BASES MOLECULARES DE LA ENFERMEDAD

PROGRAMA TERICO
Tema 1.- Causas de la enfermedad. Desordenes genticos: patrones de herencia. Repaso de
la estructura y organizacin del genoma humano. Mapas genmicos.
Tema 2.- Tcnicas de anlisis molecular para alteraciones metablicas y para alteraciones
genticas. Tcnicas de diagnstico basadas en hibridacin de cidos nucleicos. Mtodos basados
en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Tema 3.- Alteraciones en la estructura de protenas no enzimticas. Hemoglobinopatas.
Talasemias. Distrofias musculares ligadas al cromosoma X. Sndrome de Marfn.
Tema 4.- Enfermedades neuropsiquiatricas producidas por expansin de tripletes: Sndrome
del cromosoma X frgil. Enfermedad de Huntington.
Tema 5.- Alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos. Desrdenes del metabolismo
de la fructosa. Desrdenes del metabolismo de la galactosa. Anemias hemolticas enzimopticas.
Desrdenes del metabolismo del glucgeno.
Tema 6.- Alteraciones en el metabolismo de los lpidos. Deficiencias de acil-CoA
deshidrogenasa. Hiperlipoproteinemias. Enfermedades lisosmicas: esfingolipidosis.
Tema 7.- Alteraciones asociadas a la proteolisis. Proteasas y cncer. Proteasas y
envejecimiento. Proteasas y procesos inflamatorios.
Tema 8.- Alteraciones en el metabolismo del nitrgeno I. Errores congnitos en el
catabolismo de aminocidos. Fenilcetonuria clsica.
Tema 9.- Alteraciones en el metabolismo del nitrgeno II. Errores congnitos en el
metabolismo de las bases pricas y pirimidnicas. Hiperuricemias.
PRCTICAS
1.- Anlisis bioqumico de enfermedades metablicas: Fenilcetonuria clsica.
2.- Anlisis molecular de delecin de exones mediante PCR.
3.- Deteccin de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa.
ENLACES WEB
http://www.biopsicologia.net/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/


TEMA 1: INTRODUCCIN
La patologa es el estudio de la enfermedad. La enfermedad es la alteracin de cualquier
proceso normal con una serie de signos y sntomas.
1. Historia de la enfermedad
Antiguamente el documento ms antiguo es el cdigo Hammurabi (1750 a.C.) con una serie
de normas para los mdicos. Dice que la enfermedad es causada por la invasin del alma, brujera
y maldad por lo que sirve como juicio y castigo, por lo que el mdico debe determinar si la causa
de la enfermedad es divina o demonios, es decir, no era una Medicina racional.
Los egipcios s fueron algo ms racionales, Imhotep fue uno de los primeros arquitectos
(dise la Pirmide escalonada de Zoser, un faran), pero tambin fue mdico y se han
encontrado vestigios de empastes. La relevancia de Imhotep (2690 a.C.) se descubri a mediados
del siglo XIX, cuando se descubri un papiro en tebas del 1700 a.C. (mil aos despus de Imhotep)
donde se recogen 48 casos clnicos de soldados. Deca por ejemplo cmo administrar opiceos,
cmo suturar heridas, tomar el pulso, cmo presionar la cartida para aliviar dolores de cabeza
Slo en uno de los casos hablaba de una especie de brujera.
Hipcrates en el 400 a.C. escribi el Corpus hippocaticum, de 50 libros, y en uno de ellos,
Sobre la enfermedad sagrada, dijo que la enfermedad no tena una base sobrenatural, sino natural.
Hipcrates destac la existencia de 4 humores (flema, sangre, bilis negra y bilis amarilla) y el
desequilibrio entre ellos es el que dara una serie de problemas.
Galeno asoci los humores a los estados de nimo.
Se conceban las enfermedades como un desbalance de cuatro cosas. Hablaban de los cuatro
elementos bsicos (fuego, aire, agua y tierra), los cuatro estados de la materia (fro, caliente,
hmedo y seco), los cuatro humores
En los siglos XVI y XVII, durante el Renacimiento se produjo una Revolucin Cientfica. En
1543 se public la obra de Coprnico sobre los astros y otra sobre Vesalio sobre la estructura del
cuero humano. Adems en 1628 Harvey public una obra sobre la circulacin sangunea,
descartando la hiptesis de Galeno de que la sangre naca en el hgado y mora en los tejidos.
El descubrimiento del microscopio fue bsico para conocer las alteraciones de "lo normal",
porque hasta entonces exista el lmite del ojo humano (0,1 mm). El trmino ptica se describi
por Euclides en 300 a.C.; en el XVI se descubri el microscopio por Jansen y Galileo. Malpighi
describi terminologa microanatmica. Hooke descubri en 1665 su Micrographia y describi las
clulas, como celdillas por su aproximacin al corcho. Van Leewenhoek utiliz el microscopio para
describir las telas porque era comerciante y describi seres vivos pequeos.
En tiempos ms actuales vemos una gran conjugacin en el ao 1950 de tres disciplinas, la
bioqumica, la gentica y la biologa celular, gracias a la invencin del microscopio electrnico,
para observar qu hay dentro de las clulas, y en muy poco tiempo hay una serie de aportaciones
valiossimas.
Incluso hasta 1960 se crea que las protenas eran portadoras de la informacin gentica.
Protena proviene de Proteus, un Dios, o de protios, lo primero, lo ms abundante, lo principal,
porque las protenas estaban en todas partes.
El DNA lo descubri Meischer en 1870 y lo llam nuclena y no se le dio ms importancia. Sin
embargo los estudios de Chase establecieron que era el DNA quien traspasaba la informacin
gentica, porque trabajaban con fagos marcados por fsforo radiactivo (el DNA) y azufre
radiactivo (en protenas), y vio cmo el fsforo era lo que se quedaba dentro de las clulas hijas.
Watson y Crick se aprovecharon de los descubrimientos de Rosalind Franklin quien descubri los
patrones de difraccin de Rayos X. Desde entonces hubo una carrera para descubrir y descodificar
la informacin del DNA.
Actualmente la enfermedad se distingue a nivel celular, tisular, bioqumico y tambin
molecular. Lo que se buscar actualmente no son genes sino mutaciones en dichos genes que nos
permitan conocer las causas de las enfermedades.
Aproximadamente un 30% de las enfermedades estn influidas por genes, se conocen unas
7000 enfermedades con base gentica.
La patologa molecular es el estudio de las enfermedades producidas por alteraciones en las
molculas. Como las protenas son las molculas funcionalmente ms importantes, estudia
enfermedades provocadas por alteraciones en las protenas causadas por mutaciones en los genes
que las codifican. En esto se basa la Medicina Molecular
2. Genoma humano
Cada clula contiene 3000 millones de bases, y mide dos metros si se extendiera. Hay unos
25000 genes (esto est cambiando porque cambia la definicin de gen, como veremos ms
adelante).
El gen ms grande es el de la distrofina (2,4 millones de bases). El cromosoma con mayor
nmero de genes es el primero con 2968 y el que menos el Y, con 231 genes. Entre dos personas
el 99,9% del material gentico es diferente, se estiman que aproximadamente difieren unos tres
millones de bases diferentes.
En el ao 2001 se saba que el 3% del DNA es codificante y se consideraba que el 97% es
"DNA basura" que adems es una mala traduccin del ingls, que en realidad es DNA trastero.
Actualmente todo esto ha cambiado con los ltimos estudios.
Hay otras palabras con el sufijo "oma" (proteoma, metaboloma), que consiste no en ver
protenas individuales sino el proteoma, el conjunto de protenas de una clula.




