Section 2 item 5

Pharmaetudes
CHROMATOGRAPHIE
GENERALITES


Introduction


1 Dfinitions


2 Classification

2.1 Suivant la nature des phases
2.2 Suivant le mcanisme dchange
2.3 Suivant le procd utilis

3 Thorie de base de la chromatographie

3.1 Thorie des plateaux
3.2 Thorie cintique

4 Chromatogramme grandeurs caratristiques
4.1 Grandeurs caractristiques
4.2 Facteur de sparations ou de slectivit !
4.3 Nombre de plateaux thoriques N ! Efficacit (largeurs des pics)
4.4 Rsolution
4.5 Facteur dasymtrie

5 Facteurs affectant la rtention
5.1 Polarit
5.2 Temprature
5.3 Dbit

6 Optimisation en chromatographie
6.1 Influence de ! "#$ %" &'( )* + ,*)-
6.2 Influence de k sur Rs
6.3 Influence de N sur Rs

7 Analyse quantitative
7.1 Etalonnage externe
7.2 Etalonnage interne

8 Domaines dapplications
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Introduction

" Historique :
o 1903 : Tswett spare des pigments vgtaux (chlorophylles) sur une colonne
remplie de CaCO3 (phase stationnaire) + solvant (phase mobile)
o Observation "les composs se sparent en pls zones colores parce qu# des
interactions $tes avec la PS(phase stationnaire) et la PM (phase mobile).


1 Dfinitions

chromatographie =
o Techniques de sparation des constituants dun mlange homogne qui est base
sur un processus de migration diffrentielle, o les analytes se rpartissent en 2
phases, lune mobile par rapport lautre (%s et %m).


Chromatogramme =
o signal enregistr en fct du volume dlution

phase stationnaire(%s) =
phase qui reste en place ds une colonne ou sur une plaque

phase mobile(%m) = luant
phase qui se dplace sur ou travers la %s
elle entrane les constituants analyser

luat =
solution recueillit la sortie de la colonne

la chromato permet lidentification et le dosage des substances

lution=
processus au cours duquel on spare les phases













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2 Classification

2.1 Suivant la nature des phases

chromato en phase liq :
PM=liq PS=solide (LS)
PS=liquide (LL)
PS=rsine changese dion
PS=Gel

chromato en phase gazeuse :
PM=gaz PS =solide (GS)
PS =liquide (GL)


2.2 Suivant le mcanisme dchange
" Coefficient de distribution Kd du solut entre %s et %m :
Kd =Cs/Cm
=conc du solut ds %s/conc ds %m

cest parce que les Kd sont $ que les substances se sparent

" Chromatographie :
o dabsorption (L/S)
o de partage (L/L)
o dchange dion
o dappariement dion
o exclusion diffusion ou exclusion strique


2.3 Suivant le procd utilis
" Selon la prsentation de la PS :
o Colonne : CPG, HPLC,
o Planaire :%s de faible paisseur ,gde surface"papier ou couche mince (CCM)

" Selon les modalits de migration de la %m :
o chromato dlution :
"on poursuit llution jusqu ce que les soluts soient entrans en dehors de la %s
o dveloppement :
"llution des substances est telle que les substances demeurent sur %s et sont localises
sur %s






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3 Thorie de base de la chromatographie
Fig 5

3.1 Thorie des plateaux

" On assimile la colonne chromato une colonne distiller de longueur L
" Cette colonne est constitue de qlq plateaux fictifs appels plateaux thoriques
" Une colonne est constitue de N plateaux thoriques (de mme hauteur)
" La taille des plateaux, H, est appelle Hauteur quivalente 1 plateau thorique (HEPT)

HEPT = L/N (1)

" Chaque plateau contient 1/Neme de la PM et de la PS
" Ds chaque plateau, il y aurait un eq parfait Kd vs [solut] ds %s et %m

Kd=Cs/Cm

64 mg ds colonne plateau 2 plateau 3 plateau 4
T1 "32 ds %s 32 ds %m
T2 " 16 ds %s 16 ds %m
T3 " 8 ds %s 8 ds %m.

