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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS


CARRERA DE FARMACIA







Componente:






ENSAYO DE ESTERILIDAD EN MEDICAMENTOS

Componente: Control Microbiolgico de Medicamentos

Abril 2013




Impartido por: Msc. Lissett Arauz M.















ENSAYO DE ESTERILIDAD

Introduccin
Esta norma establece el mtodo para el ensayo de esterilidad, el cual se realiza
con el objetivo de comprobar la ausencia de microorganismos viables en
medicamentos (inyectables, colirios, oticos, sueros) material de reposicin
peridica como suturas, gasas, jeringas y cualquier otro producto que requiere la
condicin de estril para su utilizacin.
Este ensayo tiene que ser realizado por personal calificado con experiencia en
tcnicas de anlisis microbiolgico, ya que errores de manipulacin e
interpretacin durante la prueba pueden llevar a interpretaciones falsas de los
resultados obtenidos.

El procedimiento debe ser realizado bajo condiciones aspticas ambientales, en
cabina de flujo laminar clase A y entorno clase B. Las precauciones utilizadas para
evitar la contaminacin no deben afectar a ningn microorganismos que pudiera
estar presente en la muestra. Las condiciones deben ser monitoreadas
regularmente.
Es necesario que al analista se le binde toda la informacin necesaria con relacin
a los cambios en los procesos de esterilizacin y envase siempre que estos
pudieran influir en el resultado del ensayo.
En productos biolgicos constituidos por microorganismos vivos atenuados
(vacunas) se entender como resultado satisfactorio, la ausencia en la muestra
ensayada de cualquier microorganismo que no sea el que constituye el producto.

Medios de cultivo utilizados
Los medios se preparan de acuerdo como lo describan las formulas
deshidratadas. Los medios de cultivo son esterilizados usando procesos
validados. Estos medios de cultivo deben promover el crecimiento de bacterias
aerobias, anaerobias y hongos.

Medio fluido Tioglicolato: Es utilizado principalmente para el cultivo de bacterias
anaerobias, pueden crecer tambin bacterias aerobias.

Medio Digerido de Caseina Soja: Es utilizado para evidenciar el crecimiento de
Hongos y bacterias aerobias.




Medios para penicilinas o Cefalosporinas
Cuando se realiza el ensayo de esterilidad por el mtodo directo y la muestra a
ensayar contiene penicilina o cefalosporina, la preparacin de los medios se
modifica.
A los tubos o contenedores de cada medio de cultivo se le agrega aspticamente
una cantidad de lactamasa requerida para inactivar el antibitico.
La cantidad de lactamasa requerida debe ser ensayada previamente( en un rea
separada de la usada para el ensayo de sterilidad), esta cantidad apropiada a
incorporar en el medio de cultivo se determina siguiendo el mtodoensayo de
validacin, utilizando menos de 100UFC de Staphylococcus aureus.Cuando un
crecimiento tpico del inculo puede ser observado, se confirma que la
concentracin de -lactamasa es apropiado.

Requisitos que deben cumplir los medio de cultivo
1) Esterilidad
2) Promocin de crecimiento

Prueba de Esterilidad del medio de cultivo (control negativo)

De los medios preparados separar dos tubos de cada uno ellos. Rotular como
control negativo.
Se incuban los tubos con Medio lquido de Tioglicolato a 35C por no menos de
tres das.
Incubar los tubos con Medio de Digerido de Casena y Soja A 22 por no menos
de 5 das.

Interpretacin de resultado: Los medios se consideran estriles sin no hay
evidencia de crecimiento microbiano. Son adecuados para el ensayo.

Prueba de promocin de crecimiento de organismos aerobios anaerobios y
hongos(control positivo). Medios + microorganismos de prueba


En esta prueba los microorganismos utilizados
Bacterias aerobias
Staphylococcus aureus ATCC 653, CIP 483
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 5262
Pseudomona aeruginosa ATCC9027, CIP 82118
Bacterias anaerobias
Clostridium sporogenes ATCC 19404

Hongos
Candida albicans ATCC 10231
Aspergillus niger ATCC 16404

Se evala cada lote de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a
partir de medios deshidratados.
Inocular 3 porciones de Medio Liquido de Tioglicolato contenidos en tubos de
ensayo con un nmero no mayor de 100 UFC/ml de las siguientes bacterias:
Clostridium sporogenes, Pseudomona aeroginosa, Staphylococcus aureus.
Se deben inocular 3 porciones de Medio de Digerido de Casena y Soja con un
nmero no mayor de 100 UFC/ml microoganismos mencionados a continuacin:
Aspergillus niger, Candida albicans, Bacilo subtiles

Se incuban los tubos que contienen cada uno de los medios con los
microorganismos correspondientes durante no ms de 3 das para bacterias y
durante no ms de 5 das para hongos.

