Mara Jos Gonzlez

Gabriel Lassabe
Santiago Mansilla
Es una hormona glucoproteica
estimuladora de la produccin de
eritrocitos, por tanto es de valor en el
tratamiento de la anemia en casos de
insuficiencia renal crnica
Consiste de 166 amino cidos, con 3
potenciales sitios de N-glicosilacin y 1
de O-glicosilacin
40% de su peso son carbohidratos
Clonado a partir de clulas de rin
humanas
Eritropoyetina Humana (HuEPO)
Prohibido su uso
como mtodo de
dopaje en
actividades
deportivas.
Aumenta
rendimiento fsico.
Eritropoyetina Humana (HuEPO)
Lance Armstrong: se le retiraron siete ttulos del
Tour de France por uso de productos dopantes,
entre los cuales se encontraba el EPO
Rol de las glicosilaciones:
Role of antennary structure of N-linked sugar chains in renal
handling of recombinant human erythropoietin T Misaizu, S
Matsuki, TW Strickland, M Takeuchi, A Kobata, and S Takasaki,
December 1, 1995; Blood: 86 (11)
Se sugiere que las cadenas glucdicas poseen un
rol importante en el mantenimiento de las
concentraciones altas en plasma, lo que garantiza su
efectiva transferencia a los rganos y la estimulacin
de clulas progenitoras

Eritropoyetina Humana (HuEPO)
Actualmente la rHuEPO es producida por clulas de ovarios
de hamsters chinos, lo cual resulta costoso y poco eficiente
Se ha intentado expresar en procariotas, pero carecen de
las glicosilaciones necesarias, mientras que al expresarlo en
levaduras es hiperglicosilada.
Eritropoyetina Humana (HuEPO)
Hongo filamentoso del phylum
ascomycota
Utilizado industrialmente para la
produccin de enzimas hidrolticas
(aprox. 40 g/L)
Emplea modificaciones
postraduccionales similares a las de los
mamferos
Trichoderma reesei
En estudios anteriores de los mismos autores, se
generaron promotores optimizados del gen de la
cellobiohydrolase 1 (cbh1).
Tambin se haba obtenido una cepa (T108) que
posee el gen de la n-acetylglucosaminyl transferase,
para sintetizar n-glicanos como los de los mamferos.
Trichoderma reesei
Materiales y mtodos

T. reesei RutC-30 M3- cepa carente de
proteasas (26% con respecto a la normal)
T. reesei T108, cepa RutC-30M3 con gen
humano N-acetil glucosaminyl transferasa I
E. coli DH5, cepa para construccin y
propagacin de vectores
Cepas T. reesei utilizadas para la expresin heterloga del
gen HuEPO
Construccin del vector para la expresin
de HuEPO en T. reesei
Amp r= resistencia ampicilina
Ori= Origen de replicacin del plsmido
Epo= gen Erytropoyetina Humana
Pcbh1= Promotor de gen cellobiohydrolasa I (cbh) inducible por lactosa y celulosa.
Incluye secuencia seal para exportacin
Tcbh1= secuencia de finalizacin de transcripcin correspondiente al gen cbh
HindIII, BcoRI, XhoI= sitios de restriccin

Primers diseados para las construcciones
Primers CSP para amplificacin de secuencia seal cbh 1 con sitio XhoI al extremo 5`
(51 pb)
X
h
o
I

SScbh 51 pb
PCR 1
Primers diseados para las construcciones
Primers EPO para amplificacin de secuencia epo a partir de cDNA (501 pb)
PCR 2
SScbh epo gen 501 pb
PCR 1
PCR 2
X
h
o
I

SScbh 51 pb SScbh epo gen 501 pb
PCR 3
epo gen 501 pb
X
h
o
I

SScbh 51 pb
Primers diseados para las construcciones
Primers TCT para amplificacin de secuencia terminadora cbh 1 con sitio EcoRI en 3`
(790 pb)
PCR 4
Terminador cbh (790 pb)
epo gen
E
c
o
R
I

PCR 1
PCR 2
PCR 4
PCR 3
X
h
o
I

SScbh 51 pb SScbh epo gen 501 pb
epo gen 501 pb
X
h
o
I

SScbh 51 pb Terminador cbh (790 pb)
epo gen
E
c
o
R
I

PCR 5
epo gen 501 pb
X
h
o
I

SScbh 51 pb Terminador cbh (790 pb)
E
c
o
R
I

Transformacin del vector en E. coli para conservacin
y amplificacin del vector

Secuenciacin para confirmar casette en vector de
expresin
Mtodo de transformacin en
protoplastos de T. reesei
Los protoplastos son extrados de las hifas miceliares a partir
de degradacin de las paredes mediante el uso de enzimas
Co-transformacin en protoplastos de
T. reesei
Resistencia a hygromycina
Transformacin de protoplastos en CaCl2 y PEG
Transformantes fueron plaqueadas en medio mnimo con hygromycina,
crecimiento a 28C durante 5 das
Micelios aislados fueron sometidos a 2 y 3 rondas de seleccin
Clones estables con el gen incorporado en su ADNg se dejan
esporular en placas de dextrosa de papa para conservar

