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Versuch 2

ELLMANN: Bestimmung der Gesamtzahl an Mercaptogruppen


der Alkoholdehydrogenase im Ellman-Assay
















Praktikant: Praktikumnummer:

Praktikant: Praktikumnummer:
















I. Einleitung

Dehydrogenasen sind Enzyme die Redoxreaktionen katalysieren, wobei sie molekularen
Wasserstoff unter Verwendung von Coenzymen als Donatoren, bzw. Akzeptoren bertragen.
Die Enzyme dieser Klasse weisen eine Stereoselektivitt auf, was bedeutet, dass sie vom
Substrat mit Prferenz eines der chemisch gleichen, aber durch ebendiese Prferenz nicht
quivalenten Wasserstoffe abspalten. In der pro-S und pro-R Konvention bezeichnet man
das Wasserstoffatom, wrde es eine knstlich hhere Prioritt als sein Gegenstck erhalten
und dadurch das Molekl zu einen rechtsdrehenden Enantiomer machen, als H
R
und
dementsprechend das andere Wasserstoffatom als H
S
:

||

Wrde man H
A
ersetzen, sodass die hhere Prioritt erkennbar ist, ergbe sich ein
S-Enantiomer:


Im Gegenfall, dass H
B
die hhere Prioritt erhlt, ergbe sich das R-Enantiomer.


Deshalb bezeichnet man die beiden Wasserstoffe entweder als pro-R oder pro-S.

Eine wichtige Rolle im Zusammenhang dieser Stereoselektivitt scheint auch das Akzeptor-
Substrat zu spielen - Dehydrogenasen, die Aldehyd-, bzw. Carbonylgruppen zu Alkoholen
reduzieren, bevorzugen das H
R
des Donators. Dehydrogenasen, die Carboxylgruppen und
deren Derivate zu (Thio-)Halbacetalen/ Aldehydhydraten reduzieren, bevorzugen das H
S
des
Donators.

Prochiral, noch keine Hndigkeit.


Ein bekanntes Beispiel ist die Alkoholdehydrogenase, die in der alkoholischen Grung das
NAD
+
regeneriert, das in der Glykolyse verbraucht wurde. Es bertrgt in seiner typisch
katalysierten Reaktion das H
R
-Hydridion vom Nikotinamid-Teil des NADH auf Acetaldehyd:


Das Gleichgewicht der Reaktion liegt unter physiologischen Bedingungen auf Seiten des
Ethanols.

Die Hefe-ADH ist ein Homotetramer, ein nicht-kovalenter Proteinkomplex aus vier
identischen Untereinheiten. Jedes aktive Zentrum einer der Untereinheiten enthlt zwei
Cystein-Reste, welche essentiell fr die enzymatische Aktivitt des ADH sind, ihre Thiolat-
Seitenketten sind Liganden fr ein Zn
2+
-Ion, das die kovalente Bindung zwischen Carbonyl-
Sauerstoff und Kohlenstoff des Acetaldehyds strker polarisiert (Kohlenstoff hheres +)
und damit einen nukleophilen Angriff des zu bertragenden Hydridions begnstigt.
Auer diesen beiden essentiellen Cystein-Resten besitzt jede ADH-Untereinheit 6 weitere,
fr die Enzymaktivitt kaum relevante, Cystein-Reste.
Analog zum ADH regeneriert in Vertebraten oder der Flugmuskulatur von Insekten das
strukturell hnliche LDH das zuvor reduzierte NADH zu NAD
+
, die bertragung des
Wasserstoffs geschieht jedoch direkt auf das Pyruvat, es entsteht daraus Lactat. Im aktiven
Zentrum des LDH befindet sich auch nur ein essentieller Cysteinrest, der nicht Teil an einer
dativen Bindung zu einem Metallion hat.

Ziel des Versuchs ist die experimentelle Bestimmung der Anzahl der Cystein-Reste im ADH.
Die funktionell wichtigen Thiolgruppen der Cysteinreste lassen sich durch die Zugabe von
Ellmans-Reagenz (DTNB = 5,5'-Dithio-bis-(2,2'-nitrobenzoesure)) im berschuss
nachweisen, sofern sie frei zugnglich sind. Es bildet sich bei der Reaktion pro
Mercaptogruppe ein 2-Nitrothiobenzoat-Anion (NTB), welches bei 412nm photometrisch
gemessen werden kann.














