Departamento de Microbiologa e Instituto de Biotecnologa
UNIVERSIDAD DE GRANADA 1. Clulas madre: conceptos bsicos
Definicin de clulas madre: son aquellas clulas dotadas simultneamente de la capacidad de autorrenovacin (es decir, producir ms clulas madre) y de originar clulas hijas comprometidas en determinadas rutas de desarrollo, que se convertirn finalmente por diferenciacin en tipos celulares especializados. En el contexto de la actual investigacin, se pretende obtener clulas madre que se mantengan como tales en cultivo en el laboratorio, y que bajo determinados estmulos puedan conducir a poblaciones de clulas diferenciadas. El zigoto (vulo fertilizado) es una clula totipotente, capaz de dar origen a todo el organismo. Durante las primeras divisiones el embrin es una esfera compacta (mrula), en la que todas las clulas son totipotentes, y de hecho esto se refleja de modo natural en los gemelos monozigticos. A los pocos das comienza una primera especializacin, de modo que se produce un blastocisto, con una capa superficial que dar origen al trofoblasto, del que deriva la placenta, y una cavidad casi hueca (rellena de fluido) en la que est la masa celular interna (m.c.i.). (Ir a fotos de estas primeras fases embrionarias humanas) Las clulas de esta m.c.i. son pluritotentes, porque aunque por s solas no pueden dar origen al feto completo (necesitan el trofoblasto), son el origen de todos los tejidos y tipos celulares del adulto. Hay que aclarar un punto: aunque las clulas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes, no son en s mismas clulas madre dentro del embrin, porque no se mantienen indefinidamente como tales in vivo, sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina. Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrin y se cultivan in vitro bajo ciertas condiciones, se convierten en clulas inmortales dotadas de esas dos propiedades de las que hablbamos: autorrenovacin y pluripotencia. Obtencin en ratn de clulas madre embrionarias: desde inicios de los aos 80. Actualmente, en casi cualquier raza de ratn es posible separar blastmeros de m.c.i. del blastocisto, y cultivarlos de modo que las clulas resultantes (clulas madre o troncales, stem cells) presentan dos notables propiedades: pluripotencia y capacidad de contribuir a la lnea germinal: Pluripotencia: Las clulas madre pueden diferenciarse in vivo e in vitro en una gran diversidad de tipos celulares. In vivo dicha multipotencia se manifiesta cuando al incorporar clulas madre en blastocistos pueden dar origen a cualquier tejido u rgano, In vitro pueden contribuir igualmente, con las seales adecuadas, a diferentes lneas celulares de las tres capas embrionarias (ecto-, meso- y endodermo). Este es el campo donde ms se est investigando actualmente, por su relevancia para la clonacin teraputica, como veremos. Contribucin a la lnea germinal: Las clulas madre embrionarias de ratn pueden contribuir a la lnea germinal de ratones quimricos. Si inyectamos clulas madre cultivadas de una raza de ratn en el interior de un embrin normal (blastocisto) de otra raza, dichas clulas madre pueden dar origen a cualquier tipo de tejido del adulto. Lo interesante aqu es que en algunos casos sirven de fuente para las clulas germinales (espermatozoides u vulos). Estos ratones en los que hay tejidos procedentes de dos razas distintas se denominan quimeras, y en algunas quimeras las clulas reproductivas proceden de las clulas madres introducidas en el blastocisto, de modo que su constitucin gentica se puede distinguir de la de las clulas somticas. Si manipulamos clulas madre por ingeniera gentica, y las transferimos a un blastocisto, podemos obtener ratones quimeras en los que parte de los tejidos estn alterados genticamente. Si las clulas madre manipuladas contribuyen a la lnea germinal, el rasgo gentico modificado en el ratn quimera se transmite a la descendencia, constituyndose entonces una lnea de ratones transgnicos. Los ratones transgnicos, incluidos los denominados K.O. (noquedados genticamente, es decir, con un gen mutante introducido por recomibinacin homloga) son actualmente una herramienta valiossima en biologa y en diseo de modelos de enfermedades humanas. Otras clulas madre: Clulas madre germinales (EG): se aislan de fetos, a partir de la cresta germinal, donde se est produciendo la diferenciacin de la lnea germinal. Clulas madre de adulto (AS): El caso paradigmtico es la clula madre hematopoytica (HSC), que genera todos los tipos de clulas sanguneas y del sistema inmunitario, y que reside en la mdula sea (aunque en la fase fetal se encuentra en hgago y bazo). 2. Clulas madre humanas
