VIRUS EPSTEIN-BARR (VEB) Y NEOPLASIA

C. Bellas, A. Santn, G. Plaza.

Laboratorio de Patologa Molecular. Hospital Ramn y Cajal.

GENERALIDADES
ESTRUCTURA DEL VEB
INFECCIN Y RESPUESTA INMUNE FRENTE AL VEB
Latencia
ASPECTOS PATOGNICOS DEL VEB
DETECCIN DEL VEB EN LOS TEJIDOS
Tcnicas moleculares para la deteccin del genoma viral
Tcnicas moleculares de Hibridacin in situ (HIS) para ADN o ARN
Tcnicas inmunohistoqumicas para la deteccin de diferentes protenas virales


GENERALIDADES
El VEB es un patgeno ubicuo que ha infectado y permanece en ms del 90% de la poblacin
adulta, de forma que la mayora de los adultos son seropositivos para el VEB. La infeccin por el
VEB usualmente ocurre de forma subclnica en la infancia temprana. La primoinfeccin
clnicamente aparente es la mononucleosis infecciosa, que generalmente afecta a individuos que no
han tenido contacto con el VEB hasta la juventud, siendo un cuadro autolimitado la mayora de las
veces. La puerta de entrada del virus es la orofaringe.
ESTRUCTURA DEL VEB
El genoma del VEB est constituido por una molcula de ADN bicatenario de una longitud
aproximada de 172 kb que codifica aproximadamente unas 100 protenas. La molcula de ADN
est flanqueada en ambos extremos por un nmero variable de repeticiones terminales, cada una de
ellas de una longitud aproximada de 500 pb. La recombinacin entre estas repeticiones terminales
origina la formacin de una molcula extracromosmica cerrada covalentemente o episoma, que es
la estructura que el virus adopta en el ncleo de las clulas infectadas de forma latente. El nmero
de repeticiones que queda en cada episoma tras la unin de los extremos se utiliza como marcador
de clonalidad.
Figura 1. Genoma del VEB: Episoma


INFECCIN Y RESPUESTA INMUNE FRENTE AL VEB
La forma de transmisin tradicionalmente aceptada sostiene que el VEB infecta inicialmente las
clulas epiteliales de la orofaringe y posteriormente pasa a los linfocitos B del tejido linfoide
adyacente. El receptor para el VEB de las clulas epiteliales y de los linfocitos B es el CD21. En las
clulas epiteliales se realiza un ciclo vital productivo en el que el virus se replica produciendo
viriones e induciendo la lisis de la clula husped. Durante los estadios iniciales de la
primoinfeccin se induce una marcada respuesta inmunitaria frente a los antgenos de la capside
viral (VCA) que tiene capacidad neutralizante y que previene la viremia generalizada. En principio,
este tipo de infeccin ltica o productiva se observa slo en la primoinfeccin y en los individuos
inmunodeprimidos.
Recientemente se est cuestionando este modelo en el que las clulas epiteliales de la orofaringe
seran el foco primario y el reservorio de la infeccin por el VEB y en el que los linfocitos B se
infectaran de forma secundaria. Trabajos recientes confirman la costante ausencia del VEB de la
clulas epiteliales normales de los individuos inmunocompetentes y demuestran la existencia de
infeccin latente y productiva exclusivamente en los linfocitos presentes en el epitelio bucal y
nasofarngeo, por lo que parece posible que el VEB infecte directamente a los linfocitos B, y no de
forma secundaria a la infeccin replicativa de las clulas epiteliales.
Latencia
Para comprender el papel patognico que puede tener el VEB en el desarrollo de algunas neoplasias
es importante conocer que despus de la infeccin primaria, el VEB nunca es erradicado
completamente del organismo, permaneciendo presente en una pequea poblacin de linfocitos B
en una situacin de relativa inactividad conocida como infeccin latente.
En el individuo normal existen clones de linfocitos T citotxicos (CTL) que reconocen de forma
especfica a las clulas B infectadas de forma latente por el VEB siendo esta respuesta T
fundamental para el mantenimiento de la vigilancia inmune frente al virus.
Una de las caractersticas del VEB es su capacidad de transformar in vitro los linfocitos B
estableciendo las llamadas lneas celulares linfoblastoides. De los muchos genes codificados por el
virus slo 11 se expresan en estas lneas celulares infectadas de forma latente. Se trata de seis
antgenos nucleares denominados EBNA-1, -2, -3A, -3B. -3C, -LP, tres antgenos de membrana
llamados LMP-1, -2A y -2B y dos ARNs de pequeo tamao que se localizan en el ncleo en un
elevado nmero (10
6
- 10
7
copias por clula) y que se conocen como EBER 1 y EBER 2 (EBERs).
Las diferencias existentes entre los genes que codifican las protenas nucleares EBNA-2 y EBNA-
3A, -3B y -3C distinguen dos tipos diferentes del VEB denominados VEB-1 y VEB-2 que se
diferencian en la mayor capacidad para trasformar los linfocitos B in vitro del VEB tipo 1.
Dependiendo de los genes expresados en la clula husped, se han descrito tres formas diferentes
de latencia del VEB, que se observan en las distintas lneas celulares y en las diversas patologas
asociadas al VEB (tabla 1):
Tabla 1. Formas de latencia del VEB.