Interpretacin: Los medios son adecuados si se produce un crecimiento
claramente visible de los microorganismos.

.
Propiedades antimicrobianas del producto o muestra:
Medio de cultivo +Producto + Microorganismo
Se debe verificar si el producto tiene propiedades antimicrobianas o inhibitorias en
caso que la muestra no sea antibitico.
Si el producto a ser analizado tiene propiedades antimicrobianas, se debe
neutralizar esta propiedad antes de realizar la prueba de esterilidad a la muestra.

Esta se realiza transfiriendo a tres tubos con medio de cultivo Tioglicolato la
cantidad de muestra apropiada considerando la tabla 2 (anexo)
Se agrega al medio un inculo pequeo de microorganismos viables no mayor de
100 UFC/ ml. Los microorganismos de prueba son:

Clostridium sporogenes ATCC 19404
Pseudomona aeroginosa ATCC 6633 CIP 5262
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP5262

Igual que en la prueba anterior, se agrega a tres tubos que contenga Medio de
Digerido de Caseina y Soja, un nmero no mayor de 100 UFC/ml de
microorganismos mencionados a continuacin:
Tubo uno: Aspergillus niger
Tubo dos: Candida albicans
Tubo tres: Bacilo subtiles
Incubar todos los medios durante un tiempo no mayor de 5 das.

Interpretacin: Si despus de la incubacin se obtiene un crecimiento claramente
visible de microorganismos, comparable visualmente con el del tubo de control sin
producto (control positivo) el producto no posee actividad antimicrobiana en las
condiciones de la prueba o tal actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La
prueba de Esterilidad de la muestra, puede llevarse a cabo sin modificacin.

Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a
evaluar, el producto posee actividad antimicrobiana, que no se ha eliminado
satisfactoriamente en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con
el fin de eliminar la actividad antimicrobiana, esto se efecta agregando un
neutralizante adecuado o realizando diluciones de la muestra.

Mtodos utilizados para el ensayo
Filtracin sobre membrana
Inoculacin directa


Filtracin sobre membrana
Se utilizan filtros de membranas que la medida de los poros no sea mayor de
0.45m, que pueda retener microorganismos.
La tcnica descrita asume que la membrana tienealrededor de 50 mm de
dimetro. S i los filtros son de diferentes dimetros el volumen de las diluciones y
el enjuague puede ser ajustado.
Soluciones acuosas. Transferir una pequea cntidad de diluyente estril sobre la
membrana (contenida en el aparato de filtrar) El diluyente es agua de peptona, en
caso de muestra de antibiticos el diluyente puede contener neutralizante o
inactivante.
Transferir y filtrar la cantidad de muestra sobre la membrana. La cantidad a
agregar se describe en la farmacopea(tabla 2 y 3 para este ensayo) y esta de
acuerdo al volumen que contiene la muestra.
Lavado de la membrana (para eliminar restos de muestra y que solo queden
retenidos los microorganismos en caso que hubiera).
Si el producto no tiene propiedades antimicrobianasr la membrana se lava 3
veces. Si el producto tiene propiedades antimicrobianas, lavar la membrana no
menos de 3 veces con el diluyente indicado, no exceder de 5 lavados con 200 ml
de diluyente.
Transferir la membrana completa a los medios de cultivo o cortar aspticamente
en dos partes iguales y transferir cada parte a loa medios correspondientes.
Incubar los medios por no menos de 14 das.
Slidos solubles Usar para cada medio no menos de la cantidad indicada en la
tabla 2 y 3 de la farmacopea y proceder como se describe para soluciones
acuosas.
Aceites y soluciones de aceite. Usar de cada medio no menos de la cantidad de
producto descrito en la farmacopea. Aceites y soluciones aceitosas de baja
viscosidad pueden ser filtradas, sin diluirse sobre la membrana seca. Aceites
viscosos pueden se diluidos con una cantidad de diluyentes estril tal como
Miristato de isopropilo. Lavar la membrana al menos 3 veces con 100ml de
solucin estril cada vez. Los diluyentes y enjuages contienen agentes
emulsificantes, ejemplo: Polisorbato 80 10g/lt.