Der pH-Wert sollte knapp ber 7
liegen, durch Deprotonierung
bilden sich Thiolat-Anionen, die
die Disulfidbindung trennen. Es
entsteht ein gemischtes Disulfid
und ein Nitrothiobenzoat-Anion
(NTB
-
), welches bei neutralem
bis alkalischem Mileu zum
chromophoren NTB
2-
-Dianion
ionisiert.


Oft sind die Mercaptogruppen im aktiven Zentrum des Enzyms exponiert und deshalb
besonders reaktiv. Diese sind direkt messbar, bei anderen ist es erst nach vollstndiger
Denaturierung (durch z.B. Harnstoff) mglich.

Im Versuch wurde zunchst die Konzentration einer ADH-Lsung photometrisch anhand
ihrer UV-Absorption (280nm) bestimmt.
Um die Anzahl der Mercaptogruppen im ADH messen und berechnen zu knnen musste erst
eine Eichgerade erstellt werden, indem N-Acetylcystein als Modellsubstrat mit Ellmans
Reagenz umgesetzt wurde. Es entsteht dabei genauso das messbare Nitrothiobenzoat.
Im letzten Teil wurde ADH unter Verwendung von Harnstoff denaturiert um die Feststellung
der Anzahl an essentiellen und die Gesamtzahl aller der Mercaptogruppen je Enzymeinheit
zu ermglichen.


II. Durchfhrung

1. Allgemeine Vorarbeiten

1.1 Herstellung von PBS-Stammlsung

Zu Beginn des Versuches bentigte man eine PBS-Stammlsung (4 mM KH
2
PO
4
; 16 mM
Na
2
HPO
4
; 115 mM NaCl). Diese Lsung war auf dem Arbeitsplatz schon vorbereitet.

1.2 Herstellung der ADH-Stammlsung

Als nchstes wurde eine ADH-Stammlsung bentigt. Die bereitgestellte Suspension wurde
zuerst fr 1 min bei 1300 rpm zentrifugiert und der berstand wurde verworfen. Nach dem
Zentrifugieren wurde das Przipitat in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgef mit 1,2 ml
PBS pipettiert. Anschlieend wurde die ADH-Stammlsung auf Eis gestellt.

1.3 Herstellung der 8 M Harnstofflsung

Es wurden ca. 4,8 g Harnstoff in 5 ml PBS gelst. Danach wurde mit vorsichtigem Auf- und
Abschwenken gemischt. Danach wurde das Volumen auf 10 ml mit PBS eingestellt und
sterilfiltriert.

1.4 Herstellung einer ADH-Lsung in 6,4 M Harnstoff

Man bentigte eine denaturierte ADH-Lsung. Aus diesem Grund wurden 480 l der ADH
Stammlsung zu 1,920 ml einer 8 M Harnstofflsung in einem 15 ml Reaktionsgef
pipettiert. Die Lsung wurde gemischt und fr 1,5 h bei 30 C inkubiert.





1.5 Herstellung einer 1 mM N-Acetylcystein-Lsung (M = 163,2 Da) in PBS

In einem 15 ml Reaktionsgef wurde 16,32 mg N-Acetylcystein gegeben und in 10 ml PBS
gelst. Aus dieser Lsung wurde 1 ml in ein neues 15 ml Reaktionsgef gegeben und mit 9
ml PBS zu 1:10 verdnnt.

1.6 Herstellung einer 3 mM DTNB-Lsung in PBS

Es wurde 3,6 mg DTNB in ein 15 ml Reaktionsgef eingewogen. Danach fgte man 3 ml PBS
hinzu. Dadurch lste sich das DTNB.

2. Konzentrationsbestimmung der ADH-Lsung

Fr diesen Versuch bentigte man 100 l der Enzymlsung, welche man in ein 1,5 ml
Reaktionsgef im Verhltnis 1:10 mit PBS pipettierte. Die Lsung wurde in eine
Quarzkvette gegeben und ihre Extinktion wurde bei 280 nm am UV-Photometer gemessen.

