COLIFORMES

I. OBJETIVOS :
Aplicar los distintos mtodos de identificacin de coniformes y E. coli.
II. INTRODUCCION :
Los coliformes son microorganismos que indican si un producto alimenticio ha estado en
contacto excesivo o elaborado con ambientes higinicamente deficientes; son indicadores
debido a que estas bacterias crecen tanto en el tracto digestivo de los animales de sangre
caliente como en el suelo u otras superficies como la de los granos y otros productos del
campo, la superficie del huevo, etc.
Le deteccin de estos microorganismos, asporgenos ram!negativos, suele reali"arse
mediante pruebas que implica la fermentacin de la lactosa, diferenci#ndose algunas de estos
tipos de microorganismos por reaccionar ante algunas pruebas como los son la prueba de
$ogel!%ros&auer, de produccin de 'ndol, ro(o de metilo como es el caso de la E. coli.
III. METODOLOGIA :
A Equipos y Mateia!es
! )iluciones de muestras de alimentos de *+
!*
, *+
!,
, *+
!-
! - tubos de ensayo con campanas de )irham con caldo ./'LLA por dilucin.
! 0 %ipetas bacteriolgicas graduadas de *.1 y *+ml.
! %lacas con Agar E2)3 o $/.A.
! 4ubos en caldo ./'LLA y caldo de %eptona 5o caldo 4riptona6.
! %lacas de Agar E2)3 o 7ac 8on&ey.
! %lacas de Agar 2utritivo o %8.
! /eactivos de 9ovacs.
! :olucin /o(o de 7etilo.
! 1ml 93; al *+<.
! 8itrato de :immons.
! Asas de inoculacin.
! 7uestra de alimento 5agua(ina6.
! 'ncubadora regulada a -=>8.
B "o#e$i%ie&to
M'to$o Euopeo:
a. Co!i(o%es Tota!es
*6 %ipetear *ml de cada una de las diluciones a tubos en caldo ./'LLA,
utili"ando - tubos por dilucin, incubar a -1!-=>8x0?hrs.
,6 Anotar los tubos que muestran la produccin de gas 5prueba presuntiva6.
-6 )e cada tubo que contiene gas aislar sobre placas con agar $/.A o agar
E2)3, incubar -1!-=>8x,0!0?hrs.
06 8onfirmar la presencia de coliformes por@
a. Aormacin de colonias ro(o oscuro con di#metro mayor de mm en agar
$/.A.
b. Aormacin de colonias ro(as rodeadas de halo ro(o en agar E2)3.
16 Anotar el nBmero de tubos confirmados, referirse a la tabla 27% para
expresar el resultado.
b. Co!i(o%es Fe#a!es
*6 :eleccionar los tubos de caldo ./'LLA positivos de la prueba anterior.
,6 'nocular una asada de cada tubo en caldo ./'LLA y en caldo peptona.
-6 'ncubar los tubos a 00>8CD!+.*>8.
06 3bservar a las ,0!0?hrs de incubacin si los tubos de caldo ./'LLA
presentan gas.
16 )espus de ,0hrs de incubacin del caldo peptona, se reali"a la prueba del
'ndol.
E6 Los tubos positivos de gas en caldo ./'LLA y que produ"can 'ndol en agua
peptona pueden considerarse como positivos de coliformes fecales.
c. E. Co!i
*6 :embrar por estrFa de cada tubo de gas positivo de caldo ./'LLA de la
determinacin de coliformes fecales, en agar E2)3 o 7ac 8on&ey y poner a
incubar -1!-=>8x,0hrs.
,6 4omar una colonia tFpica 5ro(as con halo ro(o, con o sin brillo met#lico6 de
cada placa y resembrarla por estrFa en Agar 2utritivo o %8. 'ncubar -1!
-=>8x,0hrs.
-6 :eleccionar colonias individuales y sembrar en Agar nutritivo inclinado o %8
y en caldo lactosado. 'ncubar -1!-=>8x,0hrs.
