio, ajuste-o para o valor indicado na embalagem, adicionando
gota-a-gota as solues cida ou alcalina;
6. Tape o Erlenmeyer com a rolha de algodo e o papel de alumnio;
7. Coloque o Erlenmeyer com o meio de cultura a esterilizar na autoclave (121C durante 15-
20 minutos);
8. Retire o Erlenmeyer da autoclave e deixe arrefecer at atingir uma temperatura que
permita o seu manuseamento, mas superior a 42C;
9. Desembrulhe as caixas de Petri estreis e identifique-as com o nome do meio de cultura e
a data da sua elaborao;
10. Verta o meio de cultura nas caixas de Petri em condies de assepsia, fazendo uma camada
de aproximadamente 5 mm;
11. Deixe solidificar, inverta e guarde a 4C at sua utilizao.
Protocolo 1.2 Obteno de um inculo por diluies decimais
sucessivas
1. Identifique previamente os 4 tubos de ensaio contendo 9 mL de soro fisiolgico, com as
referncias 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
e 10
-4
;
2. Homogeneze a suspenso de microrganismos fornecida e, em condies de assepsia,
transfira com uma pipeta 1 mL da suspenso para o primeiro tubo (diluio 10
-1
);
3. Descarte a pipeta e homogeneze a suspenso diluda;
4. Com outra pipeta esterilizada retire 1 ml da diluio (diluio 10
-1
) e introduza-a num
segundo tubo de diluio, para obteno da diluio 10
-2
;
5. Proceda de igual modo at diluio 10
-4
, seguindo o esquema da Figura 1.2;
6. Semeie imediatamente, de acordo com os mtodos indicados nos pontos seguintes,
seguindo a ordem decrescente das diluies e utilizando uma s pipeta para todas as
sementeiras da mesma amostra.
Protocolo 1.3 Sementeira por incorporao
1. Mantenha o meio de cultura slido num banho a 45C (o gar comea a solidificar a 42-
44C);
2. Identifique 5 caixas de Petri estreis com a data, turma e n de aluno e diluio respectiva
e marcar uma caixa de Petri extra com a letra C (controlo);
3. Seguindo a ordem decrescente das diluies, retire, em condies de assepsia, 1 ml de cada
uma das diluies indicados pelo docente uma pipeta esterilizada, depois de a ter enchido
e esvaziado pelo menos 6 vezes na suspenso de microrganismos;
4. Entreabrindo apenas o suficiente a tampa da caixa de Petri, coloque o contedo da pipeta
no fundo da caixa;
5. Tire a rolha do tubo de meio slido liquefeito, passe a boca do tubo pela chama e verta, de
uma s vez, o seu contedo na caixa de Petri;
6. Incorpore o inculo no meio de cultura: mantendo a caixa assente sobre o tampo na
bancada, agite-a suavemente - evitando que o gar toque a tampa da caixa - em todas as
direces, de forma a misturar o inculo no meio de cultura (descreva cinco crculos no
sentido dos ponteiros do relgio, cinco em sentido contrrio e movimentos rectilneos
segundo duas direces cruzadas, cinco vezes cada tambm);
7. Afaste a caixa da chama e deixe repousar at solidificar;
8. Utilize uma caixa-controlo, na qual no se deposita inculo;
9. Aps solidificao do meio, identifique as caixas com a data de inoculao, diluio e
microrganismo inoculados, inverta e leve a incubar a 25C durante dois dias.
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Protocolo 1.4 Sementeira por espalhamento em placa
1. Identifique convenientemente o material a inocular;
2. A partir de cada uma das diluies indicadas pelo docente, pipete em condies de
assepsia 0.1 ml para a superfcie do meio de cultura solidificado;
3. Com um espalhador de vidro estril espalhe o inculo por toda a superfcie da caixa
semeada, rodando-a simultaneamente;
4. Identifique as caixas, coloque em posio invertida e leve a incubar a 25C durante dois
dias.