Extraccin de ADN
Extraccin de ADN fenol/cloroformo a partir
de medio de cultivo lquido
Anlisis moleculares de los clones
recombinantes
PCR del gen Hu-epo (primers EPOf y EPOr) y del
gen Hu-epo con secuencia seal (primers CSPf y
EPOr). Corrida en gel de agarosa para evaluar los
productos
DOT BLOT. Hibridacin del producto de PCR
(marcado con DIG) con el gen HuEPO en el ADNg
del hongo.
Anlisis de la expresin gnica
Induccin de la expresin de HuEPO en medio
lquido con el inductor Lactosa


Evaluacin de los transcriptos mediante RT-PCR
Extraccin de ARN rompiendo micelios por congelado y descongelado
Retro-transcripcion con TR realizada con primer reverse EPOr y 1ug de ARN molde.
Amplificacin de cDNA mediante PCR con fEPO y rEPO
Corrida en geles de agarosa
Evaluacin de protenas mediante SDS-PAGE y western
Blot
Los sobrenadantes de cultivo fueron concentrados y se analiz la presencia de la protena de inters
en una electroforsis desnaturalizante (SDS-PAGE) y tincin con Coomassie
Por otro lado los geles fueron transferidos membrana nitrocelulosa para realizar Western Blot
utilizando suero policlonal especifico para la HuEPO
Cuantificacin proteica por mtodo de Bradford
Luego de la transformacin , se confirm la insercin
del cassette de expresin en el cromosoma de T.
reesei mediante PCR.
Se trabaj con las cepas recombinantes T47 y T112.
Amplificacin del gen epo con primers EPO-F/EPO-R
Amplificacin del fragmento fusionado: Secuencia
seal cbh1 y gen epo con primers CSP-F/ EPO-R

Resultados y discusin
Resultados y discusin
P, vector pTrCBH-EPO
N, T. reesei wt
1, Amplificacin gen epo de T47
2, Amplificacin gen epo de T112
3, Amplificacin regin de
fusin de T47
4, Amplificacin regin de
fusin de T112
M, marcador de peso molecular
Ensayo de dot blot de ADN, en bsqueda de gen epo.
Se marca la sonda con DIG.

Resultados y discusin
P, vector pTrCBH-EPO
1, Seal de hibridacin de RutC-30 M3
2, Seal de hibridacin de T47
3, Seal de hibridacin de T108
4, Seal de hibridacin de T112
Deteccin de la expresin de HuEPO en T. reesei
mediante RT-PCR

Resultados y discusin
1, transformante T47
2, T. reesei RutC-30 M3
3, transformante T112
4, T. reesei T108
M, Marcador de peso
molecular.
Secrecin de rHuEPO en diferentes cepas de T. reesei
SDS-PAGE de los sobrenadantes de los cultivos
inducidos por lactosa.
Mximo nivel de expresin a las 48hs.
El nivel de expresin alcanz aprox. 97 mg/L para T47
y 46 mg/L para T112.
Posterior confirmacin por western blot.
Resultados y discusin
Resultados y discusin
M, marcador de peso molecular de
protenas en kDa
1, protenas extracelulares de T47 sin
inducir
2, protenas extracelulares de RutC-
30 M3 inducido
3, protenas extracelulares de T47
inducido
4, protenas extracelulares de T108
inducido
5, protenas extracelulares de T112
inducido
Diferencias en el tamao de las protenas heterologas
rHuEPO en T47 es de aprox. 28 kDa y en T112 es de
32kD.
Esto indicara una diferencia en la glicosilacin de las
protenas en cada cepa
Resultados y discusin
1 y 2, protenas extracelulares de RutC-30 M3 y
T47 inducidos
3 y 4, protenas extracelulares de T108 y T112
inducidos
Tratamiento con N-glicosidasa F (PNGasa F) reduce la
masa molecular de rHuEPO a 20 kDa en ambos
transformantes T47 y T112.

Resultados y discusin
La PNGasa F hidroliza el enlace N-glicosidico
entre GlcNAc y la Asn.
El nuevo promotor cbh1 mejor el nivel de expresin
de genes heterlogos en trabajos previos.
El principal problema en la secrecin de protenas
heterlogas es el clivaje para liberar al medio a la
protena deseada.
La solucin encontrada fue la fusin del pptido seal
CBH1 para la correcta secrecin de la molcula.

Resultados y discusin
Utilidad de cepas con una actividad proteoltica
reducida.
rHuEPO en cepas de T. reesei T47 con una deficiencia
en proteasas, se encontr una cantidad mayor de la
protena en el sobrenadante.
Por lo tanto se logr aumentar la produccin de
rHuEPO (46 a 97 mg/L) que la producida en otros
huspedes no mamferos.
Resultados y discusin
Muchos hongos filamentosos pueden sintetizar
cadenas cortas de N-glicanos y O-glicanos similares a
las de mamferos.
HuEPO contiene 3 complejos de N-glicanos y uno de
O-glicanos, que representan el 40% de la masa total
de la protena (32~39 kDa)
En este trabajo se encontr dos posibles estrategias
de modificacin postraduccional, que genera dos
protenas con distinto tamao dependiendo de la
cepa.
Resultados y discusin
Se aument el nivel de rHuEPO expresada en las dos
cepas transformadas estudiadas.
Se logr la optimizacin del sistema de expresin,
siendo importante el pptido seal para la correcta
secrecin de la protena.
Se demostr el potencial de T. reesei como una
plataforma alternativa para la expresin extracelular
de glicoprotenas humanas recombinantes.
Conclusiones
GRACIAS!