06 A partir de los cultivos gas positivos en caldo lactosado hacer la tincin
/A7, para confirmar la presencia de bacilos /A7 negativos no
esporulados.
16 )e los cultivos Agar 2utritivo o %8 inclinado de ,0 horas, reali"ar la prueba
'7$'8.
I&$o! )*o+a#s,
! 'nocular tubos de caldo triptona o de agua de peptona con los cultivos
puros e incubar a -1!-=>8x,0hr.
! AGadir a cada tubo +.,!+.-ml del reactivo de &ovacs y agitar; esperar
*+minutos y observar los resultados.
! :i aparece un anillo color ro(o oscuro o grosella en la superficie de la
capa, la prueba es positiva, si es naran(a la reaccin es dudosa y amarillo
negativo.
"ue-a $e! Ro.o $e Meti!o
! 'nocular tubos de caldo glucosado, a partir de cultivos puros e incubar a
-1!-=>8 por 1 dFas.
! %ipetear 1ml de cada cultivo en tubos vacFos y aGadir 1 gotas de solucin
ro(o de metilo y agitar.
! :i aparece en color ro(o la prueba es positiva, amarillo negativo y si son
colores intermedios la reaccin es dudosa.
"BA Vo/es0"os1aue
! 'nocular tubos de caldo glucosado, a partir de cultivos puros e incubar a
-1!-=>8x0?hr.
! %ipetear -ml de cada cultivo en tubos vacFos y aGadir el reactivo para la
prueba $oges!%ros&auer 51ml de 2a3; al *+<6, agitar los tubos y de(ar
reposar por , o 0hr y observar los resultados.
! La aparicin de un ro(o carmesF indica $% 5C6 y un color amarillo $% 5!6.
"BA Citato $e So$io
! 'nocular tubos de 8itrato de :immons a partir de cultivoscon un alambre
recto por picadura y estrFa e incubar a -1!-=>8x,0!0?hr.
! Anotar como reaccin positiva, si hay crecimiento visible, y si hay
cambio de de color verde claro a a"ul de prusia y negativa cuando no
hay crecimiento o cambio de coloracin.
! La aparicin de un ro(o carmesF indica $% 5C6 y un color amarillo $% 5!6.
E. Co!i )T2pi#o,3 pese&ta !as si/uie&tes ea##io&es:
! as de caldo .rilla a 00!00.1>8 H 5C6
! %rueba de 'ndol H 5C6
! %rueba de /o(o de 7etilo H 5C6
! %rueba $oges!%ros&auer H 5!6
! %rueba 8itrato H 5!6
IV. REVISION BIBLIOGRAFICA
Co!i(o%es3 Co!i(e#a!es y E. Coli )NM",
El grupo coliforme o grupo coli!aerogenes constituyen un grupo de bacterias que se definen
m#s por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. %ertenecen a
la familia Enterobacteriaceae y se caracteri"an por su capacidad para fermentar la lactosa
con produccin de gas y #cido, m#s o menos r#pidamente, en un periodo de 0? horas y con
una temperatura de incubacin comprendida entre -+!-=>8.
:on bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. )el grupo
coliforme forman varios gneros@
! Escherichia.
! Enterobacter.
! Klebsiella.
! Citrobacter.
:e encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes
tales como el suelo, plantas, c#scara de huevo, etc.
Aunque su especificidad como indicadores no es buena, se suelen usar como Fndice de
contaminacin fecal por@
! :u frecuencia en heces.
! :u f#cil deteccin en el laboratorio.
! :us caracterFsticas generales, en algBn aspecto, a las de los miembros patgenos de la
familia Enterobacteriaceae.
)entro de este grupo, son los coliformes fecales los que tienen significado sanitario y, por
consiguiente, los que m#s nos interesan en el an#lisis microbiolgico de alimentos.