Protocolo 1.5 Isolamento por riscado em placa
1. Observe as caixas de Petri com culturas mistas e escolha uma das colnias;
2. Com uma ansa esterilizada e arrefecida toque na colnia;
3. Risque com a ansa a superfcie do gar, de acordo com um esquema que vise esgotar
completamente o material contido na ansa (Figura 1.1);
4. Identifique, inverta e leve a incubar a 25C durante 2 dias.
Caracterizao cultural e bioqumica de microrganismos
Na descrio de microrganismos importante ter em conta certas caractersticas morfolgicas do
crescimento, conhecidas por caracteres culturais (Figura 1.3), que incluem os seguintes aspectos:
A morfologia da colnia isolada numa superfcie de agar; na colnia isolada devem
observar-se o tamanho, a cor, a forma, a elevao, a margem, a superfcie, o brilho, a
opacidade e a consistncia;
A morfologia do crescimento coalescente numa picada em profundidade (esta fornece
indicao do tipo fisiolgico do organismo em relao ao oxignio, consoante a zona em
que o crescimento se verifica);
O desenvolvimento em meio lquido;
O aparecimento de pigmentos na prpria massa de crescimento ou difundidos no meio de
cultura.

Figura 1.3. Caractersticas culturais (forma, elevao e margem) de colnias em meio slido. Fonte:
http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=Book&func=displayfigure&book_id=3&fig_number=4&chap_
number=7.(consultado em 24-Janeiro-2011).
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Para a observao de microrganismos pode recorrer-se a preparaes a fresco - quando h interesse
em fazer a observao em condies de vida, por exemplo para observar a mobilidade e tipo de
locomoo, para detetar mudanas citolgicas durante a diviso celular, para a diferenciao de
esporos, etc. H, porm, objectivos que tornam conveniente a colorao das preparaes, como por
exemplo:
Aumento do contraste entre as clulas e o meio (o ndice de refraco do protoplasma
bacteriano muito semelhante ao do meio circundante, sendo difcil o exame das bactrias em
preparaes no coradas, a no ser que se usem mtodos especiais de iluminao como por
exemplo a microscopia de contraste de fase);
Diferenciao de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante (coloraes
diferenciais);
Observao de estruturas particulares (e.g., parede celular, material nucleico, esporos,
cpsula, etc.).
A colorao de Gram (Christian Gram, Dinamarca, 1884) uma tcnica de colorao diferencial, que
permite distinguir dois tipos de bactrias com base nas caractersticas da parece celular (Figura 1.4).
Baseia-se no facto de que quando as bactrias so coradas com certos corantes bsicos, as clulas de
Gram-negativo podem ser facilmente descoradas com solventes orgnicos (e.g., etanol, acetona),
enquanto as clulas das espcies Gram-positivo resistem a esta descolorao. A capacidade das clulas
reterem ou perderem o corante reflecte diferenas na estrutura fundamental da parede celular, pelo
que a resposta colorao de Gram uma caracterstica taxonmica importante, usada numa fase
inicial da identificao das bactrias.

Figura 1.4. A colorao de Gram. Fonte: http://microbiologiaonlineblog.blogspot.com/2010/12/microbiologia-
online-com-foco-em.html (consultado em 24-Janeiro-2011).
Um aspecto importante na caracterizao de microrganismos a sua relao com o oxignio. Muitos
microrganismos possuem enzimas que os protegem dos efeitos dos produtos da reduo do oxignio,
que so extremamente txicos destruindo rapidamente as clulas devido a serem agentes oxidantes.
Os microrganismos aerbios estritos e anaerbios facultativos contm geralmente a enzima catalase
que catalisa a destruio do perxido de hidrognio e a enzima super-xido dismutase (SOD), que
catalisa a destruio do radical super-xido. Os microrganismos aerotolerantes podem no ter catalase
Nas bactrias Gram-negativas, o
lcool remove os lpidos da
membrana externa da parede
celular, aumentando a sua
permeabilidade; o complexo violeta
de cristal-iodo pode assim ser
extrado, descorando as bactrias
Nas bactrias Gram-positivas, o
tratamento com lcool resulta na sua
desidratao, com reduo da
permeabilidade da parede e
consequente reteno do complexo
violeta de cristal-iodo
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mas tm sempre super-xido dismutase (SOD). Os anaerbios estritos no tm ambas as enzimas e
por isso no toleram o oxignio. O teste da actividade destas enzimas permite saber qual a relao de
um microrganismo com o oxignio.