2.1 Clulas madre embrionarias y germinales En 1998 dos grupos informaron de la obtencin de clulas madre humanas, reproduciendo lo que ya se haba logrado en ratones: El trabajo de Thomson y colegas en la Universidad de Wisconsin, financiado por Geron: aislamiento y cultivo de clulas madre embrionarias (ES) a partir de blastocistos sobrantes procedentes de programas de FIV. El de Gearhart, en la Universidad John Hopkins obtuvo clulas madre germinales embrionarias (EG) a partir de fetos abortados. John Gearhart John Gearhart, de la Johns Hopkins University School of Medicine Las posibles aplicaciones de estas clulas madre embrionarias son: Estudios bsicos Diseo de nuevos medicamentos El uso que ms ha llamado la atencin sera el empleo de las clulas madre o sus derivados para terapias celulares o incluso reparacin de tejidos daados. Se ha calculado que se usaran embriones sobrantes de programas de FIV, en unos cuantos aos se podran establecer unas 1000 lneas distintas de clulas ES humanas. De los estudios realizados hasta ahora, parece incluso que la frecuencia de derivacin de ES humanas es alta (25-33%), superior a la de los ratones, especie en la que, adems, hay variaciones en la eficiencias de derivacin dependiendo de las razas. 2.2 Clulas madre de adulto En humanos se conoce desde hace aos, al igual que en ratones, la clula madre hematopoytica de adultos, que reside en la mdula sea y que da origen a toda las lneas de clulas sanguneas e inmunes. Aunque se conocen desde hace tiempo clulas madre en tejidos que, como la sangre o la epidermis, presentan gran tasa de proliferacin, solo recientemente se han descubierto clulas madre en rganos que normalmente tienen una baja tasa de renovacin, como es el caso del cerebro. As pues, la novedad ha consistido en reconocer la existencia de clulas madre pluripotentes en otros tejidos y rganos, y an ms interesante, que algunas de ellas presentan la suficiente flexibilidad como para generar clulas especializadas de otros linajes. Esto ha supuesto una sorpresa alentadora, ya que aumenta la perpectiva de obtener a largo y medio plazo terapias celulares, sin los problemas ticos asociados a destruir embriones para obtener clulas madre. 2.2.1 Biologa bsica de las clulas madre de adulto En modelos animales (mosca del vinagre, ratn) Patrones de diferenciacin, con marcadores moleculares (p.ej. patrones de molculas de superficie). Seales externas e internas: mltiples mecanismos de retroalimentacin y de interacciones recprocas entre clulas, dentro del nicho o hbitat que ocupan en el organismo. Aqu la investigacin bsica est desentraando las molculas que se envan unas clulas a otras, y cmo estos mensajes desde el exterior ponen en marcha una serie de factores de transcripcin para activar genes, cuyos productos ejercen una serie de efectos: reorganizaciones de orgnulos y macromolculas, divisiones simtricas y asimticas, diferenciaciones, etc. Controles intrnsecos: parece que las clulas disponen de relojes internos que de alguna manera les indican el nmero de veces que deben dividirse antes de diferenciarse totalmente. Sabemos an poco de esta faceta, pero se piensa que estn implicados varios mecanimos: Protenas promotoras e inhibidoras del ciclo celular Longitud del telmero: se ha propuesto que conforme la clula se especializa, va acortando sus telmeros, hasta que finalmente llega a la senescencia. De hecho, en la mayor parte de los tejidos adultos no se puede detectar actividad de telomerasa. Por el contrario, las clulas madre poseen telmeros largos y actividad telomerasa constitutiva (permanente). Controles externos: un complejo juego de seales de corto y largo alcance entre clulas madre, sus hijas, y las clulas vecinas: Factores secretados: los que se conocen mejor son los factores de la mdula sea, incluyendo numerosas citoquinas, que dirigen la maduracin, proliferacin y diferenciacin a los linajes mieloides y linfoides. Pero se estn estudiando otros sistemas como la diferenciacin de la cresta neural. Interacciones clula con clula, a travs de protenas integrales de membrana. Interacciones de las clulas con la matriz extracelular del tejido, por medio de receptores de membrana, como las integrinas. En muchos de estos casos, la seal externa que llega al receptor de membrana se transduce (reemite) al interior mediante una cascada de reacciones bioqumicas (con abundantes fosforilaciones y desfosforilaciones de protenas), para finalmente originarse una orden de activar o desactivar grupos de genes. Por lo tanto, la clula puede cambiar su patrn de expresin, lo que en determinados casos significa un paso ms en su ruta de diferenciacin, su proliferacin, o incluso puede significar la muerte celular programada (apoptosis). 