:e considera a los coliformes fecales como presuntos Escherichia coli. :us principales
caracterFsticas son@
! Aptitud para desarrollarse entre 0-.1!01.1>8.
! 8apacidad para crecer en presencia de sales biliares.
! Aacultad para producir indol en agua de peptona.
En general, niveles altos de Enterobacteriaceae indican manipulacin y elaboracin
deficientes de los alimentos.
Escherichia coli es husped constante del intestino del hombre y de los animales de sangre
caliente, deduciendo su presencia en heces. %or su especificidad est# considerado como un
buen Fndice de contaminacin fecal. 4iene el inconveniente de vivir en ambientes
extraentrico, por lo que su presencia en alimentos indica contaminacin reciente.
:e destruye a temperatura de pasteuri"acin y tambin durante su almacenamiento en frFo,
sobre todo a temperatura de congelacin.
Es un germen de forma bacilar, casi siempre mvil, gram negativo. %osee estructura
antignica. La mayorFa de las cepas son inocuas, pero existen algunas que son patgenas para
el hombre.
V. DATOS 4 RESULTADOS :
Co!i(o%es Tota!es
Resu!ta$os e& Tu-os $e Ca!$o BRILLA )"ue-a "esu&ti+a,
Di!u#io&es
56
05
56
07
56
08
Tu-os 5 7 8 5 7 8 5 7 8
Resu!ta$os $e
Ce#i%ie&to e& Tu-os
9 9 9 9 9 9 9 9 0
N:%eo Tu-os
positi+o
8 8 7
Resu!ta$os e& p!a#as #o& A/a ENDO )Co&(i%a#i;& $e Ba#teias Co!i(o%es,
Di!u#io&es
56
05
56
07
56
08
"!a#as 5 7 8 5 7 8 5 7
Co&(i%a#i;& $e
Ce#i%ie&to e& "!a#as
9 9 9 0 9 9 9 0
Resu!ta$os e& !a Ta-!a $e NM"
Los resultados obtenidos a partir de la tabla 27% para coliformes totales nos, indica que
la muestra de agua(ina tiene aproximadamente *.*++ ufc por mililitro.
Co!i(o%es Fe#a!es
Resu!ta$os e& Tu-os $e Ca!$o BRILLA y Ca!$o "epto&a
CALDO BRILLA
Di!u#io&es
56
05
56
07
56
08
Tu-os 5 7 8 5 7 8 5 7
Resu!ta$os $e
Ce#i%ie&to e& Tu-os
9 9 9 0 0 9 0 0
CALDO "E"TONA
Di!u#io&es
56
05
56
07
56
08
Tu-os 5 7 8 5 7 8 5 7
Resu!ta$os $e
Ce#i%ie&to e& Tu-os
9 9 0 0 0 0 0 0
CALDO BRILLA 4 "E"TONA
Di!u#io&es
56
05
56
07
56
08
Tu-os 5 7 8 5 7 8 5 7
Tu-os positi+o $e
#o!i(o%e (e#a!
9 9 0 0 0 0 0 0
N:%eo Tu-os positi+o
$e #o!i(o%e (e#a!
7 6 6
Resu!ta$os e& !a Ta-!a $e NM"
Los resultados obtenidos a partir de la tabla 27% para coliformes fecales nos, indica
que la muestra de agua(ina tiene aproximadamente I ufc por mililitro.