Lo primero que debemos diferenciar es el DNA mitocondrial, que en proporcin es muy poco,
slo el 0,0005%, y slo son 37 genes, pero es muy importante para la funcin celular.
En el ncleo hay 3200 millones de pares de bases. Lo diferenciamos en DNA repetitivo (30%)
y el DNA simple/de copia nica/no repetitivo, que es el 70%.
Pero del simple slo un 10% son genes (codificante) y el otro 60% es no codificante,
que no produce protena por tanto. El codificante consiste puede ser estructural
(exones) o controlar la expresin del propio genoma codificante. Este 10% es el que
se dice que vale, y que el otro es basura, porque es el que llega a ser protenas.
En cambio el DNA simple no codificante (60%) son intrones, que se encuentran entre
los exones.
Dentro del DNA repetitivo un 10% es codificante (puede ser DNA en tndem, es decir,
seguidos, como las globulinas, o disperso, una en un cromosoma y otro en otra,
como el gen de la aldolasa. Y en el DNA no codificante (20%) tenemos tambin el
agrupado (que es el DNA satlite, centrmeros y telmeros) y el DNA disperso (que
no vamos a entra mucho en ellos, y son LINEs, SINEs...).
Ahora vamos a hablar un poco de cada grupo para ir descartando eso que se dice que es
DNA basura, que es todo aqul que no llega a convertirse en protenas.
Por tanto, en este DNA basura se incluira todo aquel DNA que no llega a ser traducido a
protenas, pero que s se transcribe a RNA no mensajero, como el tRNA (que es imprescindible
para la traduccin) o el rRNA (forma parte de los ribosomas). En conjunto a todos estos RNA se les
llama ncRNA (non coding RNA), de los que hay muchos ms grupos:

DNA SIMPLE NO CODIFICANTE
Todos estos ncRNA tienen una funcin biolgica, aunque en muchos casos sea desconocida
o poco clara.
Por ejemplo, los miRNA (microRNA) tienen como funcin la regulacin de la expresin gnica,
porque tienen una secuencia complementaria al mRNA y por tanto se une al mismo haciendo que
la clula reconozca RNA de doble hebra, que es destruido. Esta expresin de miRNA tiene lugar
una vez se ha expresado el mRNA, y la clula, mediante una serie de vas intracelulares promueve
la expresin de estos miRNAs. El exceso o el defecto de estos miRNA provocan una serie de
patologas, muchas de ellas relacionadas con el cncer, pero no todas ellas.
Hay muchos otros tipos pero no hace falta conocer la funcin de cada uno de ellos.
Tambin se incluye en este DNA los intrones, que se transcriben y despus sufren una
eliminacin durante el splicing, cuyos diferentes patrones puede dar lugar a productos finales
diferentes tambin.
DNA REPETITIVO CODIFICANTE
Habamos dicho que podamos distinguir el que se encuentra en tndem del que se
encuentra disperso.
-Disperso: un ejemplo es el gen de la aldolasa, que es un enzima de la gluclisis que tiene
varios genes en diferentes cromosomas (en el 16, 9 y 17, generando diferentes isoenzimas, la
aldolasa A, aldolasa B, y aldolasa C, respectivamente), que se deben a que no en todos los tejidos
hace falta el enzima con la misma funcin. Pero es que adems existen lo que se denominan
pseudogenes, dos, en los cromosomas 3 y 10, con una secuencia muy parecida a los anteriores, lo
suficiente como para considerarse que codificaran lo mismo, pero que se llama pseudogn
porque no da producto final (protena), al tener un codn de STOP, que impide la finalizacin de la
traduccin. Pero estos mRNA de pseudogenes sirven para que el gen sirva traducindose y no se
elimine por los miRNA, son una especie de seuelos.
Otro ejemplo sera el gen PTEN, en el que existe el pseudogn PTENP1, que tambin sirve
para que PTEN siga expresndose. Recordar que PTEN inhibe una va de proliferacin celular.
-Agrupado/en tndem: es el ejemplo de las familias multignicas, como el de las globinas,
que se encuentran en un nicho/cluster cromosmico, que veremos en profundidad en el tema 2.

Los genes que empiezan por Psi son pseudogenes de las globinas.
Es importante destacar que existen 19.000 pseudogenes descritos, casi tantos como genes,
por lo que deben tener funciones importantes.
Existen dos teoras de generacin de pseudogenes, por duplicacin de un gen normal, que, al
no copiar la secuencia promotora no se expresa, otra teora es que se produce cDNA (DNA
complementario) por retrotranscripcin desde un RNA y se inserta en el DNA genmico, pero al
carecer de intrones y promotores no se expresa.

Finalmente, el proyecto ENCODE (ENcyclopedia of DNA Elements), que analiza
exhaustivamente tanto el DNA genmico codificante como el no codificante, estableci que el 80%
es biolgicamente activo. El concepto de gen ha cambiado, desde una visin tradicional a la visin
ENCODE.
DNA REPETITIVO NO CODIFICANTE EN TNDEM
-DNA satlite: est formado por la repeticin de una secuencia de DNA miles de veces en
tndem desde 100Kb hasta varias megabases. Hay varios satlites como el DNA satlite 3 cuya
secuencia repetida es ATTCC, que se repite en el 9 y en el Y. Hay muchos tipos de satlites.
-DNA minisatlite: estos son ms pequeos, se repiten entre 100 nucletidos y 20Kb
secuenciasd e 6-25 nucletidos. El 90% estn en los telmeros. Cuando se van dividiendo cada
clula se van acortando los telmeros poco a poco hasta que desaparecen y entonces los genes
quedan expuestos y la clula sufre apoptosis. Existe un enzima, la telomerasa, que aade
secuencias telomricas para que no se acorte el telmero y la clula pueda seguir dividindose,
esto es bueno en clulas madre, pero en todas las clulas tumorales hay telomerasas que
convierten a las clulas en tumorales.

La telomerasa reconoce una secuencia final cromosmica (TTG) a la que se une y un RNA en
el interior del enzima hace que se aadan nucletidos hasta completarlo, entonces se desplaza y
vuelve a comenzar el proceso.
-DNA microsatlite: se repiten hasta unos 150 nucletidos secuencias de 2, 3 o 4 nucletidos.
Se utilizan para pruebas de paternidad, actualmente se utilizan hasta 17 microsatlites, de forma
que hay una probabilidad muy muy baja de que coincidan dos individuos. La mayor parte de esta
variabilidad se debe a variaciones de un nucletido (SNP: single nucleotide polymorphism).
Estos cambios no son mutaciones, se denominan polimorfismos, consiste en la presencia de
mltiples alelos de un locus. Un locus polimrfico es aquel locus cromosmico que posee
mltiples alelos y para el que al menos el 2% de la poblacin es heterocigota.
De medio hay un 6% de genes heterocigotos en un individuo y un gen tiene un 16-18% de
individuos con ambos alelos distintos, es decir, heterocigotos. En el DNA genmico humano de
media hay una heterocigosis cada 300 pares de bases. Entre dos humanos se cree que hay un
milln de pares de bases diferentes.
Hay varios conceptos relacionados con el polimorfismo gentico:
RFLP (restriction fragment length polymorphisms): secuencias de DNA reconocidas
por enzimas de restriccin/endonucleasas de restriccin.
VNTR (variable tandem repeats): localizacin en un genoma donde una secuencia de
nucletidos de 9-100 pares de bases se repite una serie de veces, en general menos
de 1000.
STR (short tandem repeats): repeticiones de secuencasi de 1-8 pares de bases.
SNP (single-nucleotide polymorphisms): variaciones de un nucletido
Los RFLP son segmentos genmicos reconocidos por enzimas de restriccin/endonucleasas
de restriccin, que las poseen las bacterias y que son secuencias en general palindrmicas que
reconocen y cortan, por ejemplo GAATTC, cuya secuencia complementaria es CTTAAG. Para
proteger su propio genoma metilan estas secuencias para que no sean reconocidas. En cambio un
fago que ataque estas bacterias s actan sobre su material gentico, impidiendo que el fago
infecte la bacteria.
3. Estrategias para el aislamiento de genes responsables de enfermedades
Hay dos formas posibles: la clonacin funcional y la clonacin posicional.
Clonacin funcional: ocurre si conocemos la funcin del gen, en cuyo caso slo hay que
purificar la protena asociada y a partir de ella se consigue el cDNA (DNA complementario) a partir
de genotecas. De esta forma se descubri la secuencia de genes que provocaban enfermedades
como talasemia, anemia falciforme, fenilcetonuria, enfermedad de Tay-Sachs
Clonacin posicional: se realiza si no conocemos la funcin del gen ni la patognesis de la
enfermedad, en cuyo caso debe realizarse lo que se conoce como cerco al gen, que consiste en
utilizar marcadores genticos en familias grandes con la enfermedad y ver en cules hay
recombinacin y en cules no.
Un marcador gentico es un segmento de DNA con una ubicacin fsica identificable en un
cromosoma (locus) y cuya herencia gentica mendeliana se puede rastrear. Algunos marcadores
utilizados eran los de grupos sanguneos (20 loci aprox.) hasta 1960, pero a partir de entonces se
han descrito muchos otros que existen en mayor cantidad para que la seguridad de posicionar al
gen sea lo ms exacta posible, como minisatlites o microsatlites (ms de 10000 loci),
actualmente se utilizan incluso SNPs (polimorfismos de nucletido simple) que existen millones.
Por ejemplo, si utilizamos el marcador A y el B y vemos que en los descendientes el A
siempre se asocia a la enfermedad y que el B no esto indica que el B se ha recombinado o que no
est ni siquiera en el mismo cromosoma que el gen mutado. En cambio si A no se recombina y
siempre est ligado a la enfermedad eso significa que est prximo al gen mutado y que por lo
tanto se produce ligamiento, ambos
genes estn tan cerca que en la formacin
de gametos siempre estn ligados, no
sufren recombinacin. Los marcadores
genticos pierden valor si estn alejados
del gen porque hay mayor probabilidad
de ligamiento. 1 centimorgan es la
medida de la proximidad entre dos genes,
se define como la distancia entre 2
marcadores que sufren recombinacin en
el 1% de meiosis, mide la capacidad de
recombinacin de dos marcadores.
En el ejemplo de la derecha Dd sera
el gen y Mm el marcador. Ver como slo
en B), cuando estn cerca, no se forman
cromosomas recombinantes.
Una vez vistos que marcadores estn ms cerca del gen (porque estn ms ligados)
mediante tcnicas de mapeo genmico se posiciona el gen.
De esta forma se han descubierto la base molecular de muchas enfermedades como fibrosis
qustica, distrofia muscular de Duchenne, neurofibromatosis tipo I