2.2.2 Papel en la renovacin celular del organismo Se estn acumulando pruebas de que desde la vida perinatal a la adulta van apareciendo clulas madre en los tejidos somticos, como parte de la estrategia del organismo para su renovacin en condiciones fisiolgicas o ante un dao. Esto nos lleva a la conclusin aparentemente paradjica de que en realidad las clulas madre de adulto no son clulas primitivas derivadas directamente del embrin temprano, sino que seran clulas que aparecen tardamente, especializadas en suministrar clulas de repuesto al organismo adulto. Un descubrimiento de mediados de los 90 parece apoyar esto: existen clulas madre neuronales en el cerebro anterior de mamferos, rodeando al ventrculo lateral, y participan en la repoblacin de la subepndima del ventrculo tras irradiacin, y en los roedores son la fuente de nuevas neuronas que migran hasta el bulbo olfativo. Adems, en monos migran por una ruta desconocida hasta la corteza cerebral asociaciativa (la que contribuye a los mecanismos de memoria). La identidad exacta de las clulas madre neuronales est sometida a controversia, ya que algunos las localizan como clulas de la epndima que rodean a los ventrculos, mientras que otros las hacen coincidir con los astrocitos de la zona subventricular. Las clulas madre del sistema nervioso central (SNC) pueden generar los tres grandes tipos de clulas del cerebro adulto: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Pero desconocemos la importancia y significado real de estas clulas madre. Puede ser que en verdad el SNC del adulto mantenga una cierta capacidad de autorrenovacin, como rasgo adaptativo segn las especies. Quiz en los animales superiores la formacin local de nuevas neuronas en ciertas estructuras cerebrales tenga algo que ver con los mecanismos de creacin e integracin de la memoria. Adems, hace poco se han aportado pruebas de que los estmulos ambientales pueden intervenir en la regulacin de la formacin de neuronas. Las clulas madre mesenquimales (MSC) humanas estn presentes en el estroma de la mdula sea, constituyendo una poblacin totalmente diferente de las clulas madre hematopoyticas, y su papel es contribuir a la regeneracin de los tejidos mesenquimticos (hueso, cartlago, msculo, ligamento, tendn, tejido adiposo y estroma). Se han aislado y cultivado MSC humanas, y lo que es mejor, se ha logrado su diferenciacin controlada hasta clulas con rasgos tpicos de osteocitos, condrocitos o adipocitos, respectivamente. 2.2.3 La plasticidad de las clulas madre de adultos (transdiferenciacin) En los ltimos aos se estn acumulando informes que parecen confirmar una idea hasta ahora sorprendente: el que clulas madre o precursoras de un linaje, cuando se trasplantan en individuos receptores, puedan dar origen a clulas de otros linajes. Esto pone en cuestin la imagen hasta ahora asentada de que el potencial de desarrollo de las clulas madre de un tejido estaba restringido a las clulas diferenciadas del tejido en el que residen. Clulas cerebrales que dan lnea sangunea: ratones irradiados subletalmente (para destruir su lnea hematopoytica) fueron inyectados sistmicamente con clulas madre neurales marcadas genticamente (gen lacZ). A partir de estos trasplantes, los ratones produjeron clulas sanguneas de los dos sublinajes: mieloide y linfoide, as como clulas hematopoyticas inmaduras. Clulas de la mdula sea contribuyeron a nuevas clulas de microgla y astrogla en varias zonas del cerebro, cuando se inyectaron en circulacin de ratones adultos irradiados. Clulas madre neurales de ratones y de humanos pueden convertirse en clulas musculares esquelticas. Clulas de mdula sea como origen de clulas hepticas: El grupo de Petersen (usando ratones) hizo transplantes de mdula sea de machos a hembras singnicas (para seguir la pista usando el gen sry del cromosoma Y como marcador), y da los hgados de los receptores para estimular su regeneracin. Aparecieron clulas ovales hepticas procedentes del donante, lo que sugera que en la mdula sea existen clulas madre con potencialidad de generar clulas epiteliales del hgado. Dando un paso ms, el grupo de Theise hizo trasplantes parecidos, pero sin daar el hgado, y se detectaron hepatocitos derivados del donante, lo que significa que en la mdula sea existe alguna clula madre que en circunstancias normales puede contribuir a la renovacin de los hepatocitos (siendo quiz las clulas los intermediarios). Clulas madre mesenquimticas (MSC) del estroma de la mdula sea pueden originar clulas de linajes no mesenquimatosos: cuando se inyectan en ventrculos laterales de ratones neonatos, se diferencian en astrocitos. Catherine Verfaillie est estudiando esta versatilidad de diferenciacin. En nios, pero incluso en adultos (45-50 aos) pueden originar clulas cerebrales, precursores de hepatocitos y las tres clases de msculo (esqueltico, cardaco y liso). Aunque an no han encontrado un marcador molecular, se sabe que presentan rasgos intermedios entre las ES embrionarias y otras clulas madre de adulto: A semejanza de las ES, se dividen repetidamente en cultivo, aparentemente sin hacerse senescentes. Exhiben marcadores moleculares similares a las ES. A diferencia de las ES no se diferencian espontneamente, ni inducen teratomas (mayor seguridad). Hay que aplicarles molculas para que se diferencien. Y esto est muy bien de cara a posibles terapias. Clulas satlite de msculo esqueltico de ratn pueden repoblar la sangre y rescatar a ratones irradiados. En otra vuelta de tuerca, las cosas parecen funcionar tambin en el sentido inverso: clulas hematopoyticas que generan clulas musculares. La infusin de clulas madre de mdula sea a ratones distrficos cuya mdula sea haba sido destruida conduca a clulas que migraban a msculo, donde producan distrofina, restaurando parte de la funcin muscular. Como hemos visto, una clula madre neuronal (ectodermo) puede dar lugar a linaje sanguneo (mesodermo); o clulas madre de la mdula sea (mesodermo) pueden originar clulas hepticas (endodermo). Esto ha sido otra autntica sorpresa porque pone en entredicho un dogma asentado de la embriologa, el que dice que el destino de una clula queda sellado cuando entra a formar parte de una de esas capas embrionarias.
Hay que ser moderado a la hora de sacar conclusiones de todo estos experimentos, especialmente de su relevancia en relacin a posibles terapias. Puede que el microambiente del adulto, sobre todo en los casos de experimentos con ratones daados (irradiados, con degeneracin muscular) sea especialmente apto para permitir a clulas madre de la mdula sea la suficiente flexibilidad fenotpica, incluida su diferenciacin en linajes relacionados con capas embrionarias distintas. Pero hay que distinguir entre el microambiente en una situacin fisiolgica, y el derivado de una patolgica, porque el primero puede que no sea adecuado para inducir los grandes cambios fenotpicos que vemos en el segundo. Por otro lado, el cultivo in vitro de clulas madre o de precursores comprometidos en determinados linajes puede que permita su desdiferenciacin y eventual re-diferenciacin hacia otros linajes. 3. Terapias con clulas madre El retrato robot de una buena clula madre para terapias celulares y trasplantes en humanos sera como sigue: Debera ser efectivamente pluripotente, idealmente que se pudiera generar cualquier tipo buscado de clula Debera ser inmortal, es decir, tener la capacidad de proliferar (autorrenovarse) indefinidamente Debera poseer un fenotipo estable, bien caracterizado desde el punto de vista molecular Debera carecer de potencial tumorignico Debera ser susceptible de manipulacin gentica, para permitir modificaciones genmicas precisas, incluyendo la introduccin de genes teraputicos. 3.1 Terapias celulares y trasplantes La esperanza teraputica principal que se tiene en las clulas madre es que se puedan emplear para terapias celulares y trasplantes de tejidos, sin los problemas actuales ligados a los aloinjertos: escasez de donantes histocompatibles, necesidad de administrar drogas inmunosupresoras (ciclosporina, corticoides) con sus efectos secundarios (riesgo de infecciones, de cncer, nefropatas, etc.). Lo ideal sera derivar tejido con la identidad histolgica del propio paciente para hacer autotrasplantes. Se est abriendo el campo de la Ingeniera Celular, que en definicin de Bernat Soria es un nuevo campo interdisciplinar que aplica los principios de la ingeniera y de las ciencias de la vida a la obtencin de sustitutos biolgicos para restaurar, mantener o mejorar la funcin tisular. 