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LIOFILIZACION

INTRODUCCION

La conservacin de productos biolgicos o de sustancias destinadas a la
alimentacin de origen animal o vegetal, fueron y siguen siendo hoy un problema
de de difcil resolucin.
La extrema complejidad de estos productos y su grado de hidratacin elevados,
los hacen muy sensibles a las condiciones externas.
El conocimiento de las propiedades del fri como preservador, abri nuevos
horizontes, teniendo en cuenta que la actividad bacteriana era frenada en su
desarrollo, aunque la actividad enzimatica en muchos casos presente y los
fenmenos oxidativos de las fracciones susceptibles, permiten solo una corta
preservacin.
Se puede acrecentar la estabilidad transformando el agua en hielo, es decir
congelando, fenmeno que disminuye la actividad enzimtica, pero an los
fenmenos oxidativos continan modificando las caractersticas del producto.
Auque la congelacin nos asegura una conservacin de larga duracin en la
mayora de los productos alterables, la provisin continua de fri es un problema
tcnico de muy difcil resolucin.
Buena parte de las reacciones qumicas relacionadas con la vida y con la
degradacin de sustratos, transcurren en solucin acuosa, el reducir la actividad
del agua las retarda hasta detenerlas.
La mejor solucin es la eliminacin total del agua contenida en el espcimen, la
desecacin directa es impracticable por lo tanto se recurre a la criodesecacin al
vaci liofilizacin, que no es ms que la extraccin de agua de un producto
previamente congelado, en forma de vapor; es decir se produce el fenmeno
denominado sublimacin donde el hielo en estado slido en condiciones de baja
presin pasa a vapor sin pasar por el estado liquido intermedio.
Al producto obtenido se lo llam lifilo ( derivado de lio: Solvente philo: amante
muy afn) Nombre que expresa su propiedad de muy fcil hidratacin y
reintegracin a su estado original.
Por derivacin del trmino liofilo se pasa a liofilizacin como mtodo para
obtenerlo y liofilizar, liofilizador, liofilizado etc.
El proceso comienza con la fase de congelacin continua con la fase de secado
primario y finaliza con el secado secundario.

LOS FENOMENOS FISICOS DE LA CONGELACION

Todos los cuerpos naturales poseen agua ligada en diversos grados alas
estructuras moleculares de dichos cuerpos.
Existe un agua libre que forma parte del espacio intercelular es decir en donde
estn suspendidos los microorganismos las clulas que pueden ser extrada
fcilmente sin desnaturalizacin.
Hay otra agua denominada de imbibicin ms o menos ligada a los complejos
intermoleculares, cuya extraccin puede ocasionar fenmenos de alteracin
irreversibles.
Finalmente el agua de constitucin formando parte de la estructura coloidal y que
es indispensable para mantener la estructura, esta es muy difcil de extraer, no se
congela jams y permanece al estado lquido finamente dividida.



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CRISTALIZACION DEL AGUA

A 0 C y a una presin de 760 mm de Hg el agua pura esta en estado lquido.
Debajo de esta temperatura y en presencia a de grmenes ncleos cristalinos el
agua se congela con liberacin de calor para cederlo al hielo, que cristaliza en
forma hexagonal birrefringente.
El agua puede estar debajo de 0 C sin solidificarse, fenmeno denominado
subfusin y se produce principalmente en los sistemas capilares y en cualquier
otro sistema donde las molculas esten sin libertad de movimientos.
En este estado el sistema es sumamente inestable y un choque mecnico la
introduccin de una molcula extraa puede provocar la cristalizacin inmediata.
El grado de cristalizacin y la talla de los cristales depende de la rapidez de la
congelacin.
Si la congelacin es rpida se forman numerosos cristales de pequeo tamao si
se congela a muy baja temperatura y muy rpido no hay cristalizacin y el agua
se congela en un solo bloque transparente, fenmeno denominado vitrificacin.
Si la congelacin es lenta, se forman pocos centros cristalinos y los cristales son
gruesos e irregulares.
La presencia de sales provocan dos cambios fundamentales: La forma de la
cristalizacin y la rapidez en la formacin de los mismos, que es
considerablemente disminuida.