De todas formas antes de analizar el ligamiento o identificar la protena hay que analizar el
modo de herencia, que debe ser Mendeliano, en caso de que la enfermedad se deba a
polimorfismos no se pueden identificar genes. En cualquier caso, tras la identificacin del gen por
cualquiera de los dos mtodos, debe realizarse una validacin funcional, experimentando en una
rata se coloca esa misma mutacin para ver si la clnica es parecida, es decir, si realmente es el gen
correcto.
En resumen, para buscar los marcadores vamos un poco a ciegas, se eligen primero
mltiples marcadores y los que menos recombinen son los que ms cerca estn del gen.
Los linajes incompletos se analizan estadsticamente para descartar que los resultados se
hayan obtenido por azar.
El LOD score es una forma de darle un valor ms matemtico a los centimorgan. No hace
falta sabrselo, slo saber que existe y que suene. Se basa en logaritmos:

Para identificar la regin cromosmica se utilizan mapas genmicos, hay varios tipos:
Mapas citogenticos: representacin ordenada de los cromosomas de un individuo
en funcin de su nmero, forma y tamao. La resolucin es baja y permite conocer
la banda donde se localiza un fragmento de DNA por hibridacin.
Mapas fsicos: se basan en el anlisis directo del DNA, midiendo las distancias en
nmero de pares de bases (megabases, kilobases)
Mapas genticos o de ligamiento: basndose en el proceso de recombinacin
informan de la posicin de unos genes respecto a otros conocidos. Pero las
distancias son slo aproximaciones de las reales basndose en el porcentaje de
recombinaciones.
MAPAS CITOGENTICOS
Un ejemplo de esto es el FISH (Fluorescence In Situ Hybridation, utiliza sondas para reconocer
secuencias especficas). Actualmente ha avanzado tanto que permite utilizar diferentes colorantes
para cada cromosoma de forma que se puede colorear cada uno de ellos, como en la imagen
siguiente:
Gracias a esto podemos observar que
ha ocurrido una translocacin entre los
cromosomas 2 y 5, cada uno tiene un
fragmento del otro, tpica de linfomas no
Hodgkin (no confundir con el
cromosoma Philadelphia, que es del
9:22).
Otra tcnica utilizada en 2001,
aunque ahora est un poco desactualizada, consiste en utilizar hibridaciones de clulas somticas,
se fusionan clulas murinas con cromosomas humanos, una lnea celular murina tiene el
cromosoma 1, otra el 2, otra el 3 Despus se hacen en todas PCR con la secuencia a identificar y
por lo tanto slo se ampla una regin cromosmica, que estar en la lnea germinal del
cromosoma que queremos identificar, despus slo
habr que hacer electroforesis para ver dnde est.
Por ejemplo, en la imagen vemos cmo est
en el cromosoma 5, que es donde ha habido
polimerizacin.
MAPAS GENTICOS O DE LIGAMIENTO
Tenemos muchos marcadores establecidos en
el genoma humano, todos los que empiezan por D
son marcadores y as vemos cuales estn ms cerca
del gen concreto segn la recombinacin.
Para ver todos los marcadores de datos hay una pgina web: www.ensembl.org
Un ejemplo de marcador es D22S264, D indica DNA, 22 el nmero de cromosoma, S que es
una secuencia nica (en cambio Z sera secuencia repetida en otro cromosoma y F secuencia
repetida en ms de un cromosoma), por ltimo el nmero 264 es el nmero del marcador. Si se
expresa este marcador se aade e al final.
Muchos marcadores actualmente son STS (sequence tagged sites), fragmentos cortos de
200-500 pares de bases de secuencia nica que pueden ser detectados mediante PCR para mapear
el genoma humano.
4. Enfermedades moleculares
Se clasifican de esta manera:

Respecto a las cromosomopatas son cambios en el nmero o estructura de los cromosomas,
no va a entrar mucho porque no le interesa.

Respecto a las mixoploidas, son personas mosaicos, son personas con genotipo distinto
segn que clulas, por ejemplo, tpicamente el sndrome de Down algunos tipos celulares pueden
ser normales.


Un ejemplo de delecin ocurrira en el cromosoma 5, que provoca sndrome de Cri-du-Chat o
del Maullido de gato.
Respecto a las translocaciones hay dos tipos: pueden ser balanceadas (se mantiene la
informacin pese a haber translocacin, son menos graves) o no balanceadas (con prdida de
informacin, una tpica es el cromosoma filadelfia, de la leucemia mieloide crnica). La
translocacin Robertsoniana ocurre en cromosomas acrocntricos (13, 12, 15, 21). Por ejemplo
una tpica es entre el 4 y 21, que es un 5% de los Down
TEMA 2 METODOLOGAS DE DIAGNSTICO DE ENF. MOLECULARES
1) Mtodos clsicos: pueden ser enzimolgicos (por deteccin de enzimas o de metabolitos)
o inmunolgicos (anticuerpos que se unen a protenas especficas).
2) Mtodos actuales: anlisis del DNA del paciente (Southern-blot, PCR, Microarrays).
1. Mtodos clsicos
Un mtodo clsico es para conocer los niveles de glucosa que resulta de una reaccin
qumica sencilla, la conversin de glucosa en gluconolactona liberando perxido de hidrgeno, que
se utiliza para colorear el ABTS, que pasa de incoloro a verde. Ms verde ms glucosa, es muy
sencillo.

2. Mtodos actuales
Arber, Smith y Nathans desarrollaron la ingeniera gentica descubriendo enzimas de
restriccin, que cortan en secuencias especficas generando segmentos de DNA que
posteriormente segn su tamao pueden realizarse electroforesis para analizar. Esta es la base del
Southern Blot, de creacin de
DNA recombinante
SOUTHERN BLOT
Ayuda a identificar
regiones de DNA, es un mtodo
que permite detectar la
presencia de una secuencia de
DNA en una mezcla compleja de
este cido nucleico. Primero se
realiza electroforesis en gel de
agarosa para separar los
fragmentos de DNA, despus se
transfiere a una membrana
(filter) donde se efecta la
hibridacin de la sonda
radioactiva, se limpia la sonda
libre y slo queda aquella hibridada con el DNA pegado a la membrana.
PCR Reaccin en cadena de la polimerasa
Desarrollado por Kary Mullis, el aparato que hace la PCR se llama termociclador.
Se saba que el DNA se separaban las hebras a partir de
90 grados, pero haca falta una polimerasa que funcionara a
esas temperaturas y se utilzaba la de la bacteria Thermus
Aquaticus que vive en las fuentes termales, pero cometan
muchos errores hasta que se consiguieron las que
prcticamente no fallan, aunque derivan de otra bacteria.
Cada ciclo consiste en:
Desnaturalizamos a 90
Tenemos dos primers complementarios que se unen a
55, y despus se pone a 72, que es la temperatura
ptima de la Taq (DNA polimerasa)
Esto ocurre en el primer ciclo, se repite 25 o 30 ciclos.
Observar cmo hasta el tercer ciclo no tenemos la
seccin del DNA de inters (target), consiguiendo dos copias.
Despus de 30 ciclos ya tenemos un milln de copias
target.
RNA DE INTERFERENCIA
Son pequeos RNA no codificantes
que anulan la expresin de ciertos genes
al bloquear el RNA mensajero, lo que se
produce entonces es una disminucin de
la expresin gnica, se denomina knock-
down (frente a knock-out que elimina
completamente la expresin).
A partir de una RNA artificial de
doble hebra que introduces en la clula
se crea una sencillo que es
complementario del RNA que quieres
romper, debido al complejo DICER, que
corta al RNA en diferentes partes,
entonces se unen al complejo RISC
(tambin llamado argonauta), que quita
una de las hebras, mientras que la otra,
que sigue unida al complejo, va a unirse
a mRNA, si ambas secuencias son complementarias se corta el mRNA, que, al no estar protegido
por la caperuza se degrada por la RNAasa.