3.1.1 Perspectivas con las clulas madre embrionarias (ES) El uso que ms ha llamado la atencin sera el empleo de clulas diferenciadas a partir de clulas madre embrionarias para terapias celulares o incluso reparacin de tejidos daados. Una posibilidad sera tipificar muchas lneas diferentes de ES, con diferentes sistemas MHC (HLA), pero la diversidad de los haplotipos HLA es enorme. Una alternativa sera manipular por ingeniera gentica las ES para crear lneas con diferentes haplotipos del HLA, de manera que se obtuvieran bancos de clulas apropiados para diferentes receptores de trasplantes. De todas formas, aunque se lograran clulas con HLA similar al paciente, quedaran otros sistemas minoritarios de histocompatibilidad, cuya falta de concordancia con el paciente podra llevar a problemas no siempre controlables. En cambio, el potencial teraputico de las ES se pondra de manifiesto sobre todo empleando ES derivadas del propio paciente, ya que no habra problemas de rechazo de injertos: estaramos ante un autotrasplante. Pero cmo es posible esto en un individuo ya nacido, si por definicin estas clulas proceden de embriones? Aqu es donde entrara el mtodo de transferencia de ncleo de clula somtica (la llamada clonacin teraputica): el paciente suministra clulas somticas, se transfiere ncleo a ovocito desnucleado, se crea un embrin artificial (embrin somtico), hasta la fase de blastocisto; se toman las clulas de su masa interna, se cultivan como clulas madre, y finalmente se diferenciaran al tipo de clula o tejido para la terapia celular o el injerto, sin los problemas del rechazo (autotrasplante). Segn algunos, es muy probable que en las prximas dcadas seamos capaces de derivar clulas madre autlogas para todos los que las necesiten. El 21 de noviembre de 2001, la empresa ACT (Robert Lanza, Michael West en J. Regenerat. Med.) comunic que haba logrado la primera clonacin de un embrin humano mediante este sistema. Muy debatido cientficamente: 57 vulos maduros de 7 mujeres. Con la mitad, partenognesis. Slo lograron mantener 6 durante 7 das, pero sin clulas madre (NO es embrin). Otros 17 vulos fueron desnucleados, y se les transfiri ncleos de adulto. Slo 6 se dividieron hasta 4 o 6 clulas, y no progresaron. Embriones de verdad? Los cientficos del Instituto Roslin han propuesto a las autoridades britnicas un proyecto consistente en obtener bancos de clulas madre clonadas por transferencia de ncleos de clulas pluripotentes de cordn umbilical de los recin nacidos. Cada cultivo quedara conservado en previsin de la necesidad ulterior de diferenciarlo hacia tipos celulares requeridos para autotrasplantes del individuo donante. Pero los retos tcnicos de este enfoque son formidables, incluso dejando aparte los derivados de la transferencia de ncleos a ovocitos. Las clulas ES de ratn (y quiz las humanas) son tumorignicas: si se inyectan a un animal adulto originan teratomas y teratocarcinomas. Por lo tanto, un tema de seguridad ser asegurarse de que en un cultivo diferenciado a partir de ES no quedan estas clulas troncales, o bien disponer de mtodos fiables de separacin y purificacin de las clulas diferenciadas de inters respecto de las ES. Para ello habr que avanzar en estudios de marcadores (al estilo de los CD de las clulas inmunes) para caracterizar todas las fases intermedias de cada ruta de diferenciacin. En general, la obtencin de poblaciones celulares puras exige el empleo de tcnicas eficaces de seleccin clonal: p. ej., el uso del FACS (citmetro de flujo activado por fluorescencia, que discrimina poblaciones en funcin de marcadores de superficie). Alternativamente, marcadores genticos fcilmente seleccionables en el cultivo. Alternativamente, se puede introducir por ingeniera gentica en el genoma donante un bloque de genes que permita simultneamente la seleccin de las clulas diferenciadas y un sistema suicida que garantice la autodestruccin de las clulas que no se hayan diferenciado. Podremos forzar a las clulas madre embrionarias a diferenciarse en lneas celulares concretas? An tenemos una idea muy pobre de la biologa bsica de las seales y factores implicados en el desarrollo y diferenciacin del embrin humano, pero se espera que este campo avance con rapidez. Otras cuestiones de seguridad para asegurar la salud a largo plazo de las clulas a trasplantar. Hay que asegurar la no introduccin de mutaciones lesivas, que se pueden haber acumulado en el ncleo somtico donante durante la vida del individuo. Ser esencial garantizar que tales mutaciones no aumentan el potencial cancergeno. Igualmente est la muy debatida cuestin de la edad biolgica de las clulas. Mientras algunos informes hablan de mayor edad, otros dicen que el propio proceso de transferencia de ncleo somtico rejuvenece las clulas y estimula a la telomerasa. Habr que aclarar la eventual implicacin de las alteraciones de la impronta gentica (imprinting) sobre las clulas ES y sus derivadas, logradas tras transferencia nuclear. 