FORMA DE CRISTALIZACION
Supongamos una solucin de Cl Na al 1%, al enfriar esta solucin por debajo de
0 C comienza la cristalizacin que avanza y el agua tiende a cristalizarse en
estado puro.
A medida que los cristales crecen, el agua intersticial disminuye mientras la
concentracin salina aumenta.
A -6 C el 90% del agua es hielo y el 10% de agua restante contiene 10% de
Cl Na es decir diez veces la concentracin inicial.
A -21 C esta agua residual se congela en forma brusca y se forma una mezcla
ntima de cristales de hielo y de Cl Na.
Este momento se denomina punto eutctico y la temperatura se llama
temperatura de eutexia que varia con la composicin de las distintas soluciones
en funcin de la concentracin salina de estas, por lo tanto no puede ser fijada
arbitrariamente.

RAPIDEZ DE CRISTALIZACION
La concentracin de sales afecta la rapidez de congelacin.
Algunos grupos orgnicos como el glicerol pueden bajar cincuenta veces la
velocidad de congelacin y paralelamente a esta disminucin la talla de los
cristales disminuye tambin.
Como vimos hasta ahora, a medida que la temperatura disminuye comienza la
formacin de cristales de hielo que dependiendo de la velocidad de disminucin
podia ser de mayor menor tamao y podan producir dao mecnico
traumtico a las clulas.
Paralelamente el aumento de dichos cristales es acompaado con una
disminucin de la cantidad de agua en estado lquido que acrecienta su tonicidad.
Como consecuencia de esto el material biolgico adems de dao traumtico por
la cristalizacin , sufre un choque osmtico de importancia como consecuencia de
la formacin de soluciones hipertnicas que ocasionan fenmenos de exosmosis
que llegan a desnaturalizar el material antes de llegar al punto de eutexia, es decir


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el momento en que en el sistema no existe agua en estado lquido, para evitar la
formacin de soluciones hipertnicas debemos tratar de llegar lo ms rpido
posible a la temperatura de eutexia del sistema a liofilizar.
Existen varios mtodos para medir la temperatura de eutexia, uno de los mejores
es el estudio de la conductividad elctrica de Greaves.
El material congelado se presenta como una esponja de hielo, donde en los
espacios interiores de dicho tramado esponjoso circula agua en estado lquido
con alta concentracin de sales, estas venas lquidas hipertnicas conducen
mucho mejor la electricidad que el hielo formado.
Cuando la resistencia se eleva bruscamente es posible admitir que todo el
material se ha solidificado.
Esto determina el punto de eutexia que varia con cada sistema y que en el caso
de la solucion de Cl Na al 1% es de -21 C.

CONCLUSION
1) Debe realizarse la derminacin del punto de eutexia.
2) Debe enfriarse la sustancia a temperatura bastante por debajo de este para
asegurar la cristalizacin total de la solucin, evitando fenmenos de fusin
recristalizacion que produciran dao mecnico al sistema, la velocidad de
enfriamiento debe ser lo suficientemente rpida para evitar las soluciones
hipertnicas responsables del dao osmtico.
3) En muchos casos el punto de eutexia no esta bien definido para un
determinado sistema o bien no es tcnicamente posible determinarlo en la
rutina diaria del laboratorio, para estos casos se considera que existe una
zona de eutexia situada entre los -35 C y -40 C donde nos aseguramos que
no existir agua libre sin congelar independientemente del sistema con que
trabajemos.
La congelacin se puede llevar a cabo dentro de la cmara del equipo liofilizador
bien realizar el pre-congelamiento fuera de este, utilizando por ejemplo equipos
de fro con alcohol etlico a -50 C, recipientes con alcohol y hielo seco alcohol
isoproplico enfriado a -70 C.
Con el objeto de obtener un producto congelado que presente mayor superficie
de sublimacin, se emplean las tcnicas de congelamiento por rotacin en un eje
horizontal es decir que si se desea tener una sublimacin rpida es conveniente
que el producto presente una superficie grande y poco espesor.
Cuando se trata de liofilizar productos muy diluidos por ejemplo vacunas, es
necesario agregar algunas sustancias que adems de actuar como
crioprotectores, dan al mismo una determinada estructura evitando que la
pastilla se derrumbe durante el proceso de liofilizacin.
Las ms frecuentemente utilizadas son la leche descremada al 10% ( Salvo para
el caso de liofilizacin de cepas que van a ser utilizadas en un medios de cultivo
qumicamente definidos) Sacarosa, manitol, glutamato de sodio, etc.