3. Erstellung einer Ausgleichsgeraden fr den Ellman-Assay mit
N-Acetylcystein

Um eine Ausgleichsgerade zu erstellen, wurden unterschiedliche Konzentrationen des N-
Acetylcysteins (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 M) mit einer konstanten Konzentration von Ellman-
Reagenz im berschuss umgesetzt. Als erstes wurde eine Verdnnungsreihe von N-
Acetylcystein erstellt. Danach folgte eine statistische Mittelwert-Bestimmung. Hierfr wurde
jeder Reaktionsansatz dreimal in je einem 1,5 ml Reaktionsgef umgesetzt und bei 30 C fr
30 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Lsungen in Plastikkvetten berfhrt.
Ihre Extinktion wurde dabei bei 412 nm gemessen. Die Ergebnisse wurden notiert.

4. Bestimmung der Anzahl frei zugnglicher Mercaptogruppen je
Enzym-Untereinheit

Fr diesen Versuch wurden drei Reaktionsanstze bentigt. 150 l der ADH-Stammlsung in
PBS in ein 1,5 ml Reaktionsgef pipettiert. Danach fgte man 600 l PBS und 37,5 l der 3
mM DTNB-Lsung hinzu. Die Reaktionsgefe wurden bei 30 C fr 30 min inkubiert. Danach
wurde die Absorption bei 412 nm in der Plastikkvette gemessen.

5. Bestimmung der Gesamtzahl der Mercaptogruppen je
Enzymuntereinheit

In diesem Versuchsteil wurden 37,5 l der 3 mM DTNB-Lsung zu 750 l der (durch
Harnstoff) denaturierten ADH-Lsung hinzugegeben. Die Lsung wurde gemischt und bei
30 C fr 30 min inkubiert. Danach berfhrte man die Lsungen in Plastikkvetten. Ihre
Absorption wurde bei 412 nm gemessen. Auerdem wurden auch drei Blindwert-Proben mit
750 l 8M Harnstoff in PBS und 37,5 l DNTB-Lsung inkubiert und photometrisch
gemessen. E berechnet sich aus dem Mittelwert der ADH-Proben abzglich dem Mittelwert
der Blindwert-Proben.
III. Ergebnis und Auswertung

1. Konzentrationsbestimmung der ADH-Lsung

Die Konzentration der hergestellten ADH-Lsung lsst sich durch die Tyrosin- und
Tryptophan-Reste im Enzym, welche im UV-Bereich absorbieren, photometrisch messen. Die
Absorption der Lsung wurde bei 280nm aufgenommen.

Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetztes lsst sich ber den Referenzwert bei
der Massenkonzentration

ein Extinktionskoeffizient berechnen, mit dem es dann


mglich ist, die Konzentration der Lsung mit der aufgenommenen Extinktion zu bestimmen.

Berechnung des Extinktionskoeffizienten:




Berechnung der Konzentration der ADH-Lsung:




Es handelt sich hierbei um eine 1:10 Verdnnung. Dadurch ergibt sich folgende
Ausgangskonzentration:









Da die Moleklmasse des Enzyms ( ) bekannt ist, lsst sich die
Stoffmengenkonzentration ausrechnen.

Umrechnung in





2. Erstellung einer Ausgleichsgeraden fr den Ellman-Assay mit
N-Acetylcystein

Die Absorption bei 412nm ergaben folgende Werte:

Probe 0 l 5 l 10 l 15 l 20 l 25 l 30 l
A 0,154 0,215 0,295 0,352 0,372 0,478 0,474
B 0,160 0,261 0,271 0,342 0,403 0,420 0,481
C 0,134 0,196 0,268 0,391 0,478 0,415 0,464
0,149 0,224 0,278 0,361 0,418 0,438 0,473
Tab. 1: Absorptionswerte des N-Acetylcysteins

Nun wird der Puffer-Blindwert subtrahiert:

Probe 0 l 5 l 10 l 15 l 20 l 25 l 30 l
korr. 0 0,075 0,129 0,212 0,269 0,289 0,324
Tab. 2: Korrigierte durchschnittliche Absorptionswerte






Um die Eichgerade zu erhalten, wurden die korrigierten Werte gegen die N-
Acetylcysteinkonzentrationen aufgetragen:




Die Gleichung der Regressionsgerade ist:

Der molare Extinktionskoeffizient wird durch lineare Regression aus der Steigung der
Ausgleichsgeraden berechnet. Die Steigung betrgt 0,0111.




