Revisin

NotiWiener N 161 - Septiembre 2013 - 1

N161
Ao XLVII 09/2013
El laboratorio prctico
Variables preanalticas
Un factor a tener en cuenta en
el laboratorio de anlisis. Parte 3

Pag. 7
Artculo de investigacin
WL Check Chagas para la deteccin
de anticuerpos contra Trypanosoma
cruzi en suero, plasma y sangre en-
tera
Pag. 3
Desde su desarrollo inicial en la dcada
de 1980, los ensayos rpidos inmunocro-
matogrficos de flujo lateral han ganado
amplia aceptacin en el mercado del diag-
nstico in vitro. La razn principal de su
notoriedad radica, entre otras ventajas, en
la simplicidad del diseo. Son compactos,
fciles de transportar y almacenar ya que
no requieren cadena de fro. Por otra par-
te, los protocolos de uso son muy simples
y no demandan personal altamente espe-
cializado para su utilizacin. Los resulta-
dos son rpidos y fciles de interpretar al
ojo desnudo sin necesidad de un instru-
mento. La tecnologa ha demostrado ser
muy eficaz y contina en evolucin. Ac-
tualmente se comercializan ensayos para
la deteccin de mltiples analitos en un
mismo dispositivo. Por otra parte, gracias
a la aparicin de instrumentos de lectura,
en la actualidad, se encuentran en desa-
rrollo ensayos cuantitativos y semicuan-
titativos.
Historia de los ensayos rpidos inmuno-
cromatogrficos
El desarrollo de los ensayos inmunocro-
matogrficos, tambin conocidos como
inmunoensayos de flujo lateral, es el re-
sultado de la convergencia de varios hitos
que se remontan a la dcada de 1950.
Fue en ese momento donde los primeros
ensayos de aglutinacin de ltex y los in-
munoensayos basados en placas fueron
desarrollados. Los principios bsicos de
la tecnologa de flujo lateral continuaron
su evolucin durante la dcada de 1980.
La tecnologa se estableci firmemente
durante los ltimos aos de esa dcada
con la presentacin de varias patentes
importantes por parte de empresas como
Becton Dickinson, Unilever y Carter Walla-
ce. La principal aplicacin que condujo al
desarrollo temprano de la tecnologa de
los ensayos inmunocromatogrficos fue la
prueba de embarazo humano.
Para desarrollar totalmente la plataforma
de las pruebas rpidas de flujo lateral, tal
como se la conoce hoy en da, una gran va-
riedad de tecnologas fueron necesarias:
fabricacin de membranas de nitrocelulo-
sa, generacin de anticuerpos, tecnologa
de dispensacin de fluidos y equipos de
procesamiento, as como la evolucin de
una masa crtica de conocimiento en de-
sarrollo y en metodologas para la fabrica-
cin de este tipo de ensayos. Todos estos
elementos convergieron en una mezcla de
productos qumicos complejos, sustancias
biolgicas, papeles, polmeros y procesos
que dio como resultado una prueba sim-
ple, fcil de usar y capaz de proporcionar
al usuario resultados de calidad en una
gran variedad de aplicaciones. Muchas
de estas tecnologas facilitadoras han
evolucionado a lo largo de la dcada de
Artculo de investigacin
WL Check HIV 1+2 para la deteccin
de anticuerpos antiHIV1, anti
HIV1 grupo O y antiHIV2 en suero,
plasma y sangre entera