"pic de forme gaussienne

chaque plateau est un disque fictif ds lequel on considre quil y a eq entre %m et %s
au dpart ,le solut se partage ds le 1
er
plateau entre %s et %m en fct de Kd
au 2
me
eq ,puisque la %m circule en continu ,leq est rompu
%m qui contenait le solut descend vers 2
me
plateau ,se fixe sur %s en respectant le partage de
Kd
2 substances qui ont des Kd identiques, se rpartissent diffremment " sparation

chaque tape correspond un nouvel eq
+ # deq meilleure sera la sparation
+ # de plateau

rsultat "pic de forme gaussienne
cette thorie est insuffisante car :
elle ne tient pas compte de la vitesse %m/%s

3.2 Thorie cintique
dispersion des pics ds la colonne
"phno de diffusion
dispersion fct de la vitesse de la %m
les pics stablissent mesure quils descendent ds la colonne
Eq de Van Deemter pour CPG,
tendue par Knox la CLHP

HEPT = A + B/u + C*u (CPG) (2)
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HEPT = A.&
1/3
+ B/& + C*& (HPLC)
H :hauteur quivalente 1 plateau thorique
H=L/N =longueur de la colonne /nbre de plateau

+ la colonne est effi ,+ # de plateau (N gd) + la hauteur H est faible

cette quation montre que ltroitesse des pics est lie lcoulement de la %m

u : vitesse dcoulement de %m =L/To

A : terme de remplissage (diffusion turbulente)
Effet de chemin multiple (diffusion dEddy)
+ effet de diffusion latrale (dispersion de flux)
les %s tant constitues de grains irrgulier ,le remplissage sera irrgulier
et les m* peuvent emprunter des chemins $ts.
minimiser si particules de formes rgulires et ayant ttes la mme taille (rare)

diffusion latrale :les soluts vont dun chemin de flux lautre

B : terme de diffusion longitudinale
=2'Dm
Dm :coefficient de diffusion de la m* de solut ds %m
Etalement des m* de solut ds la %m mme si #pas dinfluence externe
Dm est + importante en CPG quen CPL

' : facteur de tortuosit li la granulomtrie et la rgularit du remplissage

C : terme de transfert de masse
Ingalit de passage dune m* de solut dune phase ds lautre
Grain de %s constitu de pores ctnt %m stagnante
Diffusion selon pntration des m* vitesse $tes

! Ces termes A B et C expliquent que les pics soient + larges
Llargissement dpd de la vitesse de la %m

! H=f(u) reprsentation graphique "hyperbole
(dispersion )
si H lev pic large Au minimum H, lefficacit de la colonne est maximale.
Uo : dbit pour lequel les pics sont les + troits possible










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4 Chromatogramme grandeurs caratristiques

Fig 3 & 4

" Si dtecteur la sortie de la colonne, on peut enregistrer le signal en fct du tps :
o signaux =pics
o lensemble=chromatogramme

" Les pics ont une forme, dans le cas idal, gaussienne (4)
" La substance lue est localise ds une tranche faible de la colonne avec une valeur Yo
"2 pts dinflexion E et F
situs 60.7% de la hauteur du pic
caractriss par 2( =distance entre E et F (cart type)
largeur :)=2.35(
largeur la base: *=4(

" On caractrise un chromatogramme par certains paramtres impt :
o T
0
= temps mort
o Tr = temps de rtention
o h = Hauteur du pic
o * = Largeur du pic (intersection des tangentes des pt dinflexion et des abscisses)
o ) = largeur du pic mi-hauteur














4.1 Grandeurs caractristiques
Tr tps de rtention
Vr volume de rtention
K facteur de capacit , de rtention

Tr brut : tps coul depuis linjection du compos ds la colonne et le max du pic
chromatographique (min. ; sec. ;10
me
de sec ;100
me
de sec.)