Der Literaturwert liegt bei



Somit weicht der, aus dem Versuch ermittelter Extinktionskoeffizient um 21,3 % dem
Literaturwert ab.


3. Bestimmung der Anzahl frei zugnglicher Mercaptogruppen je
Enzym-Untereinheit

E berechnet sich aus der Differenz zwischen dem Mittelwert der drei gemessenen
Extinktionen und dem Blindwert aus 3.2:
Probe
natives ADH
A
412 nm
ADH
+ DTNB
A
412 nm
PBS
+ DTNB
A
412 nm
C
NTB
[M] n
Cys

A 0,478 - - -
B 0,494 - - -
C 0,444 - - -
0,472 0,149 0,323
y = 0,0111x + 0,0179
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Absorption bei
412nm
N-Acetylcysteinkonzentration [M]
Eichgerade fr den Ellman-Assay
Die Konzentration der NTB-Dianionen berechnet sich ber das Lambert-Beersche Gesetz
aus E, dem molaren Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Kvette:



Um die zur NTB-Konzentration quivalente Konzentration an Mercaptogruppen in der
Stammlsung zu erhalten, muss die Verdnnung bercksichtigt werden:



Das Verhltnis der NTB-Konzentration zur ADH-Konzentration ergibt die Anzahl der
Mercaptogruppen (und Cysteine) pro ADH:



Im Versuch wurde mit Hefe-ADH gearbeitet. Es handelt sich hierbei um ein Homotetramer
aus vier Untereinheiten. Deshalb muss man den oben errechneten Wert durch vier teilen:



Die Anzahl muss ganzstellig gerundet werden, wobei in diesem Fall definitiv aufgerundet
werden muss. Angenommen wird die Wahrscheinlichkeit, dass Mercaptogruppen nicht
reagiert haben und damit das Messergebnis vermindert haben. Es ergibt sich deshalb eine
Anzahl von 6 Mercaptogruppen pro Untereinheit des ADH.






4. Bestimmung der Gesamtzahl der Mercaptogruppen je
Enzymuntereinheit

Probe
denaturierte
ADH
A
412 nm
ADH
+ DTNB +
Harnstoff
A
412 nm
PBS +
DTNB +
Harnstoff
A
412 nm
C
NTB
[M] n
Cys

A 0,666 0,146 - - -
B 0,678 0,115 - - -
C 0,682 0,126 - - -
0,675 0,129 0,546
Tab. 3: Messwerte der denaturierten ADH

Die Berechnung geschieht analog zu 3.3:






Anzahl der Mercaptogruppen je ADH:





je ADH-Untereinheit:



Durch Rundung ergibt sich eine Anzahl von 12 Mercaptogruppen pro Untereinheit des ADH.

5. Berechnung der Gesamtionenstrke des PBS-Puffers

Die Formel der Berechnung der Gesamtionenstrke lautet:



Die Komponenten des PBS-Puffers sind:

Komponente Konzentration
[mM]
Ionen
KH
2
PO
4
4 K
+
H
2
PO
4
-
Na
2
HPO
4
16 2* Na
+
HPO
4
2-

NaCl 115 Na
+
Cl
-

Berechnung der Gesamtionenstrke des Puffers:


Der bersichtlichkeit halber werden erst die einzelnen Ionenstrken berechnet und
zum Schluss addiert:



6. Erluterung des Reaktionsablaufs des Ellman-Assays

Das Enzym ADH besitzt in ihren aktiven Zentren jeweils zwei Cystein-Reste mit Thiolat-
Seitenketten. Zwei Thiolat-Anionen sind hierbei frei zugnglich und knnen mit dem, im
berschuss eingesetzten Ellman-Reagenz (5,5-Dithio-bis-(2,2-nitrobenzoesure); DTNB) zu
einem gemischten Disulfid und einem Nitrobenzoat-Anion (NTB) reagieren. Das NTB kann bei
412 nm photometrisch gemessen werden. Dabei wird pro vorhandenes Thiolat-Anion genau
ein NTB gebildet (siehe Reaktionsgleichung in der Einleitung). Der Benzolring des NTB
erlaubt eine mesomere Stabilisierung:


Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes kann man dann die Konzentration des NTB
ermitteln. Jedoch ist zu beachten, dass die quantitative Umsetzung nur mit den frei
zugnglichen Thiolat-Anionen erfolgt. Somit ist das Assay von der sterischen Zugnglichkeit
abhngig. Mit dem hier im Versuch verwendeten Ellman-Assay reagieren nur die essentiellen
SH-Gruppen (frei zugnglich) der ADH mit dem DTNB. Die restlichen SH-Gruppen knnen nur
sehr schwer gebunden werden. Erst nach einer Denaturierung knnen diese reagieren.





IV. Diskussion

Bestimmung einer ADH-Konzentration

Die berechnete Konzentration der ADH-Lsung (

, bzw. ) erscheint sinnvoll,


da Konzentrationen dieser Gre in Laboren gngig sind. Es gibt keinen Grund anzunehmen,
dass bei der Bestimmung Fehler gemacht wurden.


Erstellung einer Eichgerade fr den ELLMAN-Assay

Die einzelnen aufgetragenen Datenpunkte liegen alle sehr nahe an der Regressionsgeraden,
weshalb anzunehmen ist, dass der Versuch erfolgreich und ohne groe Fehler verlaufen ist.
Der ermittelte Wert von

weicht allerdings deutlich vom Literaturwert


(

) ab. Die Abweichung von 21,3% knnte einerseits durch


unterschiedliche Reaktionsbedingungen begrndet werden. Um nher an den Literaturwert
zu kommen, htte die Extinktion hher liegen mssen. Ein Puffer mit hherem pH-Wert
wrde das N-Acetylcystein besser deprotonieren und eine Reaktion mit DTNB begnstigen.
Auch htte eine hhere N-Acetylcystein-Konzentration ein besseres Ergebnis liefern knnen.
Wie immer ist dennoch auch davon auszugehen, dass unsauberes Arbeiten, Pipettierfehler
oder alte, bzw. gebrauchte Ausrstung (z.B. mehrfach verwendete Plastikkvetten) die
Ergebnisse verflscht haben. Da alle individuellen Werte nur geringe Abweichungen von der
Regressionsgeraden aufweisen, wird die Beteiligung dieser Faktoren jedoch als gering
angesehen.


Ermittlung der Anzahl essentieller Cysteinreste der ADH

Die errechnete Anzahl von sechs essentiellen Cysteinresten besttigt leider nicht die
theoretische erwartete Anzahl von zwei. Eine Erklrung bietet sich darin, dass mehr
Mercaptogruppen frei zugnglich waren durch unbeabsichtigte Denaturierung des Enzyms.
Im Extremfall knnten eventuell vorkommende Disulfidbrcken im Enzym getrennt worden
sein und weiter den Wert erhht haben. Es besteht angesichts der starken Abweichung eine
hohe Wahrscheinlichkeit, dass es zu Pippetierungsfehlern gekommen ist. In jedem Fall ist die
Anzahl unrealistisch und deshalb das Experiment als gescheitert anzusehen.


Ermittlung aller freien Cysteinreste der ADH

Die Gesamtzahl von 12 Mercaptogruppen, d.h. 12 Cysteinresten je Untereinheit entspricht
nicht den Erwartungen. Obwohl in diesem Versuch das Enzym absichtlich denaturiert wurde,
werden Disulfidbrcken durch Harnstoff nicht gespalten, weswegen dies als Erklrung fr
den hohen Wert ausscheidet. Im Skript des Praktikums wurde eine Zahl von 8 Cystein-Resten
je Monomer angegeben. Nur eine starke Denaturierung die zur Freisetzung von
mglicherweise vorhandenen Disulfidbrcken gefhrt haben kann, wrde die hohe Anzahl
an Mercaptogruppen erklren. Interessanterweise stieg die Anzahl der Mercaptogruppen im
Vergleich zu 3.3 um sechs, was der theoretischen Anzahl der nicht-essentiellen Cystein-
Reste entspricht. Dennoch sind beide Werte eindeutig zu hoch und deshalb nicht
aussagekrftig. Es muss auch hier zu Pipettierfehlern gekommen sein. Eine weitere Erklrung
ist, dass der Extinktionswert zur Bestimmung Konzentration der ADH-Lsung nicht stimmt
und deutlich hher sein sollte. Die hhere Konzentration wirkt sich auf beide Berechnungen
aus und wrde geringere Werte ergeben. Obwohl die Konzentration durchaus realistisch
erscheint, darf dies nicht auer Betracht gelassen werden.