EBNA-1
EBNA-2,
-3(A-C),-LP
LMP-1 LMP-2A/B EBERS BHRF1
Latencia I
LB
+ - - ? + ?
Latencia II
EH, CNF
+ - + + + ?
Latencia III
TLP-PT
TLP-VIH
LCLs
+ + + + + +
CNF: carcinoma nasofarngeo; EH: enfermedad de Hodgkin; LB: linfoma Burkitt; TLP-PT: trastornos linfoproliferativos
postransplante; TLP-VIH: trastornos linfoproliferativos asociados al SIDA; LCLs: lneas celulares linfoblastoides.
La forma de latencia I se observa en el linfoma Burkitt (LB) y en los linfocitos B infectados que
circulan en la sangre perifrica. En esta forma de infeccin la expresin del genoma viral queda
limitada a los EBERs y a la protena EBNA-1 cuya funcin es indispensable para mantener el
episoma pero que carece de capacidad inmungena. Este patrn tan restringido de expresin gnica
permitira a las clulas infectadas escapar a la vigilancia inmune por CTL, favoreciendo as la
persistencia de la infeccin latente.
La forma de latencia tipo III es la que caracteriza a las lneas linfoblastoides y se observa tambin
en la mononucleosis infecciosa y en la gran mayora de los trastornos linfoproliferativos B
asociados a inmunodeficiencia. La inmunosupresin actuara permitiendo que los linfocitos B
infectados expresen todas las protenas asociadas a la infeccin latente sin que sean reconocidos y
eliminados por los CTL.
La forma de latencia tipo II se asocia fundamentalmente a neoplasias. En esta forma se expresan la
protenas EBNA-1 y LMP-1, LMP-2A y 2B y los EBERs. Es la que caracteriza a la enfermedad de
Hodgkin (EH) y al carcinoma nasofarngeo (CNF).
Investigaciones recientes demuestran que el espectro fenotpico o morfolgico de las celulas B que
portan el VEB in vivo es mucho mas amplio que in vitro abarcando desde el linfocito pequeo
hasta la clula plasmtica pasando por el inmunoblasto. Se postula as la hiptesis de que el VEB
persiste in vivo integrando su biologa con la de la clula B normal en la que reside y que la clula
B normal le provee de todos los medios necesarios para que el VEB mantenga su ciclo vital. Es
decir, el VEB es un parsito de la biologa normal de la clula B. Esta nueva forma de entender la
relacin entre el VEB y el linfocito B sostiene que el tipo de latencia del VEB podra depender del
estado de la clula B en la que el virus reside y propone una nomenclatura nueva para los diferentes
tipos de latencia basada en la conducta del virus en las clulas normales, desechndose la
nomenclatura anterior para la latencia viral que se basaba en la diferente expresin de los productos
virales en tumores asociados al VEB y en lneas de clulas B inmortalizadas in vitro; es decir, en
estados no fisiolgicos. Esta nueva teora parte de que el ciclo vital del VEB est limitado a las
clulas linfoides B ya que nicamente se ha detectado en ellas y es en ellas donde persiste y se
replica. El VEB persistira en las clulas B en reposo de la sangre perifrica. La expresin viral
quedara limitada a LMP-2 y probablemente a EBNA-1. La funcin de LMP-2 es bloquear las
seales que permiten al virus reactivarse. Y aunque LMP-2 es una protena inmungena, como la
clula esta en reposo no puede ser detectada por los CTL ya que le falta la mlecula HLA-I co-
estimuladora B7. En esta situacin, el virus es invisible para el sistema inmune del husped y las
clulas infectadas no son una amenaza para el individuo ya que ni proliferan ni replican virus. Este
sera el programa de latencia del VEB en los linfocitos B en reposo.
La regulacin de la persistencia de clulas B infectadas se realizara en el ganglio linftico
mediante seales que provienen del virus o del ambiente. Para mentener la persistencia de la
infeccin latente los linfocitos B infectados por el VEB de la sangre perifrica podran recibir
seales en el ganglio linfatico que le cambien al programa de EBNA-1. En este programa se
expresara slo esta protena, que es necesaria para replicar el episoma y, por lo tanto, para la
proliferacin. La ventaja de este programa es que EBNA- 1 es la nica protena codificada por el
virus que contiene una secuencia peptdica no reconocible por los CTLs. Este programa es un
mecanismo que mantiene el nivel de clulas infectadas de forma latente favoreciendo que stas no
sean detectadas por el sistema inmune. Es el equivalente al tipo de latencia I del otro modelo.
Durante la infeccin aguda y probablemente en las reactivaciones es necesaria la expansin y la
diseminacin de la infeccin, para ello se inducira en los linfocitos B el programa de
crecimiento, que es anlogo al tipo de latencia III del modelo anterior, y que permitira la
expansin del virus, pero que, a su vez, al generar clulas inmortales podra constituir una amenaza
para el husped. Sin embargo, cuando la clula B entra en este programa expresa diferentes
protenas inmungenas (EBNAs y LMPs) que inducen una respuesta. El papel de los CTLs sera
impedir la supervivencia de los linfocitos B infectados por el VEB que expresen un programa de
crecimiento y as minimizar el riesgo de acontecimientos secundarios que favorezcan el desarrollo
de linfomas.
Tabla 2. Fenotipo in vivo de los linfocitos B infectados por VEB.
Latencia Programa
EBNA1
Programa
de crecimiento
Fenotipo
in vitro
Nombre antiguo - Lat. I Lat. III Lat. III
Localizacin Periferia Tej. linfoide Tej. linfoide Cultivo tisular
Fenotipo
celular
B7 neg
Reposo
Activado
Proliferacin
Activado
Proliferacin
Activado
Proliferacin
Genes del VEB
Expresados
LMP2
EBNA1?*
EBNA1 EBNA1-6
LMP1,2
EBNA1-6
LMP1,2
Vida media Persistente? Limitada Limitada Inmortal
Reconocimiento
Por CTL
Invisible No presentado Efectivo Efectivo
B7: molcula HLA-I ausente de linfocitos B y necesaria para que los CTL puedan reconocer la clula infectada. CTL: linfocitos T
citotxicos. * El antiguo patrn de latencia de tipo II, tpico de CNF y EH, sera similar al patrn de latencia, pero con expresin
aberrante de LMP-1.