To Tps mort =tps que mettrait un compos non retenu pour arriver au dtecteur
Tr tps de rtention corrig ou rduit

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Vr brut : volume de %m quil faut faire passer ds la colonne pour amener le pic sa
conc max ds le dtecteur

K facteur de capacit, de rtention
K=(Tr1 To)/To = tps de rtention rduit /to
!rapport molaire entre qtit de solut ds la %s et ds la %m
!tps pass par le solut ds %s / tps ds %m
K :
En CLHP doit tre compris entre 1 et 10
Dpd du couple %s/%m ,de la T (action sur la viscosit %m)
En CPG doit tre compris entre 1 et 20
dpd de la nature de la %s

K ne dpd pas : de la longueur de la colonne
Du dbit de la %m

4.2 Facteur de sparations ou de slectivit !
mesure le potentiel sparer 2 composs
(cela ne suffit pas pour savoir si sparation finale possible)

slectivit de 1 2 :
!1.2 = (Tr2-To)/(Tr1-To) = K2/K1

reli la sparation au sommet des 2 pics
+ les pics sont spars ,+ ! est gd

2 colonnes qui prsentent la mme slectivit peuvent sparer diffremment les mmes
produits (largeurs des pics $tes)

Slectivit=paramtre trs important quil faut ajuster au dbut de loptimisation dune
mthode

Elle dpend :
En CLHP du couple %s/%m
En CPG de %s et de T du four, %m a un rle passif

Elle ne dpd pas de la granulomtrie ni du dbit de la %m

4.3 Nombre de plateaux thoriques N ! Efficacit (largeurs des pics)

mesure de la dispersion du pic
colonne efficace si pics troits
nbre de plateaux thoriques :N=16(Tr/*)! =5.54(Tr/))

N varie en fct de la mthode
*=largeur du pic la base, obtenue par extrapolation des tangentes aux points dinflexion
)=largeur du pic mi-hauteur
"+ un pic est troit ,+ * et ) sont faibles ,+ le nbre de plateau thorique N est important
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" N dpend :
o de la longueur de la colonne
o de la granulomtrie ! plus les grains sont petits, + la perte de charge est impt
o de lpaisseur du film de %s
"film sur paroi ou sur support
"si film pais ,le partage est + lent , les changes sont + lents ,les pics sont + larges
o de la T (CPG) et de la viscosit du solvant (CLHP)
o du dbit de gaz vecteur (voir de la courbe de Van Deemter
o du type de compos

4.4 Rsolution

Rs= 2(Tr2-Tr1)/(*1+*2) = 1.18 (Tr2-Tr1)/()1+)2) = 1/4 [! -1/!][K2/(1+K2)]x N2


Mesure de la qualit de la sparation
Rs doit tre > 1,5 pour que 2 cp soit spars.

4.5 Facteur dasymtrie
As=Y /X ou facteur de trane

On mesure 10% du pic le rapport des distances Y/X
A 0.05% on mesure As=*/2f
Qd mesure parfaite *=2f "As=1




















5 Facteurs affectant la rtention
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En CPG : un compos est retenu qd interaction %s
En CLHP : interaction solut /%s ; solut /%m ; %s/%m
La rtention dpd : polarit ,T ,dbit

5.1 Polarit
=capacit de donner $tes actions =rsultante de $tes interactions

" Interactions :
o Forces coulombiennes :
interactions lectrostatiques qui interviennent pour force ionises
o Interaction entre diple permanent et diple induit
atomes ou ion charg qd approche autre m*"induit formation dun diple
o Force de dispersion ou de London
prsentes ds ttes les m*
attraction entre 2 diples instantane
ds ttes les m* # mvmts des e- autour du noyau "responsable des interactions hydrophobes
(apolaires)

nergies des liaisons Kj/mol

dispersion 5 20
diple permanent /diple induit 8 25
diple permanent/diple permanent(LH) 25 40
liaisons ioniques 250 1050
ces forces sont trs solides

une m* polaire attire tjrs 1 m* polaire ,
une m* apolaire attire une m* polaire ou moyennement polaire

important : une polarit idq peut faire intervenir des forces dinteraction $tes "possibilit de
sparation