Protocolo 1.6 Caracterizao cultural de colnias
1. Observe atentamente lupa binocular as colnias das caixas de Petri e, sem abrir as
caixas, descreva as caractersticas morfolgicas das colnias (Figura 1.3)., em relao a:
Tamanho (mea na base da caixa o dimetro da colnia com uma rgua)
Cor
Forma
Margem
Elevao
Superfcie (lisa/rugosa)
Brilho (brilhante/mate)
Opacidade (transparente/translcida/opaca)
Consistncia (cremosa/butirosa/viscosa/granulosa)
Protocolo 1.7 Elaborao de um esfregao e colorao de Gram
Elaborao de um esfregao
1. Retire com a pina uma lmina de vidro do recipiente e inflame chama;
2. Coloque uma gota de gua destilada esterilizada na lmina;
3. Esterilize uma ansa chama e deixe arrefecer;
4. Em condies de assepsia, retire com a ansa um pouco da massa de uma colnia e
suspenda o material na gota de gua;
5. Espalhe muito bem numa rea de aproximadamente 1 cm
2
, esfregando bem de forma a
separar a massa de clulas;
6. Segure a lmina com uma pina e passe rapidamente sobre a chama at toda a gua
evaporar para fixar o material.
Colorao de Gram
1. Inunde o esfregao fixado com violeta de cristal (corante primrio) agitando suavemente
durante 60 segundos (Figura 1.4);
2. Lave com gua corrente, comeando na extremidade da lmina e deixando escorrer por
cima do material fixado;
3. Inunde o esfregao com soluo de Lugol, deixando atuar durante 60 segundos (vai
formar um complexo com o violeta de cristal);
4. Lave com gua corrente e seque com papel de filtro, pressionando suavemente o papel
contra a preparao;
5. Inunde o esfregao com lcool iodado (agente descolorante), agitando suavemente
durante 60 segundos;
6. Inunde com corante vermelho safranina durante 30 segundos, lave e seque com papel de
filtro;
7. Observe ao microscpio, verificando se as clulas so Gram-positivas ou Gram-negativas e
registando a sua forma e a sua dimenso.


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Protocolo 1.8 Atividade da catalase (hidroperoxidase)
1. Coloque uma gota de gua oxigenada a 10% numa lmina de vidro escavada;
2. Em condies de assepsia, toque com a ansa esterilizada e arrefecida numa colnia e
coloque a massa celular na gota de gua oxigenada, homogeneizando;
3. Verifique se h libertao imediata de oxignio (borbulhar), o que indica a atividade da
catalase (a catalase actua sobre a gua oxigenada, libertando gua e oxignio de acordo
com a seguinte reao: H2O2 2 H2O + O2).
Protocolo 1.9 Atividade da citocromo-oxidase
1. Num pedao de papel de filtro, coloque uma gota de dimetil-p-fenilenodiamina (1%);
2. Toque numa colnia de bactrias com uma pipeta de Pasteur com a extremidade fechada e
passe sobre o papel de filtro molhado;
3. Observe o resultado da actividade aps 2 minutos. A reaco positiva quando aparece cor
violeta e negativa quando no existe alterao de cor.
Avaliao quantitativa de populaes
A avaliao quantitativa do crescimento microbiano pode ser feita de diversas formas, dependendo das
caractersticas do material e da informao pretendida. Por convenincia, os parmetros medidos so
normalmente os seguintes:
Actividade dos microrganismos que constituem a populao em estudo. Por exemplo,
reduo de corantes (medida pelo grau de reduo em determinado tempo ou pelo tempo
necessrio reduo), libertao de CO2 (pelo volume ou pela massa perdida), consumo
de O2 (pela chamada Carncia Biolgica de Oxignio, CBO);
Massa celular, uma vez fixadas as condies de observao e conhecida a funo que
relaciona a massa celular com o nmero de microrganismos presentes (ex. gravimetria,
nefelometria);
Nmero de clulas: contagem dos microrganismos, directa ou total (ex. cmaras de
contagem e mtodo de Breed) e indireta ou de microrganismos viveis (ex. contagem em
placas e mtodo do Nmero Mais Provvel - NMP);
O nmero de clulas viveis presentes numa populao microbiana (clulas com capacidade para se
multiplicar) pode ser estimado usando tcnicas de contagem em placas. Neste mtodo um volume
conhecido de uma suspenso de microrganismos, convenientemente diluda, espalhado na superfcie
de um meio de cultura solidificado (sementeira por espalhamento em placa) ou incorporado nesse
meio (sementeira por incorporao). As colnias que se desenvolvem, aps incubao adequada, so
contadas. Assume-se que cada colnia originada a partir de uma nica clula, o que nem sempre
verdade, pelo que os resultados so normalmente expressos em termos de unidades formadoras de
colnias (UFC). Para que os resultados sejam significativos as placas contveis devero ter entre 30 a
300 colnias. O nmero total de microrganismos obtm-se multiplicando o nmero de colnias pelo
factor de diluio.