Ungentos y cremas. Usar para cada medio no menos de la cantidad descrita en
la USP(tabla 2 y 3). Los ungentos y emulsiones de agua en aceite pueden ser
diluidos a 1% en miristato de isopropilo. Calentar si es necesario a una
temperatura no mayor a 40C. En casos excepcionales puede ser necesario
calentar a temperaturas no mayor de 44C. Filtrar rpidamente como sea posible.


Qu nmero de artculos o muestras se va a evaluar?

Previamente al ensayo se debe determinar la cantidad de envases y muestras a
utilizar de acuerdo a la tabla 3 (anexos)
Si el contenido de cada producto est en cantidad suficiente (tabla 2) se puede
dividir para agregar a cada uno de los medios especificados en porcin igual y
apropiada.



Prueba de esterilidad del producto o muestra por Inoculacin
directa.
Transferir la cantidad de la preparacin a ser examinada de acuerdo al contenido
de la muestra (tabla 2 y 3) directamente a dos frascos con Medio tioglicolato y dos
frascos con Medio Digerido de casena Soja, esto se debe realizar de forma
asptica. La cantidad de producto examinado no debe ser sea mayor de 10% con
respecto al volumen del medio.
Si el producto posee propiedad antimicrobiana realizar la prueba despus de
neutralizar esta actividad con una sustancia neutralizante adecuada o mediante su
dilucin en una cantidad suficiente de medio de cultivo..
Incubar los medios, un frasco o tubo con Medio Tioglicolato y otro con Digerido
de Caseina y Soja a 22C. Proceder de igual manera con los otros dos medios de
cultivo pero a una temperatura de 35- 37C.
La incubacin debe ser durante un tiempo no menor de 14 das. Los cultivos se
deben observar varias veces durante el periodo de incubacin 3, 5, 7, 14 das.

Recomendaciones:

1. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos
todos los das.
2. Con el medio tioglicolato agitar mnimamente con el fin de mantener
las condiciones anaerobias, evitando formacin de burbujas.


Preparacin de la muestra de acuerdo a sus caractersticas
fsicas.
Se debe considerar las caractersticas fsicas de la muestra antes de proceder a la
inoculacin directa.

Lquidos oleosos
Agregar al medio de cultivo un agente emulsificante apropiado como polisorbato
80 a una concentracin de 10 g/litro.

Ungentos y cremas
Realizar una dilucin del producto de aproximadamente 1 en 10, emulsionando
con el agente elegido (liquido A) en un diluyente estril adecuado.
Transferir el producto diluido a los medios de cultivo que no contenga agente
emulsificante. Incubar los medios con muestra.

Slidos
Transferir una cantidad de producto en forma de slido seco o preparar una
suspensin del producto agregando diluyente estril al envase primario
correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las tablas 2 y 3.
Transferir el material obtenido a dos frascos con 200 ml de medio lquido de
Tioglicolato cada uno y mezclar
Transferir la misma cantidad a 200ml de medio de Digerido de Caseina y Soja.




Algodn purificado, Gasa, apsitos quirrgicos y artculos relacionados.
De cada envase de algodn, vendas de gasa enrollada o apsitos quirrgicos
grandes que se deba evaluar
Se extrae aspticamente con una pinza estril dos o ms porciones aproximada
de 100 a 500 mg cada una, de la parte ms interna del producto.
Agregarlos a los medios de cultivo de acuerdo a la inoculacin directa del
producto.

Materiales desechables envasados individualmente
Extraer aspticamente todo el artculo.
Sumergir el artculo en cada medio y se proceder segn lo indicado en Inoculacin
directa del producto.

Dispositivos estriles, ejemplo jeringas
Se sumergen los artculos ensamblados o desmontados, en un volumen de medio
suficiente que cubra el dispositivo analizado. Se debe asegurar que los conductos
del dispositivo estn en contacto con los medios.

Catteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte
externa.
Catteres grandes
Se corta el catter en piezas con un bistur nuevo.
Sumergir las piezas en los medios de cultivo de modo que entre en contacto con
todo el lumen interno.
Catteres pequeos
Llenar el lumen interno con medio de cultivo y sumergir la unidad intacta.

Observacin e interpretacin de resultado de la prueba de Esterilidad del
producto o muestra a examinar.
A intervalos durante el periodo de incubacin y al momento de su finalizacin,
examinar los medios en busca de evidencia macroscpica de crecimiento
microbiano.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano el producto examinado
cumple con la prueba de esterilidad.
Si el material que se est evaluando enturbia el medio de modo que no puede
determinarse fcilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbianao
mediante examen visual, transferir porciones de medio( no menores de 1 ml , cada
una) 14 das despus de comenzada la incubacin, a recipientes nuevos con
medio de cultivo indicados para esta prueba y a continuacin incubar el recipiente
original y el de transferencia durante no menos de 4 das. Si no se hallan
evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la
prueba de esterilidad. Si se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el
producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba result invalida por causa no relacionadas
con el producto examinado.