E. Coli
Resu!ta$os e& "!a#as A/a ENDO o Ma# Co&1ey
Di!u#io&es
56
05
56
07
"!a#as 5 7 8 8
Ce#i%ie&to e& "!a#as
9 9 9 9
Resu!ta$os e& "!a#as A/a Nutiti+o
Di!u#io&es
56
05
56
07
"!a#as 5 7 8 8
Ce#i%ie&to e& "!a#as
9 9 9 9
Resu!ta$os e& A/a Nutiti+o I&#!i&a$o y Ca!$o La#tosa$o
AGAR NUTRITIVO INCLINADO
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e
Ce#i%ie&to e& Tu-os
9 9 9 9
CALDO LACTOSADO
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e
Ce#i%ie&to e& Tu-os
9 9 9 9
Co&(i%a#i;& $e "ese&#ia $e Ba#i!os Ga% Ne/ati+os No Espou!a$os a "ati $e
Ca!$o La#tosa$o
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Ba#i!os Ga% Ne/ati+os
No Espou!a$os
9 9 9 9
Resu!ta$os $e !a "ue-a IMVIC a pati $e A/a Nutiti+o I&#!i&a$o
a. "ue-a $e! I&$o! )*o+a#s,
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e Rea##i;&
e& Tu-os
9 9 9 9
b. "ue-a Vo/es0"os1aue
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e Rea##i;&
e& Tu-os
0 0 0 0
c. "ue-a Citato $e So$io
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e Rea##i;&
e& Tu-os
0 9 0 0
d. "ue-a $e! Ro.o $e Meti!o
Di!u#io&es
56
05
56
07
Tu-os 5 7 8 8
Resu!ta$os $e Rea##i;&
e& Tu-os
9 9 9 9
Resu!ta$os Tota!es $e! A&<!isis $e Dete%i&a#i;& $e E. #o!i
Los resultados obtenidos a travs de las pruebas bioquFmicas 5'7$'86 nos indican la
presencia de E. coli en las en los tubos * y - de la dilucin *+
!*
, y en el tubo - de la
dilucin *+
!,
; confirmando a travs de estos resultados la presencia de dicho
microorganismo en la agua(ina.
VI. DISCUSIONES 4 CONCLUSIONES :
! 4odo aquellos alimentos que fueron tratados de forma deficiente, tienen un alto riesgo de
estar contaminados por coliformes; este criterio, ente otros, se toma para reali"ar un
an#lisis de un producto.
! El an#lisis de coliformes se deben reali"ar en productos recientemente procesados, debido
a que estos microorganismos no resisten buen tiempo en medios adversos al de su habitad.
! Los mtodos utili"ados para cultivar estos tipos de microorganismos se basan en la
produccin de gas, aldehidos y #cidos a partir de la lactosa, y en la variacin del p; del
que estos microorganismos provocan al medio de cultivo.
! La reaccin que se da con ro(o de metilo, en la determinacin de E. coli, es causa de la
reduccin del p; 5J0.1 aprox.6 del medio debido a la produccin de #cidos.
VII. RECOMENDACIONES :
o :e debe contar con un determinado nivel de asepsia durante la manipulacin de los
alimentos durante su procesado, ya que la por lo general contaminacin por coliformes se
da por deficiencias en el manipuleo.
o Existen mtodos para eliminar coliformes y otros microorganismos en los alimentos tales
como, por e(emplo, son el tratamiento que se les da a ciertas legumbres y otros vegetales
frescos por medio agua electroli"ada ioni"ada, que es un gran desinfectante econmico
que pueden ser aplicados por pequeGos comerciali"adores de estos productos frescos.
VIII. BIBLIOGRAFIA :
0 M'to$os Mi#o-io!;/i#os= 8.;. 8ollins= pag. *+-, *,I, *-+, *1=, *1?= Edicin *IEI=
Edit. Acribia= Karago"a!EspaGa.
! Mi#o-io!o/2a A!i%e&taia= %ascual Anderson; pag. *=!0+; ,
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Edicin; Edit. )Fa" de
:antos :.A.; ,+++; 7adrid!EspaGa.
! Mi#o-io!o/2a Mo$e&a $e !os A!i%e&tos= 7. Lay; 0
ta
edicin; pag. *?, -E-!-E?; Edit.
Acribia :.A.; Karago"a!EspaGa.