MICROARRAYS
Son Chips de expresin que sirven para detectar RNA, sacamos todo el RNA de un tejido para
ver qu genes se estn expresando en cada situacin, interesante para tumores por ejemplo.
En cada celdilla del microarray hay DNA complementario al RNA expresado, y se detecta por
colores, los puntos verdes indican baja expresin y los verdes son de alta expresin.
Cada fila es un tumor y
cada columna es un gen.
La lnea amarilla
diferencia dos tipos de tumores
de mama, por debajo son los de
un tipo concreto y por encima
diversos tumores de otro tipo.
Comprobar como los
tumores del tipo inferior tienen
sobreexpresados varios genes
concretos.
Ver en las columnas de la derecha como la mayora de los tumores por encima de la lnea
amarilla tienen BRCA1 mutado (en negro), mientras que no expresa ER y tiene infiltrado
linfocitario. En cambio en los de abajo BCRA1 no suele estar mutado y ER suele estar expresado,
no es de grado 3 en general y no hay infiltrado linfocitario, es decir, estos ltimos son ms
benignos.
3. Aplicaciones de los mtodos de anlisis por DNA
Basndose en que la informacin gentica de un individuo es nica y todas las clulas de un
individuo tienen la misma informacin se puede identificar con la huella de DNA (definida por un
conjunto de marcadores genticos) a un individuo.
La primera vez que se utiliz en criminologa fue para identificar mediante una muestra de
semen a un violador, utilizando un loci, pero actualmente, para no cometer errores se utilizan
hasta 13 loci (creado por el FBI, se denomina sistema CODIS: combined DNA
index System, lo cre Bob Blackett), que comete un error de 1 de cada 6000
millones de personas, en cambio, Biozell, una empresa de Gijn utiliza hasta 17
loci, la posibilidad de error es mnima. Los loci utilizados son VNTR (variable
number tndem repeats), que son polimrficos. En caso de gemelos se hacen
anlisis epigenticos, que veremos en otro tema. Por ejemplo, una aplicacin
es conocer la descendencia, en la imagen de la derecha se aprecia que el hijo 2
no coincide con el padre, porque no hereda ninguno de los dos alelos del
padre.
En este caso tenemos tres
posibles sospechosos (S1-S3) para
siete violaciones (U1-U7), y hemos
analizado nueve loci, cada loci
analizado es un cuadro. Vemos
como siempre el S2 est presente
en las violaciones U3-U7.
4. Modelos animales
Para comprobar si un gen
concreto es el responsable de cierta
patologa se lo quitamos un ratn y
vemos qu ocurre. Hay tcnicas
para eliminar la funcin del gen
(knockout), en cambio como
habamos visto la interferencia no
elimina completamente le gen (es lo que se
llamaba knock-down).
Tenemos el gen concreto, con un
promotor y cuatro exones, lo que
intentamos hacer es eliminar la parte activa
del enzima y as se sabe que no habr
funcin.
Primero, creamos un vector de la
zona que queremos sustituir e introducimos
un marcador para saber qu clulas
incorporan la nueva secuencia. Ese
marcador puede ser un gen de resistencia a
neomicina por ejemplo, de forma que al
administrar el antibitico slo aquellas
clulas modificadas genticamente sobrevivan, porque la posibilidad de que ese vector se incluya
en el DNA por recombinacin es muy pequea. Para que el vector entre en el ratn se utiliza
electroporacin. Recordar que como estamos metiendo esta secuencia
en una zona donde se producira un enzima normal hay promotores, y
por eso el gen de resistencia a neomicina codifica.
En cierto porcentaje de clulas se produce recombinacin
homloga entre el vector y el cromosoma normal. Generalmente slo
se produce la recombinacin en un cromosoma, las clulas son
heterocigotas (y diploides, por tanto) y se introducen en un blastocisto
de un ratn, esperando que estas clulas modificadas genticamente
vayan a formar parte de la lnea germinal del ratn.
Es decir, el ratn que nacer ser un mosaico de clulas normales (las del blastocisto) y
modificadas (las que hemos introducido tras modificarlas previamente de forma gentica), y
debemos esperar que formen parte de la lnea germinal porque si no, no se transmiten en la
herencia.
Una vez obtenemos el blastocisto mosaico lo introducimos en una ratona hembra
pseudopreada (un ratn vasectomizado se reproduce con ella), que est preparada
hormonalmente para el embarazo aunque no lo est hasta la introduccin del blastocisto
recombinante.
El ratn hijo es mosaico, necesitamos que haya varias generaciones de ratones para que
consigamos finalmente un homocigoto (el knock-out, sin ninguno de los alelos funcionante),
puesto que los heterocigotos muchas veces no expresan alteraciones anatomofuncionales.
Hay casos en los que cuando juntas dos ratones heterocigotos para el gen (+/-) la herencia
no es Mendeliana (un 25% de la descendencia debera ser -/-), eso se debe a que es mortal la
homocigosis y no sobreviven.
Todo este proceso puede llegar a tardar hasta dos aos.
Lo del gen de resistencia a neomicina se puede utilizar en las clulas al principio para saber si
son recombinantes o no, pero en las camadas siguientes necesitamos saber qu ratones son +/+,
+/-, -/- Para ello en el alelo silvestre, dentro de la secuencia que queremos sustituir debe haber
sitios de accin de endonucleasas (ya sean EcoRI, o en el caso de la imagen Xho1), que tambin se
ponen en el vector, de forma que se puede analizar electroforticamente amplificando secuencias
(es decir, tambin necesitas sondas para las secuencias prximas a Xho1 de forma que puedas
amplificar esos fragmentos y ver si son los silvestres o los recombinantes). Segn el tamao ser el
alelo silvestre o el recombinante.

TEMA 3: ESTRUCTURA DE ENZIMAS NO ENZIMTICAS
1. Globinas
Tenemos la hemoglobina, molcula formada por un dmero de dmeros, dos alfa y dos beta.
Concretamente la subunidad alfa1 es muy parecida a la mioglobina, que es la que recoge el
oxgeno dentro de los msculos, mientras que la hemoglobina lo transporta en sangre.
Dentro de cada subunidad hay un anillo orgnico conocido como protoporfirina IX que se
une al hierro dando la porfirina o grupo hemo, porque no hay aminocidos con adherencia al
oxgeno. El hierro tiene seis enlaces, cuatro de ellos se unen a la protoporfirina, otro se une a HF8
(histidina en F8), para que el hierro no est en el centro del plano porfirnico a menos que se una a
oxgeno. Pero adems hay otra HE8 (histidina en E8) que hace que el oxgeno no est recto, esto
reduce la afinidad por el CO de 2000 a 200
veces superior a la del oxgeno.
Normalmente el hierro tampoco
est recto respecto a HF8, sino desviado
8, pero tras la unin del oxgeno, al pasar
de desoxihemoglobina a oxihemoglobina
s se coloca recto, gracias a que si no
estara en un estado de tensin con una
valina en FG5.

Se produce un cambio conformacional entre las subunidades de hemoglobina cuando se une
el oxgeno que permite cambiar la afinidad por el oxgeno al pasar de desoxihemoglobina a
oxihemoglobina, este fenmeno se llama cooperatividad.
Respecto a la hemoglobina no
tenemos siempre la misma, la adulta es
22 o HbA, mientras que la fetal es
22 o HbF, hay otra hemoglobina del
adulto, pero es menos frecuente, al
HbA2, que es alfa 2 y delta 2.
Estas globinas estn codificadas
por familias multignicas, que consisten
en cluster (grupos) de genes, en el
cromosoma 16 estn los de cadenas alfa y gamma y en el 11 los de las cadenas beta y delta.