ASPECTOS PATOGNICOS DEL VEB
Como en el ciclo ltico se produce la muerte de clula infectada, los genes que se expresan
exclusivamente en ste no parecen tener demasiada importancia en la tumorognesis, con la
excepcin de ellos los genes BHRF1 y BCRF1 que s podran tener un papel en el desarrollo de
tumores. Por el contrario, los genes que se expresan en la infeccin latente son de especial inters
en la patognesis de las neoplasias asociadas al VEB (tabla 3).
Los mecanismos patognicos por los que el VEB es capaz de inducir la aparicin de tumores se
relacionan con las protenas codificadas por algunos de los genes expresados en la infeccion
latente. Dichos productos inducen diferentes efectos sobre la clula husped infectada (tablas 3 y 4)
que facilitan el desarrollo de tumores.

Tabla 3. Genes del VEB cuyos productos podran estar implicados en la tumorogenesis.
EBNA 1 Factor transcripcional, esencial para el mantenimiento del
VEB. Induce la expresin de RAG1 y RAG2 in vitro
EBNA 2 Factor transcripcional, esencial para la transactivacin de LMP-1
EBNA 3A
(3B, EC)
Factores transcripcionales, que favorecen una potente respuesta
inmune
EBNA LP Protena que interfiere con la funcin normal de las
protenas p53 ypRb
LMP-1 nica protena del VEB con capacidad oncognica demostrada,
interacciona con factores asociados a la familia de los receptores
del TNF (TRAF); causa sobrexpresin de la protena Bcl-
2, A20 y de la IL-10
LMP 2 A/B Protena relacionada con la familia src de las tirosn kinasas,
pudiendo controlar la actividad del ciclo ltico del VEB
EBER 1/2 Fragmentos de ARN no traducidos, que se expresan muy
abundantemente y cuya funcin es desconocida
BHRF 1 Protena homloga de Bcl-2, capaz de inhibir la apoptosis
BCRF 1 Protena homloga de la IL-10, capaz de estimular la
proliferacin celular B e inhibir la capacidad citotxica de los
linfocitos T (CTL)