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SECADO PRIMARIO

El material congelado se somete a la accin del vaci producindose la
sublimacin.
En esta etapa del proceso son dos los puntos crticos que deben considerarse
con especial atencin.
En primer lugar hay que tener en cuenta un fenmeno de transferencia trmica,
ya que la sublimacin es un fenmeno endotrmico es necesario durante el
proceso proporcionar calor a la masa congelada.
Si este calentamiento no se efecta, se producir un sobre enfriamiento de
esta, dificultndose la sublimacin. Este calor aportado es necesario para
compensar el enfriamiento producido por el vapor de hielo y la temperatura de
equilibrio recibe el nombre de temperatura de desecacin.
La desecacin se producir desde la superficie del producto expuesta al vaco
hacia abajo.
El otro punto crtico a tener en cuenta lo constituye la transferencia de masa y se
refiere a la eliminacin del vapor de agua que se produce en la sublimacin.
Si se considera que a la presin de 0.1 Torr un gramo de agua ocupa un volumen
de 9.500 litros, se comprender la magnitud del problema que significa remover
del sistema esta enorme cantidad de vapor de agua.
Ambos problemas inciden en la velocidad del proceso.
Para que la sublimacin se produzca en buenas condiciones todo el material
debe estar congelado, por lo tanto al aportar calor durante el proceso es
importante evitar que se funda la masa, lo que podra producir alteraciones
debidas a la formacin de soluciones hipertnicas y a la presencia de liquido
intersticial que por accin del vaci, ebulle bruscamente con produccin de
abundante espuma la cual deforma la pastilla estructuralmente, fenmeno
denominado puffing que puede llevar al deterioro del producto.
Se comprender entonces la importancia de conocer la temperatura hasta la
cual se puede calentar el material sin que se funda, es decir la temperatura del
producto no debe pasar el punto de eutexia en todo el proceso de secado
primario.
El peligro se presenta no a nivel de del producto desecado, enfriado
constantemente por el vapor de hielo que lo atraviesa a travs de la interfase
producto del secado-hielo, si no a nivel de la zona de contacto del hielo con la
placa del equipo liofilizador donde hay un intercambio constante de temperatura
entre el frasco con el producto congelado y el entorno. ( Dijimos que para que el
fenmeno de sublimacin exista debe haber un equilibrio entre el fro que sede
el vapor de hielo al producto que se esta desecando y el calor que el hielo debe
entregar al vapor para que este se forme, este calor proviene de la placa del
equipo de liofilizacin si esta no sede calor no hay sublimacin, por lo tanto no
es posible la desecacin)
El registro de la temperatura de la masa de efecta introduciendo una zonda
termomtrica en el interior de uno de los recipientes con el producto a liofilizar.
La sublimacin se llevara a cabo en mejores condiciones si la masa sublima
desde una superficie amplia y de poco espesor. De all que la tcnica de
congelamiento del producto adquiera gran relevancia.
La remocin del agua sublimada puede efectuarse por diversos procedimientos.
Algunos autores han empleado bombas rotativas y de difusin para este objeto.
Sin embargo los mtodos mas usados son el empleo de agentes desecantes
qumicos y el uso de condensadores. Los desecantes qumicos tienen la
capacidad de combinarse con el agua o de adsorberla.


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El ms utilizado es el pentxido de fsforo que forma con el agua cido meta
fosfrico.
Se emplea en equipos de laboratorio para liofilizar pequeas cantidades. Resulta
poco econmico para equipos industriales, en estos el mtodo ms
frecuentemente usado para captar el vapor de agua consiste en el empleo de
condensadores, sobre los cuales el vapor de agua se deposita al estado slido.
En equipos pequeos las bajas temperaturas se pueden obtener con nitrgeno
lquido con mezclas frigorficas de hielo seco y alcohol.
En los liofilizadores de uso industrial se emplean equipos frigorficos de
compresin mecnica.
Estos funcionan expandiendo gases frigorgenos en serpentines, produciendo de
esta manera el descenso de la temperatura.
Las temperaturas que se alcanzan con estos equipos son de entre -60 y 70 C.
Como agentes frigorcenos se emplean hidrocarburos fluorados y clorados del
tipo de los freones.
Para que el vapor de agua se transfiera desde la masa que se liofiliza hasta el
condensador, es necesario que la tensin de vapor de hielo del condensador sea
menor que la de la masa del producto que se liofiliza. Por esta razn se debe
mantener el condensador a una temperatura de alrededor de 20 C inferior al del
producto.

