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Universidade Estadual do Rio Grande do Sul

Universidade Universitria em Bento Gonalves


Componente Curricular: Cultura Celular
Prof. Dra. Ana Carolina Tramontina
Acadmica: Thaise Sutil

Relatrio de Aula Prtica de Cultura Celular
1) Descreva como foi realizado o procedimento assptico de cultivo celular.
Para conduzir o procedimento assptico de cultivo celular foi ligada a
capela de fluxo laminar horizontal 15 minutos antes de ser utilizada, os materiais
que seriam utilizados foram previamente esterilizado e separados e colocados
dentro da capela de fluxo laminar, a sala de cultura foi fechado e a luz
ultravioleta foi ligada e desligada aps 20 minutos.
No biotrio se retirou um rato de 30, que posteriormente foi sacrificado
por decapitao, o crebro foi colocado em uma placa de petri e levado para a
sala de cultura onde foi realizada a remoo das estruturas cerebrais de interesse
(hipocampos) e atravs dissociao mecnica com a utilizao de uma pipeta de
Pasteur e um tubo de falcon em soluo tampo DPBS, aps foi adicionada
tripsina e DNAse para a realizao de uma dissociao enzimtica e colocada na
estufa por 15 minutos a 37C, a tripsina aps os 15 minutos foi retirada, retirou
se o sobrenadante com o auxlio de uma pipeta, que foi depositado em outro
tubo, este foi levado a centrifuga a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi
desprezado e as clulas novamente suspensas em meio DMEM contendo 10% de
SFB.
A dissoluo do meio contendo as clulas e retirado 1 l de soluo com
o auxlio de uma pipeta automtica e foi colocado em uma Cmara de Neubauer
e assim contadas as clulas utilizando um microscpio de alta resoluo. Aps
foi semeada em uma 24 poos utilizando uma pipeta automtica, com a
densidade ficando em torno e 200 a 300 mil clulas por poo, os poos foram
completados com meio de cultura, chegando a aproximadamente 500 l por
poo.

2) Por que chamamos a cultura realizada de cultura primria? Qual a
diferena para a cultura secundria e cultura de linhagem?
A cultura realizada chamada de cultura primria porque as clulas
cultivadas foram retiradas diretamente do tecido do hipocampo atravs de
processos de dissociao. A principal diferena entre cultura primria e a
cultura secundria que na cultura primria as clulas cultivadas foram retiradas
diretamente do tecido do hipotlamo, j a cultura secundria feita a partir de
clulas originadas de uma cultura primria, ou seja, aps uma passagem de
clulas de uma cultura primria e para a linhagem de clulas se deve ao fato que
culturas primrias so limitadas permitindo poucas divises (passagens) e as
secundrias se proliferam por um nmero finito, aps as quais iro morrer, a
cultura de linhagem ao contrrio permite um nmero infinito de passagem, assim
como a sua proliferao infinita, pois essas clulas sofreram mutaes
espontneas ou foram tratadas com mutagnicos sofrendo uma transformao ou
tambm conhecido como imortalizao, que est frequentemente associada a
tumorigenicidade ou sofrem modificaes genticas adicionais.
3) Descreve como foi realizado o procedimento de contagem de clulas.

Para realizar o processo de contagem de clulas foi utilizada a cmara de
Neubauer, foi realizada dissoluo de certa quantidade de meio de cultura
contendo as clulas, foi retirado 1 l de meio diludo e foi colocado na cmara
de Neubauer, esta cmara levada at um microscpio eletrnico de alta
resoluo e foi feita observao e contagem de clulas contidas em um dos
quadrantes, levando em considerao as linhas superior e da direta.

4) Diferencie os processos de dissociao mecnica e enzimtica realizados.
Como o mecanismo de ao da tripsina?

O processo de dissociao mecnica como o prprio nome j diz ocorre
atravs de processos mecnicos, ocasionando a degradao da monocamada
fisicamente que relizada com o auxlio de uma pipeta Pasteur, atravs da
movimentos leves de suco da soluo tampo de DPBS contendo o tecido,
mantendo a ponta da pipeta no fundo do tudo de falcon, a repetio do
movimento foi realizada diversas at que fosse observado a dissociao do
tecido.
O processo enzimtico onde ocorre a digesto das protenas de adeso
por proteases especificas ou pode ser realizado atravs da adio da enzima
tripsina no meio contendo as clulas do tecido do hipocampo. A tripsina uma
enzima proteoltica inespecfica que hidrolisa cadeias polipeptdicas nos radicais
lisil-arginil formando terminaes de clivagem, ster e amida. Essa reao
desestrutura a matriz, impossibilitando a ligao dos receptores da superfcie
celular, ligados ao citoesqueleto e matriz, obrigando as clulas a rearranjarem
seu citoesqueleto.

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