Las hemoglobinopatas son cambios en aminocidos puntuales o en secuencias de
aminocidos (alargamientos de la cadena, acortamientos, hemoglobinas de fusin). Esta alteracin
de la estructura da lugar a una alteracin de la funcin, que se describe segn dnde se describi.
Existen un tipo de hemoglobinopatas especiales denominadas talasemias, en las que hay
carencia en la sntesis de alguna cadena, pudiendo dar lugar a una anemia.
Tipos de mutaciones: hay mutaciones sin sentido (missense mutation, consiste en un
cambio que genera hemoglobinas no funcionantes), en cambio con otra mutacion puede
generarse un codn STOP provocando nonsense mutation. Si se aade o quita un nucletido lo
que se produce es un cambio en la pauta de lectura que modifica completamente la protena
(frameshift mutation).
Hay cientos de mutaciones descritas, pero no todas son
patolgicas, algunas incluso modifican la estructura de los hemates,
como en la anemia falciforme por la hemoglobina S (Hb S), llamada
en ingls sickle-cell anaemia, esta hemoglobina, que provoca que
los eritrocitos se conviertan en drepanocitos, con estructura en
forma de bastn, genera una anemia hemoltica, los eritrocitos se
rompen. Se debe a una mutacin que hace que una valina en 2
tenga afinidad por la esquina EF de 2 de otra hemoglobina
generando fibras por superposiciones de hemoglobinas que
cambian la estructura de los eritrocitos.
Estas hemoglobinas se suelen detectar fcilmente mediante
electroforesis de hemoglobinas, slo hace falta poner el suero y te
dice qu hemoglobnias hay, lo normal es que sean Hb A.
En los pacientes con SS (homocigotos
para la anemia falciforme) se produce un
poco de HbF para compensar esta
hemoglobina S que no es funcional.

Otras mutaciones provocan cambios en la afinidad por el oxgeno:
Alta afinidad por el oxgeno: es el caso de la policitemia
hereditaria, que provoca eritrocitosis (alta concentracin
de eritrocitos en sangre, que provoca pltora, es decir,
enrojecimiento). Se incrementa el nmero de eritrocitos y
el ndice de hemoglobina debido a mutaciones e las
cadenas de Hb que afecta a los contactos 12. Un
ejemplo es la hemoglobina Yakima, en la que se cambia
el Asp99 de la cadena beta por una histidina. Otro
ejemplo es la hemoglobina Kempsey, en la que se cambia
Asp99 por asparagina.
Baja afinidad por el oxgeno: genera
anemia (leve) o cianosis (grave).
Tambin se debe a mutaciones en las
cadenas de Hb que afectan a los
contactos 12. Un ejemplo de cianosis
es el caso de la hemoglobina Kansas, en
la que se cambia Asn102 por Thr. En este
caso no se modifica la curva de captacin
de oxgeno slo, sino que adems se
modifica Vmax, es decir, la saturacin
mxima de oxgeno. Vmax es un
concepto para actividad enzimtica, no
s qu pinta aqu. En cambio, si lo que se
produce es una anemia por mutacin no se
modifica Vmax sino que slo cambia p50.
Incapacidad de fijar oxgeno:
metahemoglobinemias. La mayora se deben
por afectaciones de los aminocidos que
interaccionan con el grupo hemo, pudiendo
agrandarse el espacio para el oxigeno, por lo
que se puede incorporar agua, haciendo que el
hierro no est estado Fe
2+
si no Fe
3+
.
Respecto a las talasemias, que recordemos, son
enfermedades relacionadas con la ausencia o
disminucin de una o ms cadenas de globina. Se
acumulan cadenas cuya sntesis no est afectada. Son
las enfermedades monognicas ms comunes de la
poblacin mundial. Las ms frecuentes son: alfa-talasemias, beta-talasemias (o beta-talasemias
simples) y delta-beta-talasemias o beta-talasemias complejas.
-TALASEMIAS
Hay dos tipos:
+
(supresin funcional de 1 gen en uno o los dos cromosomas) y
0
(lo que
est afectado son los dos genes, no importa si de forma homocigota o heterocigota, es decir, en
uno o dos cromosomas).
En el primer caso se llaman -talasemias 2 (si slo afecta un gen) y en el segundo caso se
llaman -talasemias 1 (hay dos genes afectados).
Otras -talasemias no ocurren por delecin del propio gen, sino mutaciones puntuales de la
transcripcin, el procesamiento del RNAm, la traduccin o la estabilidad postraduccional.

En estos casos de alfa-talasemias lo que ocurre es que los otros genes no afectados se
expresan en mayor proporcin y por ello pueden acumularse cadenas gamma, generando en el
cordn umbilical un acmulo de una hemoglobina anmala denominada hemoglobina de Bart,
compuesta por cuatro cadenas gamma.
Normalmente la expresin de alfa2 se expresa ms por eso muchas mutaciones detectadas
afectan a alfa2.



Algunas posibles mutaciones se deben a errores en el splicing. Los intrones generalmente
empiezan en GT y acaban en AG, as es como el splisosoma reconoce eso como un intrn, si hay
mutaciones ah es malo. Otros posibles cambios es una que hace que se genera un STOP codn.
-talasemias
Recordar que pueden ser simples (slo implican a la beta-globina, o complejas, implican al
de la delta y beta a la vez.

De las talasemias la ms importante es la anemia de Cooley, es un tipo de talasemia mayor,
son homocigotos para
0
-talasemias, en el momento del nacimiento son asintomticos,
posteriormente sufren retardo en el crecimiento por la hipoxemia crnica, sufren cambios seos
con protrusin de mandbula y mejillas, hepatoesplenomegalia progresiva, acumulacin de hierro,
cirrosis heptica, problemas cardacos y endocrinos. Dependen de transfusiones para sobrevivir.
Adems est presente Hb F.
2. Distrofias musculares
Las distrofias musculares son enfermedades hereditarias que producen debilidad en los
msculos estriados. Cada trastorno puede afectar a diferentes tipos de msculos y los sntomas
acompaantes pueden ser distintos.
En estos trastornos est afectada la distrofina, una protena citoesqueltica bastoinforme
ubicada justo bajo la membrana plasmtica de la clula muscular esqueltica relacionada con el
anclaje de las protenas musculares a la membrana muscular. Es el gen ms grande del cuerpo, con
2,4 millones de pares de bases, 79 exones y 78 intrones.
Tambin son enfermedades no enzimticas como las hemoglobinopatas.
Est afectado el msculo estriado y son enfermedades asociadas al cromsomas X:
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD): afecta a Xp21, hay un cambio en la pauta de
lectura y la protena no es funcional.
Distrofia Muscular de Becker (DMB) es menos agresiva aunque tambin afecta a
Xp21, pero lo que ocurre es que en este caso s se produce la protena, pero mucho
ms pequea, por generarse un STOP codn.
Distrofia muscular de Emery-Dreifuss: est afectado el Xq28
DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y DE BECKER
Se rompen las fibras musculares porque falta la distrofina. En la forma menos severa (Becker)
los pacientes caminan hasta los 16 aos y sobreviven hasta los 40.
Una presentacin clnica es la maniobra de Gower que
es la que utilizan para levantarse desde pequeos.
Genticamente una madre portadora con padre sano
engendrar la mitad de los hijos varones sanos y
la mitad afectados, mientras que las hijas sern
mitad sanas mitad portadoras.
Ver en los genes como hay varios exones 1,
eso es porque segn el tipo celular se expresa
un tipo de distrofina ms larga o menos.
Otra caractersticas de esta protena son
los dominios espectrina, tiene muchas
repeticiones. El dominio es una seccin de la
protena que tiene funcionalidad independiente
y que si la alineo y la suelto vuelve a tener la
misma estructura terciaria. Se puede utilizar en ingeniera proteica movindolas de unas protenas
a otras.
Si situamos la distrofina en la clula forma parte de un andamiaje unindose mediante el
dominio C-terminal a estructuras en la membrana.
Ver como en el anlisis por PCR el individuo 3 le falta un exn, realmente el 60% de las
mutaciones son en realidad deleciones. Dependiendo de dnde estn las deleciones ser ms o
menos grave.
Hay dos zonas con abundantes deleciones, sobre todo de los exones 1 a 20, y otro grupo
tiene afectados sobre todo los exones del 44 al 55.
En la de Duchenne el 96% tienen de leciones que alteran la pauta de lectura y por tanto
salga lo que salga no vale para nada. En cambio en Becker el 84% tienen deleciones que no
alteran la pauta de lectura.
DISTROFIA DE EMERY-DREIFUSS
Hay otras distrofias, por ejemplo en la que falta la emerina, que est sobre todo en el ncleo
de los cardiomiocitos, asociada a la membrana nuclear, por lo que los ncleos empiezan a tener
apariencia amorfa.
Aparte de las contracturas en codos, nuca y talones la complicacin ms peligrosa es el
bloqueo de conduccin cardaca, porque se desestabiliza el ritmo de las palpitaciones, pudiendo
producirse un paro cardaco repentino. Se detecta mediante electrocardiograma y se soluciona
con un marcapasos.
3. Sndrome de Marfan
Se supone que algunos varones egipcios estaban afectadas, como el faran Akenatn
porque se representaba de forma distinta, normalmente los faraones se representaban casi todos
iguales pero l quera que lo representaran tal y cmo era.
Caractersticas: pectus excavatum, ectopia dentis, dedos alargados... no es muy importante.
Hay alteraciones en pulmones, arterias tejidos muy elsticos.
El problema est en la protena fibrilina,que est sobre todo
en tejidos elsticos, las fibras elsticas estn compuestas por
elastina y microfibrillas.
Hay muchas protenas que interaccionan con la fibrilina