5.2 Temprature
affecte les quilibres
Kd est fct de T
Rle + important en CPG quen CLHP

Si T+ ,Tr,

5.3 Dbit (P)
Tr , qd dbit +




6 Optimisation en chromatographie
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Optimiser =avoir la rsolution que lon souhaite avec un tps min danalyse

Rs=1/4 [! -1/!][K2/(1+K2)]x N2

La rsolution est fct de
! (slectivit)
2 : le plateau le + retenu
"il faut une slectivit min pour quil y ait rsolution

N2 (largeur des pics)

6.1 Influence de ! "#$ %" &'( )* + ,*)-
!=K2/K1 variation de Rs avec !-1/!

1 0
1.1 0.09
1.2 0.16
1.5 0.33 (x3.5)
2.0 0.50
2.4 0.58
3.0 0.66
4.0 0.75
5.0 0.80
6.0 0..83 variation bcp gde

var Rs

1


0.5




0 1 2 3 4 5 !

! est un paramtre trs important quil faut ajuster au dbut de loptimisation dune
mthode


6.2 Influence de K sur Rs (avec ! et N cte)
K2 variation de Rs avec K2 /(1+K2)

0 0
0.1 0.09
0.2 0.16
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0.3 0.23
0.5 0.33
1.0 0.50
2.0 0.67
3.0 0.75
4.0 0.83
10.0 0.90
var Rs




0.5



0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K2

Qd K2 dble au dbut Rs + moins rapidement quavec !


6.3 Influence de N sur Rs (avec ! et K cte)
Rs varie avec N2
Si la longueur de la colonne est x2 "N=x2 ,Rs= x1.4 (2) ,tandis que Tr=x2


7 Analyse quantitative (+exo)

Comparaison aires (ou hauteurs) des pics de lech inconnu / gamme talon de lanalyte

7.1 Etalonnage externe

Gamme dtalonnage (5 conc min)



5 injections successives

mesure cuve de lanalyte
trace dte dtalonnage cuve=f(qtit) ou f(c )

A x




qtit

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qtit = (c) x v

mesure de laire analyte ds lech
satisfaisant si volume inject trs rptable ,sinon talonnage interne

7.2 Etalonnage interne





mesure des aires analytes et Ei ds talon ;
calcul du rapport des aires analyte/Ei
trac de la dte

Aire x/aire Ei





Cx/CEi
Mesure des aires analytes et Ei ds lech :rapport des aires

"permet de saffranchir des variations de volumes injects
surtout ut en CPG car vol injects ( la seringue) faibles (de 1 5 "L)
vs CLHP 20 "l

en lectrophorse capillaire ,les volumes injects sont de 2 20 "L

ut en CLHP qd travaille avec matrice complexe

"permet aussi de tenir compte des pertes lextraction ds les ech complexes analyser

ds un ech bio , le labo de $ organique va prendre un prod de la mme famille chimique
que lanalyte.


7.3 Mthodes des ajouts doss
(voir spectro UV)


NB : analyse qualitative via le tr pour les chantillons simples (sinon via dtecteur UV,
SM)




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8 Domaines dapplications

" CPG :
o applicable aux substances volatiles ou volatilisables par lvation de T
o non applicable aux substances ioniques ou de MM>300 car non volatiles
o non applicable aux substances thermolabiles
o mais existence dun dtecteur universel de fble cot (ionisation de flamme )

" CLHP :
o ts types de substances (ioniques ou non ,thermolabiles ou non PM)
o cdt minimun : compos soluble ds PM
o manque dtecteur universel de fble cot ( # spectromtre de masse mais coteux)