Um dos processos mais usuais de determinao do nmero de microrganismos a contagem directa ao
microscpio, usando cmaras de contagem. Estas so constitudas por uma lmina que tem gravado
um reticulado de dimenses conhecidas no fundo de uma pequena depresso que, coberta com uma
lamela no flexvel e perfeitamente aderente aos bordos, fica com uma profundidade livre geralmente
conhecida. O espao assim criado, cujo volume conhecido, preenchido com um lquido em que se
encontram suspensas as partculas a contar. Admitindo que as partculas se distribuem
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homogeneamente no lquido e que a amostra contida na cmara representativa da inicial, a contagem
das partculas presentes num volume conhecido pode ser generalizada a essa amostra inicial.
Habitualmente procura-se minimizar a heterogeneidade da distribuio contando um nmero
suficientemente grande de unidades do reticulado.
As cmaras de contagem existentes derivaram dos chamados hemocitmetros, inicialmente
concebidos para contagem de clulas de sangue. Permitem hoje a contagem de clulas to pequenas
como as bactrias. O reticulado de Neubauer (Figura 1.5) ocupa um quadrado de 3 mm de lado, com
divises e subdivises. As divises maiores so nove quadrados de 1 mm de lado. Esses quadrados
encontram-se divididos em 16 subdivises de 0.25 mm de lado, ou seja, 144 no total. Alguns desses
quadrados de 0.25 mm de lado (fazendo uma cruz na zona central da cmara) esto divididos em
rectngulos com 0.25 mm de comprimento e o.o5 mm de largura. Na zona central, estas divises
encontram-se ainda divididas formando quadrados de 0.05 mm de lado.

Figura 1.5. Reticulado da cmara de contagem de Neubauer. Profundidade = 0.100 mm. Fonte:
http://metodoslabideanellydiazpuentes.blogspot.com/2009/11/conteo-de-celulas-en-camara-de-neubauer.html
(consultado em 24-Janeiro-2011).
Para a contagem deve escolher-se o tamanho da diviso mais adequado dimenso das clulas e sua
densidade (entre 10 e 50 clulas por diviso). A contagem directa ao microscpio uma tcnica rpida
e que permite, tambm, obter informao sobre o tamanho e morfologia dos microrganismos. No
entanto, encontra-se sujeita a erros, provenientes principalmente da reprodutibilidade de enchimento
da cmara de contagem e da adsoro de bactrias s superfcies do vidro. As suas principais
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desvantagens esto associadas sensibilidade ( necessria uma elevada concentrao de clulas,
superior a 106) e ao facto de no permitir distinguir as clulas vivas das mortas.
Protocolo 1.10 Contagem em placas
1. Observe as caixas de Petri inoculadas por incorporao ou por espalhamento superfcie;
2. Seleccione apenas as que permitam contar entre 30 a 300 colnias e conte as colnias nas
caixas seleccionadas (pode ir assinalando as colnias com uma caneta de acetato medida
que efectua a contagem);
3. Calcule para cada caixa o nmero de clulas viveis presentes na suspenso original
(UFC/ml), i.e., a abundncia de microrganismos cultivveis, tendo em ateno o nmero
de UFC contadas e a diluio efectuada antes da sementeira;
4. Calcule o nmero mdio de UFC das diversas repeties.
Protocolo 1.11 Cmaras de contagem
1. Observe a cmara de contagem, familiarizando-se com o reticulado;
2. Coloque uma lamela sobre a cmara e com uma pipeta de Pasteur preencha por
capilaridade o espao da cmara;
3. Foque o reticulado, certificando-se qual a rea e o volume correspondentes s divises
respectivas;
4. Seleccione a diviso cujo tamanho lhe permita contar 10-50 clulas por diviso;
5. Conte o nmero de clulas em vrias dessas divises (20 divises);
6. Calcule a mdia do nmero de clulas por diviso;
7. Calcule o nmero total de clulas por unidade de volume da suspenso (nmero de
clulas/mL).