La fibrilina tambin est codificada por un gen muy grande, que puede sufrir tambin
splicing alternativos generando protenas parecidas con formas diferentes.
Vemos ms detallados algunos dominios como el EGF, LTBP, motivo Fib, o e mismo con 4
cistinas. Toda esta nomenclatura de dominos es complejo , lo que hay que saber es que hay una
gran variedad de dominios para interaccionar con mltiples protenas, por ello las mutaciones de
nucletidos concretos en ocasiones afectan completamente a la funcin de la protena. De 137
mutaciones descritas slo 11 son recurrentes, porque suele ser mortal.
Muchas mutaciones ocurren en los exones 25, 27 y 28 y el 72% son cambios de aminocidos
de los motivos cbEGF. Un 13% son mutaciones en las secuencias consenso de splicing, haciendo
que haya delecin de uno o ms exones. Hay pocas mutaciones sin sentido descritos.
El fenotipo ms severo es el neonatal que puede presentar fallos moleculares en el primer
ao de vida. De todas formas todo esto es muy heterogneo porque hay muchas mutaciones
descritas, algunas muy severas, otras desarrollan el sndrome de Marfan, y en muchas ocasiones
los tejidos tienen diferentes problemas.
TEMA 4 ENFERMEDADES NEUROPSIQUITRICAS PRODUCIDAS POR
EXPANSIN DE TRIPLETES
Estos son algunos ejemplos de
enfermedades por expansin de tripletes,
abajo viene descrita lo que significa cada
columna.



Debemos recordar el concepto de microsatlite, secuencias de tripletes repetidas, sobre
todo CAG, AGC, GCA, CTG, TGC y GCT.
Cuando la DNA polimerasa est replicando el
DNA cuando hay secuencias repetidas de tripletes
tiende a confundirse, es algo que ocurre al azar, en
una de las hebras se produce un resbaln/slipagge y
se dobla en parte, de momento no pasa nada, pero
en la siguiente replicacin una de las clulas hijas
ser ms larga, tanto ms cuantos ms nucletidos
se haya comido antes. Esta primera etapa se llama premutacin, el fenotipo es normal, pero
genticamente es inestable, y puede expanderse mucho ms.
La poblacin sana normal es polimrfica respecto a la longitud de estos tripletes, en
ocasiones se alargan estos tripletes, lo cual slo es grave si se pasa a las generaciones siguientes
en la va germinal, se van expandiendo ms y ms y se pasa de sntomas suaves en la primera
generacin a severos en las siguientes porque cada vez se expande ms, pasa de premutacin a
mutacin en s.
1. Enfermedad de Huntington
Es una enfermedad autosmica dominante que consiste en una alteracin cognoscitiva,
psiquitrica y motora de progresin lenta durante 15 a 20 aos. Provoca un movimiento
exagerado de las extremidades (movimientos coreicos) y la aparicin de muecas repentinas.
Se debe a una prdida de neuronas en el ncleo caudal, y en el striatum que resulta en
atrofia cerebral.
La causa es una expansin del triplete CAG en
el exn 1 del gen IT15 que codifica la huntingtina.
CAG codifica glutamina.
Lo normal es que est repetido menos de 35
veces, ms de 39 provoca la enfermedad y cuando
es un nmero intermedio tambin, pero la
penetrancia es incompleta.
Una cosa importante a tener en cuenta es que a mayor nmero de
tripletes repetidos mayor probabilidad hay de que se produzca este problema.
El diagnstico se puede hacer fcilmente con una secuenciacin de la
zona donde se localiza el gen en el cromosoma 4 y observar la PCR, ver como en
este caso dos individuos afectados son heterocigotos, uno de los alelos tiene
CAG muy repetido.

En la enfermedad de
Huntington se considera tener un
alelo normal es menor o igual a 26,
un alelo mutable est entre 27 y 35,
porque es ms fcil que se formen
ms repeticiones. Las premutaciones
son menores de 39 y fcilmente con la
siguiente lnea germinal se llega a
error.
La huntingtnina es una protena que participa con los enhancers del receptor de dopamina,
para la transcripcin del gen. La accin especfica no est clara pero se sabe que se une e
interacciona con estos complejos de transcripcin. En la patologa no se puede formar el complejo
de transcripcin, y por ello no se transcriben correctamente muchos genes en las neuronas.
Pero adems del ncleo tambin tienen accin citoslica, en esta gente hay un nmero de
apoptosis mayor del normal. Esto se debe a que normalmente la huntingtina est unida a Hip1
(huntingtin interacting protein), que juntas participan en fenmenos de endocitosis junto con la
clatrina. Pero cuando la huntingtina es patolgica es eliminada por proteasas, y entonces Hip1
est en su forma libre, y como tiene dominios caspasa, se activan y se produce la apoptosis.

Tiene ms efectos pero fundamentalmente son estas dos.
2. Sndrome del X frgil o de Martin-Bell
Est situado en el gen X, provoca comportamiento autista y discapacidades cognitivas. Se
encuentra en uno de cada 1200 hombres y una de cada 2500 mujeres.
El gen es FMR: Fragile X mental retardation.
Se debe a una expansin del triplete CGG en
la regin 5 del gen FMR-1 en Xq27, es decir, este
triplete expandido no est dentro del gen sino en la
regin promotora, no se considera una
enfermedad gentica (los exones estn correctos),
sino epigentica, por lo siguiente.
La repeticin est en la zona del promotor
(CGG), recordar que CG cuando est muchas veces
repetido se forma ADN-Z (ms compacto) y
adems las DNA polimerasas lo polimerizan muy mal y pueden cometer errores, por eso
frecuentemente se amplian estas zonas.
La enfermedad es epigentica porque debido a la expansin se ha producido un
silenciamiento epigentico. Muchos genes tienen islas CG previas (se llaman islas CpG) donde se
unen los factores de transcripcin. En estas zonas hay hipermetilacin de citosinas CpG, y esta
metilacin estorba a la maquinaria de transcripcin y por ello no hay transcripcin y por eso no se
transcribe el gen.
Como hay expansin de CGG las metilasas se confunden y metilan esta zona ms de lo que
deberan, en el genoma normal como no hay expansin esta zona no est metilada.
Importante tener en cuenta que la metilacin es ambiental, permite distinguir hermanos
gemelos, si uno trabaja en oficina y otro en una mina la metilacin no es la misma, pero sobre esto
queda mucho para investigar.




Ver en las imgenes del cromosoma X cmo tienen un extremo raro muy comprimido eso es
por haber tantos tripletes CGG, por eso se llama frgil. Cuando la DNA polimerasa viene a replicar
esta zona se arma un lo.
Para detectar si una persona tiene esta enfermedad o no se hace mediante una PCR se
amplifica el segmento que queremos investigar (que hemos cortado con EcoR1) y ya tenemos el
fragmento de DNA que incluye el promotor que queremos investigar. Despus se utiliza otro
enzima de restriccin, la Eag1, que corta en CGGCGG (pero slo si no est metilado), es decir,
cuanod no hay amplificacin de tripletes. En individuos normales, por tanto, habra muchos
fragmentos pequeos (pocas kilobases), mientras que en los mutados, al estar metilados, los
fragmentos son ms grandes.