3.1.2 Perspectivas con clulas madre de adultos Ya anteriormente hemos repasado algunos casos recientes que demuestran la flexibilidad inesperada de clulas madre de adultos para diferenciarse incluso en lneas que no son las suyas originales. Obviamente, si se confirman estos datos, y se avanza en esta lnea, tendramos una nueva posibilidad de terapias celulares y autotrasplantes, sin el problema tico de manipular y destruir embriones humanos, aunque sean artificiales (por transferencia de ncleo somtico a ovocitos). (Ir a artculo sobre los aspectos ticos del uso de embriones humanos en experimentacin) 3.1.3 Reprogramacin directa de clulas somticas? Una de las grandes aspiraciones de los estudios sobre el desarrollo embrionario y las clulas madre es la de desprogramar y reprogramar a placer clulas somticas, sin necesidad de acudir a la transferencia de ncleos a ovocitos (con la consiguiente destruccin de embriones). Quiz una vez que conozcamos en detalle lo que ocurre in vivo, seamos capaces de convencer a ciertas clulas somticas de comportarse como clulas pluripotentes y despus encarrilarlas hacia los tipos celulares deseados. 3.1.4 Algunos ejemplos de terapias experimentales con clulas madre Cerebro Como dijimos, an tenemos que aclarar el debate sobre la identidad y localizacin de las clulas madre neuronales. Neuronas funcionales dopaminrgicas y serotoninrgicas a partir de ES de ratn. Se ha logrrado el trasplante de clulas pluripotentes del mesencfalo en ratas parkinsonianas, que experimentaron una recuperacin transitoria. A partir del telencfalo de fetos se han aislado clones de clulas madre neuronales, que se han logrado diferenciar en los principales linajes neurales. Se han trasplantado en zonas germinales de ratones neonatos, y all participaron en desarrollo normal, incluyendo migracin por rutas establecidas para diseminarse a regiones del SNC. En 2001, un equipo del Medical College de Nueva York logr en ratones infartados la reparacin del 68% del tejido cardiaco, con una recuperacin funcional parcial. Se originaron clulas de varios tipos esenciales: msculo esqueltico, endotelio y msculo liso. Pncreas: Estudios de Bernat Soria (Universidad Miguel Hernndez de Elche): clulas secretoras de insulina a partir de clulas ES de ratn. Curacin tras ms de un ao de ratones diabticos. Grupo de Amon Peck (Universidad de Florida): reversin de diabetes en ratones NOD (diabticos no obesos) por trasplante de islotes de Langerhans generados a partir de clulas madre del pncreas. En junio de 2000 un grupo de la Universidad de California en San Diego anunci que haba reactivado la produccin de insulina en clulas beta crecidas a partir de lneas inmortales. Equipo de Susan Bonner-Weir: cultivo de clulas de islotes humanos a partir de clulas del ducto pancretico. Hgado: Ya aludimos a las clulas madre de hepatocitos que parecen residir en la mdula sea. Un reciente informe en ratones logr usar con xito trasplantes de mdula sea para corregir tirosinemia, como modelo de enfermedad heptica. Hay ejemplos de clulas pancreticas que se diferencian a hepatocitos. Corazn: La empresa Geron ha comprobado que clulas madre embrionarias humanas pueden originar cardiomiocitos. Pero todava no se han encontrado clulas madre en el propio corazn. En 2001 un equipo del Medical College de Nueva York comunic en ratn la reparacin del 68% del tejido cardiaco de corazones infartados, inyectando directamente clulas madre de la mdula sea. Se regener msculo estriado, y vasos (endotelio y musculatura lisa). Recuperacin de parte de la funcin cardiaca. Otros ejemplos: Un equipo de la Universidad John Hopkins demostr que una sola clula madre hematopoytica de ratn poda desarrollarse en clulas epiteliales de diferentes rganos, incluyendo intestinos, pulmn y piel. A los 11 meses de los trasplantes el pulmn tena un 20% de clulas diferenciadas a partir de la clula madre. Estos ejemplos son alentadores, pero no eliminan totalmente la cuestin del uso de las clulas embrionarias: No se han aislado clulas pluripotentes de ciertos rganos, como es el caso del corazn. Puede que haya tejidos y rganos de los que no podamos disponer de clulas madre, por lo que tcnicamente tendramos que volver a pensar en las ES por clonacin teraputica. Las clulas madre embrionarias son ideales para realizar terapia gnica, que ser necesaria para curar ciertas patologas. Lo veremos a continuacin. 