Tabla 4. Patogenia del VEB
Inhibicin de apoptosis BHRF 1 y LMP-1
Induccin de porliferacin celular LMP-1, EBNA-2, BCRF 1, EBNA-LP
Induccin de traslocaciones EBNA-1
Escape a la respuesta inmune BCRF 1, mutantes delecionados de LMP-1

Mecanismos patognicos del VEB
Son bsicamente cuatro:
1. El mantenimiento de las poblaciones celulares infectadas mediante la inhibicin de la muerte
celular por apoptosis:
BHRF1, debido a su homologa con bcl-2 podra interferir en el balance entre bcl-
2 y bax y, por este mecanismo, inhibir la apoptosis.
LMP-1, una de cuyas acciones consiste en aumentar los niveles de bcl-2 y as inhibir
la apoptosis.
2. La induccin de proliferacin celular mediante:
LMP-1, esencial para la transformacin de los linfocitos B primarios.
EBNA2, cuya actividad muy probablemente consiste en mediar la transactivacin de
LMP-1 y de otros genes celulares implicados en la proliferacin.
BCRF1, protena anloga a la IL-10 humana que actuara como un factor de
crecimiento autocrino de clulas B.
EBNA-LP, que puede formar complejos con p53 y pRb, y al secuestrar los productos
de estos genes supresores de tumores, activara la proliferacin celular.
3. La induccin de recombinasas que posibilitan translocaciones mediante:
EBNA-1, que induce la expresin de los genes RAG-1 y RAG-2, lo que podra
favorecer la produccin de recombinaciones aberrantes (translocaciones).
4. La evasin de la respuesta inmune mediada por clulas T:
Las protenas virales ms antignicas para los linfocitos T son: EBNA3A, 3B y 3C,
pero los linfocitos T responden tambin frente a EBNA-2, EBNA-LP, LMP-1. Los
mtodos que utiliza el VEB para escapar a la respuesta inmune son :
Regular a la baja las protenas virales con mayor poder antignico.
Inhibir a las clulas T mediante la secrecin de algunas citoquinas por la clulas
infectadas como IL-10 y TGF.

DETECCIN DEL VEB EN LOS TEJIDOS
Tcnicas moleculares para la deteccin del genoma viral:
Southern Blot: Se necesitan grandes cantidades de ADN de alto peso molecvular lo que obliga a
utilizar tejido congelado y se realiza con marcaje radiactivo; permite la demostracin de clonalidad
(hibridando la regin terminal repetida).
PCR: puede utilizarse ADN extrado de parafina, es ms sensible que la tcnica anterior; permite
tipificar la cepa del VEB (Tipo 1 o 2) y detectar la presencia de delecin en el oncogn LMP-1.
Ninguna de estas dos tcnicas permite identificar las clulas infectadas por el virus.

Tcnicas moleculares de Hibridacin in situ (HIS) para ADN o ARN:
Ambas se pueden realizar sobre cortes de tejido fijado en formol e incluido en parafina; permiten
utilizar un sistema de deteccin no-radiactivo combinando la hibridacin in situ con la
inmunohistoqumica; y posibilitan la identificacin de la clula infectada.
En concreto, la HIS para la determinacin de los EBERs (ARN) es un mtodo muy sensible ya que
stos estn presentes en las clulas infectadas de forma latente en un gran nmero de copias. Es la
tcnica ms recomendada para el diagnstico histolgico.

Tcnicas inmunohistoqumicas para la deteccin de diferentes protenas virales
Existen anticuerpos comerciales para la deteccin de LMP-1, EBNA-1, EBNA-2 . Algunos de estos
antgenos se pueden detectar en tejidos procesados de forma rutinaria; estos mtodos permiten
identificar a la clula infectada y valorar la expresin de los productos del VEB en la poblacin
tumoral.

Tabla 5. Tcnicas moleculares empleadas para la deteccin del VEB
Cmo detectar el VEB en un tejido?
Qu detecta? Ventajas Inconvenientes
Southern blot Genoma viral (ADN) Clonalidad Slo congelacin
No localizador
PCR Genoma viral (ADN) Sensibilidad
Parafina y cong.
No localizador
Hibridacin in situ ARN o ADN Sensibilidad
Localizador
Caro
Inmunohistoqumica LMP-1, EBNA-1,
ZEBRA, etc.
Localizador
Demostracin de funcionalidad
No siempre se
detecta expresin