Ver cmo los normales tienen tamaos pequeos (2,8kb), mientras que los mutados pueden
tener tamaos de ms del doble.
El patrn de herencia es el mismo que en las enfermedades de los cromosomas sexuales,
tpicamente estn ms afectados los hombres, adems las premutaciones pueden pasar a
mutaciones fcilmente de una generacin a otra.
Pero hay que recordar que las
nias heterocigotas con un cromosoma
X frgil tambin pueden desarrollar la
enfermedad dependiendo del nmero
de clulas que fenotpicamente
inactiven el cromosoma sano:






TEMA 5: ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS
CARBOHIDRATOS
Son tres los monosacridos que pueden atravesar el intestino: glucosa, fructosa y galactosa.
Vamos a ver desrdenes en el metabolismo de la fructosa y de la galactosa:

Cuando llega el azcar a la clula luminal entra por un transportador GLT1 que mete a la
glucosa con un simporte con sodio, posteriormente el sodio sale por la membrana basolateral por
la bomba sodio potasio, que requiere ATP.
Hay varios transportadores de glucosa. La Km indica la afinidad, a ms Km la afinidad es
menor, por ejemplo la Km de GLUT1 (cerebro) es mucho menor que la muscular o hgado porque
el hgado no puede tener la misma afinidad que el cerebro.

En el hgado el exceso de glucosa se transforma en glucgeno para que no aumente la
presin osmtica. GLUT5 es especfico de fructosa, los otros valen para galactosa y glucosa a la vez.
La galactosa y la fructosa deben transformarse en glucosa para poder entrar a la gluclisis y
utilizarse como fuente de energa.
Pero la fructosa tiene un
problema y es que se metaboliza muy
rpidamente, el doble de rpido que la
glucosa y esto puede ser muy
importante.
La fructosa por hexoquinasa se
transforma en fructosa 6P (es la misma
hexoquinasa que fosforila glucosa),
pero la afinidad es mucho mayor por la
glucosa que por la fructosa.
La otra forma de metabolizarse
en el hgado es algo ms compleja:
primero hay una fosforilacin por una
fructokinasa, especfica de la fructosa,
y despus interviene la fructosa 1
fosfato aldolasa, que rompe la fructosa
en gliceraldehdo (que debe
fosforilarse) y dihidroxiacetona-fosfato que tambin es sustrato de gluclisis.

En casos de que la fructosa est en niveles muy altos, la fructoquinasa tiene Vmax muy
levada, por lo que adems de tener alta afinidad tiene velocidad alta.
E+S ES E+P La primera flecha reversible mide la Km y la segunda la Kcat (constante de
catlisis). La relacin Kcat/Km si es alta indica que son enzimas muy buenos (con Kcat muy elevada
y Km muy baja).

Como la fructoquinasa es tan buena puede haber gran acumulacin de ADP pero tambin de
fructosa1-fosfato. Si se acumula mucho va a producir hiperuricemia, cido rico cristalizado,
adems los niveles de ATP se reducen mucho y la consecuencia final es la acumulacin de cido
rico (la infusin intravenosa de fructosa provoca en menos de 2 minutos un descenso de ATP a
casi la mitad de su valor normal por su rpida utilizacin del nucletido por la fructoquinasa
heptica), como consecuencia final se acumula cido
rico.
La razn por la que se acumula cido rico es
que hay un enzima: AMP desaminasa, que tiene dos
moduladores alostricos: ATP y fosfatos inorgnicos.
Los niveles de fosfato bajan porque intenta
formarse mucho ms ATP porque hay poco, y la
inhibicin alostrica del fosfato va a dejar de ocurrir.
Por eso el enzima se va activando. La clave es el
fosfato porque es quien ms acta sobre el fosfato y
como es tan bajo activa el enzima, es decir,
normalmente inhibira a la AMP desaminasa pero al
estar bajos no ocurre, y aunque los niveles de ATP estn subiendo algo no es suficiente como para
que vuelva a activarse el enzima.
RESUMEN: AMP desaminasa fisiolgicamente est inhibida al 95% por los fostatos, mientras
que el ATP la activara.
Otra cosa que pasara si nos alimentramos slo con la fructosa es que la primera parte de la
gluclisis no se produce hacemos un bypass en un enzmia que regula la gluclisis que es la
fosfofructoquinasa. Hay tres reacciones que controlan la gluclisis: hexokinasa (tambin
interviene en la formacin de glucgeno), fosfofructoquinasa y piruvato kinasa (pero esta
tambin interviene en la formacin de aminocidos), por lo que slo la fosfofructoquinasa es
especfica de gluclisis.
La piruvato quinasa, que regula el ltimo paso de la gluclisis se ve activada por la
acumulacin de fructosa-1-fosfato, por lo que los niveles de
cido lctico aumentan.
Normalmente la fosfofructoquinasa se ve regulada
negativamente por altas concentraciones de ATP, mientras que
se activa por altas concentraciones de AMP, la actividad del
enzima aumenta cuando disminuye la relacin ATP/AMP. Pero
este enzima tambin se inhibe con la cada de pH, para evitar
la mayor formacin de lactato.
1. Fructosuria esencial benigna
Consiste en una deficiencia gentica de la fructoquinasa, y se detecta por presencia de
fructosa en orina dependiendo de la cantidad de fructosa y sacarosa que se haya consumido.
Es autosmica recesiva y se debe al gen KHK (ketohexokinasa), que est en 2p23.3.
Tiene una incidencia de 1/130.000, pero puede no detectarse en toda la vida del individuo.
Es benigna y asintomtica.
2. Intolerancia hereditaria a la
fructosa
Se debe a la deficiencia gentica de la aldolasa
B o fructosa-1-fosfato aldolasa, que est en 9q21.3-
q22.2. Como no existe esta aldolasa la fructosa-1-
fosfato se acumula.
Clnicamente consiste en que la ingesta
continuada de fructosa conduce al desarrollo de
hepatomegalia, hemorragias, ictericia, fallo heptico y
renal que pueden producir la muerte del paciente.
Hay tres tipos de aldolasas: A (msculo), B
(hgado, corteza renal e intestino delgado) y la C
(cerebro).
En el hgado enfermo slo acta la aldolasa A,
no la B, por lo que se acumula la fructosa 1 fosfato
que tiene como consecuencia directa la inhibicin de
tres enzimas: aldolasa heptica, glucosa-6-P-
isomerasa y fosforilasa A heptica (degrada el
glucgeno, por lo que no se forma glucosa, que no se
puede liberar a los tejidos). Pero es que adems las
otras dos enzimas participan en la gluconeognesis por lo que no se puede producir glucosa.

Es decir, ni se sintetiza glucosa de novo en el hgado ni se puede liberar glucosa a partir del
glucgeno, y todo ello por el exceso de fructosa-1-fosfato.
La diferencia entre msculo y hgado es que en el segundo hay glucosa-6-fosfatasa que
permite formar glucosa, lo cual es detectado y puede formar glucgeno.
3. Deficiencia de fructosa 1,6 bisfosfatasa
Es un enzima de la gluconeognesis (ver cuadro de arriba) que quita un fosfato a la fructosa-
1,6-bisfosfatasa, como no se sintetiza glucosa de novo se acumula lactato en sangre generando
una acidosis y una hipoglucemia durante ayuno prolongado.
Se detecta a los pocos das de nacer porque hiperventilan intentando aliviar la acidosis.

DESRDENES DE LA GALACTOSA: vamos a por un grupo diferente de enfermedades.
La galactosa se incorpora a la gluclisis convirtindose en glucosa-6-fosfato, despus de ser
absorbida en el intestino, al cual accede en forma de lactosa, que se compone de galactosa y
glucosa, la lactasa lo rompe y la galactosa se absorbe.
Para poder llegar a glucosa-6-fosfato debe haber
una serie de reacciones en varias etapas, la primera
acta galactokinasa para dar galactosa-6-fosfato.
La segunda etapa consiste en que el enzima
galactosa-1-fosfato uridil transferasa, que transfiere el
grupo uridn-difosfato unido a glucosa
intercambindolo por el fosfato de la galactosa,
quedando UDP-galactosa, es decir, uridndifosfato-
galactosa y por otra parte queda glucosa-1-fosfato.
En la tercera etapa interviene la UDP-galactosa
4-epimerasa, que cambia el hidroxilo unido al cuarto
carbono de galactosa haciendo que se parezca ms a la glucosa original, dando UDP-glucosa que
puede volver a intervenir a la etapa 2.
Recordar que se haba formado tras la transferasa dando glucosa-1-fosfato, con
fosfoglucomutasa se convierte en glucosa-6-fosfato, que ya puede intervenir en la gluclisis.