SECADO SECUNDARIO

La terminacin del secado primario corresponde al momento en que se ha
sublimado la ltima porcin de hielo.
El final de la sublimacin se puede apreciar por una elevacin de la temperatura
del producto.
Como durante el proceso, generalmente se aplica calor, la mayora de los
equipos tienen un sistema que permite fijar la temperatura y mantenerla
automticamente.
Esta temperatura se establece para cada producto, dependiendo de su
resistencia al calor, generalmente varia entre 30 y 50 C.
Finalizado el secado primario el producto contiene generalmente una cantidad
apreciable de agua, esta permanece adsorbida en la superficie del mismo, la que
es muy grande debido a su estructura porosa.
Esta agua residual puede ser perjudicial para muchos productos que podran
deteriorarse al ser almacenados.
Es por esta razn que se efecta el denominado secado secundario que
corresponde a la desorcion o liberacin de gran parte del agua adsorbida.
Esta operacin se realiza a temperatura constante y a alto vaco; junto con el
agua se extrae el oxigeno adsorbido.
La desorcion es un proceso continuo e indefinido, es decir no se llega a
contenidos de humedad igual a cero y no termina abruptamente como la
sublimacin.
El secado secundario en la prctica finaliza cuando se estima que la humedad
residual no afectara al producto final, asegurndole una buena conservacin.
Esta humedad residual se determina para cada producto.
El punto final del proceso, puede determinarse siguiendo una curva de peso del
producto (mtodo de Kart Fischer u otro confiable)





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EQUIPOS DE LIOFILIZACION

Un equipo de liofilizacin se compone, en esencia, de una cmara de
desecacin, un equipo de vaci, un dispositivo para retener el agua sublimada y
algunos sistemas de control. (Ver esquemas adjuntos)
Los equipos industriales son mucho mas perfeccionados, pero constan de las
mismas partes esenciales.
Generalmente la cmara de desecacin esta constituida por un recipiente
hermtico del cual se puede evacuar el aire y obtener el grado de vaci
necesario para el proceso, suele ser metlica con puertas amplias para la carga y
descarga del material y con visores que permiten observar el proceso.
La cmara esta conectada al sistema de vaci, que en los equipos grandes, esta
constituido por 2 o mas bombas asociadas, por lo general, una rotativa para
efectuar el pre-vaci, y una de difusin para producir vacos mas elevados.
El sistema de condensacin de agua funciona como ya se explicara
anteriormente, con equipos refrigerados con gases frigogenicos.
Este sistema de condensacin o cualquiera que se utilice, siempre de estar
interpuesto entre la cmara de desecacin y la bomba de vaci, para evitar que
el vapor de agua extrado se introduzca en la misma.

CONTROLES DE PROCESO

Durante la liofilizacin, resulta indispensable controlar y regular las variables que
influyen en el desarrollo del proceso, generalmente se controlan el vaci, la
temperatura del material que se liofiliza, la del condensador y la del sistema de
calefaccin (temperatura del estante o placa donde se ubican los frascos con el
material a liofilizar).
Para medir el vaci se puede emplear un vacuometro de Mc Leod , que mide la
compresin de un volumen conocido producida por una columna de mercurio, en
un capilar bien un vacuometro elctrico de Piran, que consiste en una espiral
de platino que se calienta con una corriente elctrica.
El vaci se aprecia midiendo la variaciones de resistencia elctrica que
experimenta dicha espiral, esta pierde calor por conveccin a travs del gas que
la circunda , al aumentar el grado de vaci en el ambiente, diminuye la perdida
de calor por lo tanto el filamento aumenta su temperatura y tambin su
resistencia elctrica que es lo que se mide.
La temperatura se controla con termmetros de diferentes tipos bimetalitos, de
termocupla, de variacin de resistencia elctrica etc.
La caracterstica ms sobresaliente de los productos liofilizados es su rpida
solubilidad, esto se debe fundamentalmente a la estructura extraordinariamente
porosa que presentan, con una gran superficie ya que el producto slido ocupa
sustancialmente el mismo volumen de la solucin masa inicial.
Debido a que el proceso se desarrolla a muy bajas temperaturas, las sustancia
lbiles al calor no experimentan alteraciones, por ala misma razn no se
producen reacciones enzimticos ni proliferacin de microorganismos, de esta
manera el proceso puede efectuarse en ambiente estril.
El alto vaco a que se desarrolla permite especialmente en el secado secundario
eliminar el oxigeno en forma sustantiva, lo que garantiza la conservacin de
productos oxidables, si se guardan en envases hermticos.
El tenor de humedad de los productos que se obtienen es muy bajo, pudiendo
alcanzar valores inferiores al 0,5%


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