I>. CUESTIONARIO :
*. )escribe brevemente las caracterFsticas taxonmicas, fFsicas, quFmicas, bioquFmicas y de
cultivo de los microorganismos que conforman el grupo coliforme.
Citrobacter
Llamado coliforme intermedio, son bacilos fermentadores lentos de la lactosa; capaces
de utili"ar el citrato como Bnica fuente de carbono. 8 freundii es la especie m#s
predominante en los alimentos. 4odas ellas son citrato positivo, /7 positivo y $%
negativo, mientras que la produccin de 'ndol es variable.
Enterobacter
Estas bacterias entricas 5!6 son tFpicas de otras Enterobacteriaceae con respecto a
necesidades de crecimiento
Escherichia
El m#s indicativo de contaminacin fecal de este y de los dem#s gneros es E. coli,
con frecuencia es deseable determinar su incidencia en una poblacin de coliformes.
:on 'ndol positivo, /7 positivo, y $% y 8itrato negativo 5E. coli del tipo '6; las cepas
del tipo '' son '7$i8 !C!! respectivamente.
Klebsiella
,. )efinir lo que es un microorganismo indicador de la contaminacin fecal, y cual es su
significado en los alimentos.
:on aquellos microorganismos que se emplean para evaluar la salubridad de los alimentos,
estos microorganismos son por lo general de origen intestinal y cumplen algunos criterios
que cumplen los microorganismos indicadores; estos son@
! 4ericamente, las bacterias elegidas deben demostrar especificidad, encontr#ndose
Bnicamente en los medios intestinales.
! )eben encontrarse en cantidades muy grandes en las heces de modo que se encuentran
en las diluciones elevadas.
! )eben estar dotadas de una gran resistencia al medio extraenteral, cuya contaminacin
debe ser elevada.
! )eben permitir una deteccin relativamente f#cil y fiable incluso cuando est#n presentes
en cantidades muy pequeGas.
Estos criterios (untamente con los criterios para indicadores de la inocuidad de los
alimentos los convierten en indicadores de contaminacin fecal.
El significado que tienen estos microorganismos en los alimentos, es determinar si existe
una contaminacin reciente del alimento, el cual puede ocurrir durante el manipuleo de
este o por exposicin a otro agente contaminante.
-. describir la funcin que desempeGan cada uno de los componentes de los medios de
cultivo descritos en la presente pr#ctica.
! Ca!$o BRILLA
El componente m#s importante viene a ser la lactosa, el cual es utili"ado por los
coliformes para producir gas y #cido por medio de la fermentacin de dicho
compuesto.
! A/a Ma# Co&1ey
:e emplea para descubrir bacilos coliformes; fermentan la lactosa produciendo gas,
dando colonias ro(as, los grmenes que no fermentan la lactosa producen, en este
medio, colonias de color rosa p#lido o ligeramente amarillas.
0. M)nde se requieren m#s diluciones en una muestra fresca o en una muestra procesada, y
por quN
%or lo general las muestras procesadas requieren de menor dilucin que las muestras
frescas, debido a que estas han atravesado una serie de tratamientos de disminucin o
eliminacin de la carga microbiana; no obstante, este tipo de determinacin est# su(eto a
criterio de la persona que se dispone a anali"ar la muestra.
1. Exponer todo sobre la influencia de los coliformes, colifecales y E. 8oli en la salud del
hombre.
Algunos de estos microorganismos son patgenos para el hombre, causando grandes
intoxicaciones severas con fiebre, diarrea, dolores abdominales en este.
E. Explicar el fundamento de la actividad de E. 8oli en cada uno de los medios de cultivo
utili"ados en la bioquFmica '7$i8, y por qu de las reacciones coloreadas al adicionar los
respectivos reactivos.
E. 8oli produce m#s #cido en caldo glucosado, lo que se aprecia mediante el indicador
ro(o de metilo, forma indol , produce )ixido de 8arbono en hidrgeno y no puede
aprovechar el 8itrato como fuente Bnica de carbono.