4. Deficiencia de galactoquinasa (17q24)
No se metaboliza la galactosa porque la etapa 1 est bloqueada, esto se llama galactosemia
tipo II y cursa tambin con galactosuria. Esta acumulacin de galactosa en sangre provoca la
generacin galactitol, txico, aunque una parte se puede convertir en galactonato pero como ste
no es txico no es tan importante. Pero el galactitol puede provocar cataratas, por lo que habra
que eliminar la galactosa de la dieta.
5. Deficiencia de gal-1-p-uridil transferasa 9p13
Esto se llama galactosemia tipo I, s se forma galactosa-1-fosfato y ah se bloquea la va.
Puede ser ms o menos grave dependiendo de la cantidad de enzima funcional que haya.
En la forma leve hay cataratas y discapacidad cognitiva leve, pero en la forma grave hay
dao heptico y crisis convulsivas cerebrales.
El tratamiento es el mismo, eliminar la galactosa de la dieta.
6. Deficiencia de UDP-gal-4-epimerasa 1p35-36
Se llama galactosemia tipo III y tambin tiene forma leve (afecta a eritrocitos) y forma grave
(afecta a hgado y a otros tejidos).
Los sntomas son parecidos a la deficiencia de transferasa. El tratamiento es el mismo.
LELOIR PATHWAY
Siempre que haya dficit de un enzima suele haber rutas metablicas alternativas para que
no haya acumulaciones de sustratos, aqu interviene la Km de los enzimas, que normalmente no
detectaran el sustrato porque estara en cantidades pequeas ahora s que se activan y
intervienen eliminando el producto.

Un ejemplo es la GDH (glucosa deshidrogenasa), que convierte la galactosa en galactonato
haciendo que entre en la ruta de las pentosas fosfato que veremos luego y que es muy importante
y hay alteraciones en esta ruta con alta incidencia en todo el mundo.
La cuestin es que normalmente GDH no acta pero si se acumula galactosa s que se activa.
ANEMIAS HEMOLTICAS ENZIMOPTICAS
Los eritrocitos son clulas muy peculiares porque no tiene mitocondrias por lo que no se
pueden alimentar de cidos grasos ni pueden hacer el ciclo de Krebs. Se obtiene energa de la
gluclisis y de la va de las pentosas fosfato, son las dos fundamentales.
La gluclisis ya la hemos visto. La ruta de las pentosas fosfato empieza en la glucosa-6-
fosfato.
De todas formas la alteracin de estas rutas provocan clculos biliares ictericia,
esplenomegalia, debido a que la vida media de los eritrocitos disminuye, generando anemia y
provocando aumento de la eritropoyesis, por lo que algunos no maduran bien (reticulocitos
elevados)...
Ejemplos de anemias hemolticas enzimopticas:
7. Deficiencia de piruvato kinasa (pyrK, 1q21)
La piruvato kinasa interviene en la ltima fase de la gluclisis formando piruvato, y
generando 2ATP, que si no se forman el rendimiento es nulo de la gluclisis. Esta gente necesita
transfusiones, se les debe hacer esplenomegalia, hay anemia hemoltica (no tienen energa y se
rompen frecuentemente)...
RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO
Pero las anemias hemolticas enzimopticas
ms frecuentes son las que afectan a la ruta de las
pentosas-fosfato, afectando a 400 millones de
personas en todo el mundo.
La glucosa 6-fosfato al entrar en esta ruta se
forma poder reductor (NADPH), necesario para la
formacin de cidos grasos por ejemplo en tejido
adiposo, donde esta ruta est muy activada. Pero
adems el NADPH es necesario para la actuacin
del glutation, que debe estar reducido, y el poder
reductor est cedido por el NADPH.
Si no se produce NADPH no se puede
detoxificar.
Pero adems de esta primera fase llamada
oxidativa en la que se forma NADPH, est la fase no
oxidativa en la que se produce ribosa-5-fosfato.
No hace falta saberlo muy bien porque es una ruta complicada y sera muy largo de estudiar,
pero como se ve en el cuadro inferior, tiene muchas funciones.

8. Deficiencia de
glucosa-6-fosfato-DH (Xq28)
Es la primera parte de la ruta y es
la ms frecuente con 400 millones de
personas afectadas.
Se llama favismo porque se
agrava con las fabes, ya que son muy
oxidantes y hace falta glutation para
eliminar estos productos oxidativos,
pero si no hay suficiente poder reductor
se genera stress oxidativo que acaba
eliminando el eritrocito.
Pero esta enfermedad es favorable para que no te
afecte la malaria porque los Plasmodium necesitan los
eritrocitos, algo favorable en frica donde la incidencia
de la malaria es muy alta. Pero hay que tener cuidado
porque no pueden tomar ciertas comidas oxidativas, el
ejercicio no est indicado porque genera sustancias
oxidantes o ciertos medicamentos como la aspirina.
9. Deficiencia de transacetolasa
Enzima de la parte no oxidativa de la ruta de las
pentosas fosfato.
Es un enzima reversible que interconvierte
azcares de varios carbonos:

La transacetolasa necesita de la tiamina (vitamina B1) para funcionar, por ello en la
enfermedad de Wernicke-Korsakoff est afectada. Esta deficiencia de tiamina se debe al alcohol,
cuyo exceso interviene en el metabolismo de la tiamina. Los sntomas son: amnesia antergrada,
amnesia retrgrada grado variable, prdida de coordinacin muscular, marcha inestable,
confabulacin, alucinaciones, diplopia y ptosis palpebral.
GLUCOGENOSIS
Tanto el hgado como el msculo acumulan glucgeno, ms o menos de la misma forma,
primero llega glucosa dando lugar a glucosa-6-fosfato que puede incorporarse a la gluclisis o
puede formar glucgeno en periodo absortivo, aunque antes deben transformarse en glucosa-1-
fosfato ya que el glucgeno se forma a partir de unidades de glucosa-1-fosfato.
Pero durante el ayuno hay que movilizar el glucgeno, por lo que vuelve a glucosa-6-fosfato
y puede entrar a la gluclisis (msculo) o volver a glucosa en el hgado para ir al resto del cuerpo
donde es necesario.
Hay una serie de enzimas que intervienen en la degradacin del glucgeno: glucgeno
fosforilasa, transferasa, -(1,6)-glicosidasa (desramificante), y fosfoglucomutasa.
GLUCGENO FOSFORILASA: a
partir de glucgeno libera unidades de
glucosa-1-fosfato sin utilizar ATP,
utiliza un fosfato inorgnico, por lo que
es energticamente ventajoso.
GLUCGENO TRANSFERASA: pero
el glucgeno est muy ramificado por
lo que hace falta el enzima glucgeno transferasa
para que al llegar a una ramificacin se transfiera
la ramificacin a la lnea principal.
Pero no se quita del todo la ramificacin,
hace falta la ALFA-1,6-GLUCOSIDASA para quitar
la glucosa unidad con enlace 1,6. sta es la nica
enzima que no tiene el nombre glucgeno antes.
Una vez liberado glucosa1-fosfato la
FOSFOGLUCOMUTASA lo transfiere a glucosa-6-
fosfato.
En el hgado hay otro enzima que se llama
GLUCOSA-6-FOSFATASA que elimina el fosfato y
libera glucosa no fosforilada a sangre, que va a los
tejidos, aunque este enzima est por dentro del
RER as que hace falta un transportador tanto
para introducir glucosa-6-fosfato, y GLUT-7, que saca glucosa del RER, y despus esta glucosa sale
por GLUT2 de la clula a sangre. Este sistema permite regular los niveles de glucosa en sangre
mantenindolos entre 5-8mM.
Las glucogenosis afectan a cualquiera de estas enzimas, y hay distintos tipos segn el enzima
afectado, hasta 10 tipos diferentes, y las consecuencias son distintas. Son enfermedades raras.
No hace falta estudiar la tabla con los dos tipos, es como curiosidad, hace falta conocer el
concepto.