3.2 Clulas madre para terapia gnica somtica En algunas enfermedades no bastar con realizar autotrasplantes, sino que habr que corregir defectos genticos. Las clulas madre embrionarias de ratn (y quiz las humanas), son excelentes para manipulacin gentica, y pueden realizar recombinacin homloga, por lo que se podra ensayar incluso terapia gnica sustitutiva, reemplazando genes anmalos por versiones correctas. Imaginemos el caso de un paciente aquejado de anemia falciforme o talasemia (enfermedades genticas que afectan a la hemoglobina). Se realiza la transferencia de ncleo somtico a vulos, se desarrolla el blastocisto artificial, se aislan las clulas madre y se manipulan por ingeniera gentica para corregir el defecto. Una vez asegurados de que el gen se ha insertado correctamente (por recombinacin homloga) y se puede expresar, se induce la diferenciacin de las ES hasta clulas sanguneas o sus precursores pluripotentes, que podran recolonizar la mdula sea, y se curara la enfermedad de modo permante. Tambin se puede intentar la manipulacin gentica de clulas madre no embrionarias: clulas madre neuronales de fetos humanos fueron manipuladas genticamente, y demostraron su capacidad de secretar productos teraputicos, por lo que muestran un potencial para corregir defectos metablicos en neuronas y gla. 4. Hacia la reconstruccin de rganos y tejidos? Como vimos anteriormente, la terapia en principio ms inmediata de los cultivos de clulas madre ser el trasplante de poblaciones clulares al propio individuo donante. Pero para conseguir el autntico potencial teraputico de esta tecnologa habra que lograr reconstruir tejidos ms complejos e incluso rganos o algunas de sus partes, con plena funcionalidad. Aqu se presentan nuevos problemas de otro tipo, que podramos englobar bajo el epgrafe de ingeniera de tejidos y rganos, pero que an quedan relativamente lejos de las posibilidades actuales. De todas formas, repasaremos algunos avances recientes que en un futuro podran combinarse con las estrategias de las clulas madre. En una situacin relativamente sencilla de este enfoque se encuentran las tecnologas de clulas encapsuladas, por la que las clulas teraputicas se separan del resto del organismo por una membrana sinttica con permeabilidad selectiva, de modo que suministra proteccin al trasplante, al tiempo que permite el intercambio de nutrientes, oxgeno y seales moleculares, y la liberacin de las sustancias teraputicas. Las clulas se pueden manipular genticamente previamente para garantizar la secrecin de la sustancia teraputica. Se est intentando con clulas secretoras de insulina (para la diabetes), con clulas cromafines (tratamiento del dolor crnico), con clulas secretoras de hormona de crecimiento (para enanismo), etc. Igualmente existen intentos de expresar protenas antiangiognicas contra el cncer (endostatina) en clulas inmovilizadas en matrices de alginato. En cuanto a regeneracin de rganos, uno de los puntos clave es lograr estructuras organizadas tridimensionalmente, donde las distintas clulas adquieran posiciones adecuadas para intercomunicarse entre s y con otras partes del organismo. Para ello se intenta disponer de andamios tridimensionales que sirvan para dar forma y consistencia, y para alojar adecuadamente a las clulas: Prtesis seas biolgicas, a base de combinaciones de clulas, sustancias bioactivas y matrices tridimensionales de soporte que imitan el hueso natural: Un grupo ha demostrado la importancia de las interacciones celulares tridimensionales y de la densidad celular para producir tejidos de tipo seo. Se logr la agregacin de precursores seos sometiendo a clulas osteognicas, procedentes de cultivo, al factor TGF-b1, lo que a su vez desencaden la produccin de protenas especficas del hueso y la formacin de microespculas cristalinas maduras con tejido seo humano organizado. Otro grupo ha usado una combinacin de trozos de coral (una cermica natural de carbonato clcico) con clulas madre mesenquimales para generar implantes ortopdicos que lograron curacin al menos parcial de lesiones seas en ovejas. Al cabo de varios meses tras la implantacin, estos composites de coral se haban remodelado como huesos maduros, e incluso haban logrado su fusin completa con el hueso nativo. Parece ser que parte del xito se debe a que el coral suministra una matriz porosa tridimensional reabsorbible, que permite la infiltracin y organizacin de las clulas repobladoras. La ventaja de usar clulas madre mesenquimales es que son fciles de aislar de la mdula sea, y puede inducirse su diferenciacin en osteoblastos tratndolas con factores como dexametasona, BPM (protenas morfogenticas seas) o vitamina C. Anteriormente las aproximaciones se haban basado en matrices tridimensionales de polisteres degradables o de cermicas de hidroxiapatita, que se repoblaban con clulas de mdula sea o tejido del periostio, y se mantenan en cultivo durante varios das antes de su implantacin. Reconstruccin de vejiga