La prueba puede considerarse invlida slo si se cumple una o ms de las
siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para prueba de
esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba en
cuestin revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la
prueba, el crecimiento de esta especie(o especies) puede atribuirse de
manera inequvoca a errores con respecto al material o ala tcnica usados
al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.

Si la prueba se declara invlida, se repetir con el mismo nmero de unidades de
la prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba
repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado
no cumple con la prueba de esterilidad.










ANEXO No. 1
Tabla 2. Cantidad Mnima a Usar para cada Medio
Cantidad por Envase Cantidad Mnima a Usar
(a menos que se justifique y autorice algo
diferente)
Lquidos (distintos de antibiticos)
Menos de 1 mL

1 40 mL


no mayor de 100 mL

Ms de 100 mL

Lquido antibiticos

Otras preparaciones solubles en agua o en
miristato de isipropilo

El contenido total de cada envase

La mitad del contenido de cada envase,
pero no menos de 1 mL.

20 mL.

10 % del contenido del envase, pero no
menos de 20 mL
1 mL

El contenido total de cada envase para
suministrar no menos de 200 mg.
Preparaciones insolubles, cremas y ungentos
que deben suspenderse o emulsionarse
Usar el contenido de cada envase para
suministrar no menos de 200 mg.
Slidos

Menos de 50 mg

50 mg o ms, pero menos de 300 mg

300 mg-5 g
Ms de 5 g


El contenido total de cada envase

La mitad del contenido de cada envase,
pero no menos de 50 mg
150 mg
500 mg
Dispositivos
Catgut y otros materiales de sutura quirrgica
para uso veterinario
*Aposito quirrgico/algodn/gasa ( en envases)

Material de sutura y otro material desechable
envasado Individualmente

Otros dispositivos mdicos

3 secciones de una hebra (cada uno de
30 cm de longitud)
100 mg por envase

El dispositivo completo


El dispositivo completo, cortado en piezas
o desmontado



ANEXO No.2
Tabla 3. Nmero Mnimo de Artculo a Evaluar en Relacin con el nmero de
Artculos del lote

Nmero de Artculos en la Partida Nmero Mnimo de Artculos a
Evaluar para cada Medio
(a menos que se justifique y autorice
algo diferente)
Preparaciones parenterales
No ms de 100 envases
Ms de 100 pero no ms de 500 envases
Ms de 500 envases
*Para parenterales de gran volumen

10% o 4 envases, lo que resulte mayor
10 envases
2% o 20 envases, lo que resulte menor
2% o 10 envases, lo que resulte menor
Antibitico slidos
Envasados farmacuticos a granel (5 g)
Envasados farmacuticos a granel ( 5 g)
Graneles y mezclas

20 envases
6 envases
Ver productos slidos a granel
Preparaciones oftlmicas y otras no
inyectables
No ms de 200 envases
Ms de 200 envases

Si el producto se presenta en la forma de envases
monodosis,
Aplicar el esquema mostrado anteriormente para
preparaciones para uso parenteral


5% o 2 envases, lo que resulte mayor.
10 envases
Dispositivos
Catgut y otros materiales de sutura quirrgica
para uso veterinario
2 % o 5 envases, lo que resulte mayor,
hasta un total mximo de 20 envases
10% o 4 artculos, lo que resulte mayor
10 artculos
2% o 20 artculos, lo que resulte menor.

* No ms de 100 artculos
Ms de 100, pero no ms de 500 artculos
Ms de 500 artculos
Productos slidos a granel
Hasta 4 envases
Ms de 4 envases, pero no ms de 50 envases
Ms de 50 envases
Cada envase
20% o 4 envases, lo que resulte mayor
2% o 10 envases, lo que resulte mayor
Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna de el
nmero de envases necesarios para los dos medios juntos






INFORME DE ANALISIS

Nombre genrico:
Nombre comercial:
Nmero de Lote:
Fecha de vencimiento
Fecha de elaboracin
Presentacin:
Forma farmacutica
Fecha de recepcin: . Fecha de anlisis:
Ensayo realizado:..

Determinacin de: Resultado Especificacin

Bacterias anaerobias

Bacterias aerobias

Hongos y levaduras


Observacin:

Bibliografa:

Entrega de resultado;

Analista: