ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF

MTODO RPIDO DE EXTRAO DE DNA UTILIZANDO CTAB EM TECIDOS

MUSCULARES DE SUNOS
1

Bruna Pena Sollro
2
, Danielle Assis De Faria
3
, Samuel Rezende Paiva
5
, Simone Elisa Facioni Guimares
4
, Paulo
Svio Lopes
4
, Dbora Martins Paixo
2

1
Financiamento: CAPES, CNPq, FAPEMIG;
2
Estudante de Graduao UFV;
3
Estudante de Ps-Graduao UFV;
4
Professor Orientador do Departamento de Zootecnia UFV;
5
Pesquisador da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
RESUMO
Estudos bsicos sobre tcnicas de extrao de DNA so de extrema importncia para o sucesso de
trabalhos cientficos no campo da biologia molecular. Diante desta afirmao, o presente trabalho
tem como objetivo avaliar a eficincia do mtodo de extrao de DNA utilizando-se o detergente
catinico CTAB (brometo de cetil-trimetilamnio). Esta tcnica aplicada a variados materiais
biolgicos, foi testada em quatro amostras de tecido muscular de sunos. Depois de extrado o DNA,
duas anlises foram realizadas: Quantificao em espectofotmetro e subseqente amplificao por
PCR (Reao da Polimerase em Cadeia). Os resultados puderam ser observados mediante
visualizao do material amplificado em gel de poliacrilamida 8%. A diluio que apresentou melhor
qualidade e concentrao de DNA para as amplificaes, foi a de 1:10, e as bandas especficas para
os quatro fragmentos do gene da miostatina testados puderam ser observados no gel e confirmam
o bom resultado obtido por essa tcnica. Pde-se concluir que o protocolo vivel, visto que o
material extrado poder ser submetido a amplificaes de marcadores moleculares.
PALAVRAS-CHAVE
Miostatina, PCR, Marcadores Moleculares
A FASTER CTAB TECHIQUE FOR DNA EXTRACTION FROM SWINE MUSCLE
ABSTRACT
Basics studies about DNA extraction techniques are very important for the studies in mollecular
biology area. The present work relates the efficiency of CTAB protocol for DNA extraction (Catonic
hexadecyl trimethyl ammonium bromide). Here is applicated to many biological materials, and was
tested on four samples of swine muscular tissue. After extraction, two analysis were realized:
Quantification in spectrophotometer and PCR amplification. The results were visualized in 8%
polyacrilamide gels. The dilution that showed better quality and concentration for the PCR was
1:10. The especific bands observed for the four fragments of myostatin gene tested, were seen in
the gels and confirm the good results taken whit this method. In conclusion, this protocol is
feasable, because the material could be used in molecular markers by PCR amplifications.
KEYWORDS
Myostatin, PCR, Molecular Markers
Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 1/4
ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF
INTRODUO
O DNA corresponde matria prima para
qualquer conhecimento de ordem gentica.
Os estudos de polimorfismos de DNA so
importantes visto que podem estar
associados a caractersticas de interesse
econmico, portanto, estudos bsicos sobre
tcnicas de extrao de DNA de alta
qualidade so cruciais para o
desenvolvimento de pesquisas no campo da
biologia molecular.
A tcnica de extrao com o uso de brometo
de cetil-trimetil amnio (CTAB) muito
aplicada em tecidos vegetais, e tambm a
uma variedade de outros materiais biolgicos
como sangue, smen, folculo piloso e tecidos
orgnicos. Alm disso, essa tcnica permite
facilmente acomodar uma grande variao de
quantidades iniciais de tecido, at mesmo
miligramas de tecido mumificado, fossilizado
ou herbarizado (FERREIRA e GRATTAPAGLIA,
1998).
Este trabalho teve como objetivo, testar o
protocolo de extrao de DNA, a partir de
modificaes do protocolo de Boyce et. al.
(1989) por CTAB em tecidos musculares
coletados de sunos aps o abate, bem como
verificar sua qualidade para utilizao em
experimentos que utilizem a tcnica da
Reao da Polimerase em Cadeia (PCR).
MATERIAL E MTODOS
Foram coletadas quatro amostras de msculo
Semimembranosus, vulgarmente conhecido
como coxo-mole, de sunos de linhagem
comercial aps o abate. Aps o abate, as
amostras foram condicionadas em etanol
absoluto para a fixao dos tecidos. Todos os
procedimentos aps a coleta dos tecidos
foram realizados no Laboratrio de
Biotecnologia Animal, sediado no
Departamento de Zootecnia, da Universidade
Federal de Viosa, cerca de dois meses aps
a estocagem dos tecidos.
No laboratrio, instrumentos cirrgicos foram
imersos em etanol 95% e flambados para
esterilizao na retirada de cada amostra. O
DNA foi extrado de fragmentos com 1cm3.
Esta quantidade foi inserida em microtubos
de 1,5ml, estes foram deixados abertos a
temperatura ambiente por 15 minutos para
evaporao do etanol. Em seguida, foi
acrescentado 500ul de CTAB (16,36g NaCl;
400 ul -mercapto-etanol; 20 mL 1M Tris-HCl
pH 8,0; 8 mL 0,5 M Na2, EDTA pH8,0; 4 g
CTAB e gua milliQ para 200ml) em cada
tubo. Os fragmentos foram macerados com
pistilos e incubados em banho-Maria a 65C
por uma hora; sendo a suspenso misturada
com o auxlio de vortex a cada 20 minutos.
Aps este perodo, o material foi centrifugado
a 15800 g por 2 minutos e o sobrenadante
transferido para microtubos contendo 500 ul
de clorofrmio: lcool isoamlico (24:1). A
soluo foi homogeneizada e centrifugada a
15800 g por 15 minutos, para a precipitao
das protenas na interface entre o CTAB e o
clorofrmio. O sobrenadante obtido foi
transferido para um terceiro conjunto de
tubos contendo 250 ul de isopropanol
resfriado (-20C) sendo ento,
homogeneizado e mantido por um perodo
mnimo de 30 min. em geladeira (4C).
Os tubos foram ento centrifugados a 15800
g por 30 min. para precipitao e formao
do pelete de DNA. O sobrenadante foi
descartado e foi adicionado 1ml de etanol
75% para desidratao das amostras. Aps a
adio do etanol, as amostras foram
centrifugadas a 15800 g por dois minutos.
Uma nova lavagem com etanol 100% foi
realizada para completa desidratao do
DNA. Finalmente, aps a remoo do
sobrenadante, o material foi seco a
temperatura ambiente, ressuspendido em
Tris-HCl 1M- EDTA 0,5M pH 8,0 e
posteriormente estocado -20C.
Aps a extrao o DNA foi submetido a dois
testes: 1) quantificao em um
espectrofotmetro para avaliao de
concentrao e qualidade; 2) amplificao
por PCR do DNA extrado a partir de
diferentes diluies do mesmo (1:10, 1:25,
1:50). Este ltimo teste foi realizado para
verificar se a extrao foi bem sucedida e
qual diluio apresentaria a melhor resoluo
quando submetido a sucessivas amplificaes
Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 2/4
ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF
com primers especficos para quatro
diferentes regies do gene da miostatina em
sunos.
As amplificaes por PCR foram realizadas
num volume final de 20ul para os quatro
fragmentos do gene. Aps a PCR foi retirada
uma alquota de 5ul de cada material
amplificado e a visualizao feita em gel de
poliacrilamida 8%, corado com nitrato de
prata.
RESULTADOS E DISCUSSO
Nos resultados obtidos, as quatro amostras
de DNA extradas pelo protocolo de CTAB
apresentaram concentraes e qualidades
satisfatrias Quando analisadas por
espectrofotometria referente a concentrao
de DNA e a pureza expressa pela razo
A260/A280, que indica o nvel de
contaminao das amostras por protena. A
razo A260/A280 esperada como satisfatria
de 1.8 a 2.0 (de acordo com SAMBROOK
et. al., 1998). Como as razes obtidas no
presente experimento encontram-se dentro
desta faixa, todas as extraes com CTAB
foram de boa qualidade, conforme a tabela 1.
Na amplificao realizada com os referidos
fragmentos do gene da miostatina, a diluio
de 1:10 apresentou bandas especficas e com
qualidade superior s demais diluies (1:25
e 1:50). Selecionou-se quatro regies do
gene da miostatina para serem amplificados
neste experimento, por que todos eles
apresentam amplificaes de boa eficincia e
grande especificidade.
Trabalhos recentes comprovam a eficincia
do mtodo de extrao de DNA por CTAB de
folculos pilosos da espcie caprina
(MENDONA, 2003). Outros estudos ainda
enfatizam a utilizao desse mtodo em
extrao de DNA de peixes (PAIVA, 2001).
De maneira geral, o mtodo de extrao por
CTAB rpido, barato e possvel de ser
realizado, inclusive, em laboratrio de
pequena a mdia infra-estrutura.
Vrios procedimentos de extrao de DNA
tm sido descritos na literatura, observando-
se que protocolos padro so utilizados com
algumas modificaes visando resolver os
problemas especficos da espcie em estudo.
No se pode esquecer que a maneira
utilizada para coletar e preservar o tecido
uma considerao importante em qualquer
procedimento de extrao de DNA. O
isolamento do DNA afetado
significativamente pela condio do tecido
antes da extrao. Por isso, recomenda-se
utilizar material o mais fresco possvel
(FERREIRA e GATTAPAGLIA, 1998). Na atual
descrio, apesar das amostras terem sido
coletadas em animais j abatidos, as mesmas
foram mantidas em etanol absoluto, durante
dois meses, o que garantiu boa qualidade do
tecido.
Os resultados obtidos na amplificao dos
quatro fragmentos do gene da Miostatina,
confirma a viabilidade do protocolo de
extrao utilizado. O maior grau de pureza de
amostras de DNA caracterizado pela sua
capacidade de ser utilizado para amplificao
de genes que podero ser submetidos
tcnica de sequenciamento. Portanto, diante
dos resultados, este mtodo pode assegurar
excelente material, capaz de ser aplicado a
amplificaes de qualquer tipo de marcadores
como genes candidatos.
CONCLUSES
No referido trabalho foi possvel avaliar a
qualidade e a eficincia do detergente CTAB
utilizado na extrao de DNA de tecido
muscular de sunos. A boa resoluo
identificada na amplificao e a razo
A260/A280 satisfatria foram suficientes para
concluir que esse DNA apresenta alta
qualidade e que pode ser utilizado para
sequenciamento de fragmentos de genes
candidatos, como a miostatina, que foi aqui
usado.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Mitochondrial DNA in bark weevils: size,
structure, and heteroplasmy.Genetics
v.123,p.825-836,1989.
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Introduo ao Uso de Marcadores
Moleculares em Anlise Gentica. Braslia:
Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia. 1998. 220p.
Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 3/4
ZOOTEC2004, 28 a 31 de maio de 2004 Braslia, DF
MENDONA, P.T.; ARAJO, A.M.;
GUIMARES, S.E.F.; COLUMBIANO, V.S.;
SILVA, P.V.C.; LOPES, P.S . Tcnica de
extrao de DNA de folculos pilosos em
caprinos. In: XIII Simpsio de Iniciao
Cientfica (SIC), 2003. CD Room.
PAIVA, S.R . Influncia de obstculos naturais
na divergncia de populaes de Astyanax
bicamulatus na Bacia do Rio Doce- MG.
Viosa- MG: UFV, 2001. Tese ( Mestrado em
Gentica e Melhoramento)- Universidade
Federal de Viosa, 2001.
SAMBROOK, J.; FRITSH, E.F.; MATIAS, T .
Molecular cloning: a laboratory manual. New
York: Cold Sring Harbor Lab. Press. 1998,
2
nd
ed.



TABELA 1. Quantificao das amostras de DNA extradas de tecido muscular de sunos
Amostra A 260nm A 280nm [ ] DNA (ng/ul) Razo
1 0,449 0,234 887,6 1,933
2 0,824 0,440 1638,9 1,879
3 0,766 0,418 1511,9 1,853
4 0,916 0,484 1828,2 1,898
A 260nm Absorbncia medida a 260nm; A 280nm Absorbncia medida a 280nm; [ ] DNA ng/ul Concentrao de DNA
ng/ul; Razo Frao entre A260 nm e A280 nm.
Realizao: ABZ, AZOO-DF, FACULDADES UPIS 4/4