urinaria de perros: se aislaron clulas de msculo liso del exterior y clulas uroteliales del interior de la pared de la vejiga, se multiplicaron in vitro, y se sembraron respectivamente en la superficie exterior e interior de un tejido de polister con forma de vejiga; la construccin resultante se nutri durante 7 das en un medio estril, y se implant en perros que carecan de la mayor parte de su vejiga. Esta neo-vejiga funcion de modo notablemente similar a la natural al menos durante un ao, demostrando estabilidad en el volumen de orina y resistencia adecuada. A los tres meses del trasplante los polmeros haban desaparecido, y la vejiga haba desarrollado vasos sanguneos y alguna inervacin. A microscopio, la histologa de la neovejiga era notablemente parecida a la natural, con capas de msculo liso y urotelio patentes. Este trabajo supone un avance respecto de anteriores en los que se intentaba trasplantar solo clulas de musculatura lisa sobre matrices de colgeno, y en los que al cabo del tiempo las clulas se transformaban en miofibroblastos. Quiz el xito se deba de nuevo a que en este caso las clulas musculares pueden dialogar (con xido ntrico?) con otras clulas, sobre todo las uroteliales, al estilo de lo que pasa en la intercomunicacin entre clulas musculares lisas y clulas endoteliales. Un equipo del MIT ha obtenido arterias funcionales artificiales, usando como andamiaje un polmero de poligliclico. El polmero, con forma de tubo, serva para cebar el anclaje de clulas de musculatura lisa de vacas, y se conect a un sistema de perfusin pulstil que imitaba la frecuencia de pulso de la arteria embrionaria (165 pulsos/min). Tras 8 semanas, se cubri el interior con clulas endoteliales. El pulso favoreca la produccin de colgeno, de modo que las paredes del vaso eran relativamente gruesas (aunque no tanto como en los vasos naturales) y resistentes. Resistan fuerzas de ruptura, aguantaban suturas, y mostraban respuestas contrctiles ante agentes farmacolgicos. Adems, se comprob que contenan clulas de musculatura lisa. Estas arterias artificiales se implantaron en cerdos (sustituyendo a porciones de arterias de las patas), y aguantaron ms de tres semanas sin obstruirse. Lograr rganos macizos como el rin y el hgado, constituye el Santo Grial de la bioingeniera. Est claro que an estamos en la primera infancia de la ingeniera de tejidos y rganos. El reto futuro ser no solo derivar clulas diferenciadas a partir de clulas madre, sino lograr estructuras funcionales, con su vasculatura y su inervacin. De nuevo en el MIT ha habido un avance hacia algo parecido a un hgado artificial: usando una tcnica de impresin en tres dimensiones (3DP) originalmente pensada para piezas metlicas, este equipo logr estructuras compuestas de varias lminas de polmero (polilctido y poligliclido) que contenan canales internos de 300 micrometros. Los investigadores sembraron esta matriz con clulas endoteliales y de hgado de rata, y perfundieron medio nutritivo durante 5 semanas, con lo que lograron que las clulas se organizaran en estructuras microscpicas semejantes a las del hgado, y que produjeran albmina. Los primeros tejidos artificiales aprobados en los EEUU para uso clnico son derivados de piel y de cartlago. El TransCyte de la empresa Advanced Tissue Sciences es un sustituto de piel hecho con clulas de la dermis sobre un polmero biodegradable, y que se puede usar como cubierta protectora temporal en quemaduras de 2 y 3 grado. La misma empresa tiene en fase de ensayos clnicos otro producto, el Dermagraft, previsto para el tratamiento de las lceras en los pies de los diabticos. Se fabrica sembrando fibroblastos de dermis humana sobre un andamio sinttico de material bioabsorbible. Las clulas se estimulan y producen colgeno, protenas estructurales y factores de crecimiento. El Apligraf de la empresa Organogenesis consta de dermis y epidermis, y se ha aprobado para tratar lceras de piernas que no curan espontneamente, como las de los diabticos. Consta de una capa de clulas drmicas y epidrmicas obtenidas a partir del prepucio en la circuncisin. Carticel, de Genzyme Corporation, se ha aprobado para reemplazar cartlago daado de la rodilla. La empresa toma condrocitos a partir del paciente y los hace crecer en una matriz biodegradable, implantndose en la rodilla del enfermo. Otra empresa, Curis, est desarrollando el Chondrogel, que es una mezcla inyectable de condrocitos autlogos y de polmero de hidrogel. Su indicacin sera el tratamiento del reflujo vesicouretral, un defecto congnito de la vejiga urinaria de nios, y la incontinencia por estrs en las mujeres.