Pag. 5
Ensayos rpidos inmunocromatogrficos de flujo lateral
Lic. Mariano Traina y Bioq. Mara Victoria Felcaro (mariavictoria.felcaro@wiener-lab.com)
Centro de Investigacin y Biotecnologa Wiener Laboratorios SAIC, Rosario Argentina.
1990 y muchas de ellas han alcanzado la
madurez. Hacia 2006, ms de 200 empre-
sas de todo el mundo haban producido
distintos ensayos en este formato con un
valor total de aproximadamente 2.100
millones de dlares. La aplicacin de esta
tecnologa se ha expandido mucho ms
all de los ensayos de diagnstico clni-
co alcanzando reas tan diversas como la
veterinaria, la agricultura, la alimentacin
y la seguridad ambiental.
Arquitectura de un ensayo rpido inmu-
nocromatogrfico de flujo lateral
Los ensayos tradicionales estn compues-
tos por una variedad de materiales, cada
uno de los cuales cumple al menos una
funcin determinada. Los distintos com-
ponentes se superponen unos sobre otros
y se montan a presin en una tira pls-
tica con adhesivo (Figura 1). Esta tira es
colocada generalmente en un casete para
su uso. La tira reactiva consta de varias
zonas constituidas por almohadillas de di-
ferentes materiales. Las almohadillas son
comnmente conocidas por su nombre en
idioma ingls como pads. Cuando se
realiza un ensayo, la muestra se aade al
extremo proximal de la tira donde se en-
cuentra el pad de muestra. En este pad la
muestra es tratada o modificada para que
sea compatible con el resto del sistema.
Por ejemplo, en el caso de una muestra de
Artculo on-line
Revisin
Ensayos rpidos inmunocromatogrficos de flujo lateral
2 - NotiWiener N 161 - Septiembre 2013
sangre entera, el pad de muestra cumple
la funcin de retener los glbulos rojos y
dejar pasar el plasma. En el caso de una
muestra de orina el pad de muestra con-
tiene sales capaces de tamponar la mues-
tra para que ingrese al sistema con un de-
terminado pH. La muestra tratada migra
a travs de esta regin hacia el siguiente
pad donde se encuentra inmovilizado un
conjugado de partculas las cuales tpica-
mente son de oro coloidal o de ltex colo-
reado. Dichas partculas son previamente
conjugadas con uno de los componentes
biolgicos especficos del ensayo, ya sea
un antgeno o anticuerpo, segn el for-
mato del ensayo. La muestra rehidrata y
solubiliza el conjugado seco que se en-
cuentra inmovilizado en el pad. De esta
manera, el analito presente en la muestra
interacta con el conjugado. Esta mezcla
migra por capilaridad hacia la siguien-
te seccin de la tira constituida por una
membrana de nitrocelulosa que funciona
como la matriz de reaccin. Esta matriz
de reaccin es una membrana porosa, en
la cual el otro componente biolgico es-
pecfico del ensayo se encuentra inmovi-
lizado. Comnmente, estos componentes
son protenas, ya sean anticuerpos o an-
tgenos, ubicados en forma de bandas en
las reas especficas de la membrana que
sirven para capturar el analito y el conju-
gado a medida que migran a travs de la
membrana. El exceso de reactivos migra
ms all de las lneas de captura y queda
atrapado en el pad absorbente ubicado en
el otro extremo de la tira. Los resultados
se interpretan en la matriz de reaccin
como la presencia o ausencia de lneas de
conjugado capturado. Los formatos de en-
sayo pueden ser directos o competitivos.
Por una parte, los ensayos directos son
los ms comunes y son utilizados princi-
palmente cuando la intencin es detec-
tar analitos de gran tamao que poseen
mltiples sitios antignicos, tales como
hCG, antgenos de Dengue o del virus de
la inmunodeficiencia humana (Figura 2).
En este caso, un resultado positivo es in-
dicado por la presencia de una lnea de
prueba (lnea T). Algunas de las partcu-
las conjugadas no sern capturados en la
lnea de captura y continuarn fluyendo
hacia la segunda lnea de anticuerpos in-
movilizados, la lnea de control (lnea C).
Esta lnea de control normalmente contie-
ne una especie especfica del anticuerpo
antiinmunoglobulina, especfico para el
anticuerpo presente en el conjugado de
partculas. Por otra parte, los formatos
competitivos se utilizan mayormente para
la deteccin de molculas de pequeo ta-
mao que poseen determinantes antig-
nicos nicos y por lo cual no pueden unir a
dos anticuerpos simultneamente. En este
formato, la interpretacin es contraria por
lo que un resultado positivo se indica por
la ausencia de una lnea de prueba T en
la matriz de reaccin. La lnea de control
C debe formarse, independientemente del
resultado de la lnea de prueba T.
Utilidad de los ensayos rpidos inmuno-
cromatogrficos de flujo de lateral
Los ensayos rpidos inmunocromatogr-
ficos de flujo lateral constituyen una tec-
nologa bien establecida y resultan muy
apropiados cuando se aplican a una am-
plia variedad de ensayos tanto en entor-
nos clnicos como en ensayos de campo.
Las ventajas de este tipo de pruebas son
evidentes y pueden ser resumidas en una
lista de puntos (Tabla 1).
Perspectiva
La tendencia hacia el formato de ensayo
descentralizado y cercano al paciente no
es nueva pero parece estar destinada a
continuar creciendo. Cada da, un mayor
nmero de empresas se abocan a este
mercado. Recientemente, Wiener lab. ha
desarrollado y lanzado al mercado su nue-
va lnea de ensayos rpidos WL Check.
WL Check Chagas y WL Check HIV
1+2 son los primeros productos de esta
lnea desarrollados y fabricados comple-
tamente en Argentina.
Pocillo de Muestra
Pad de Muestra
Pad de Conjugado
Membrana
Pad Absorbente
Lnea de Prueba T
Lnea de Control C
Casete
Conjugado Lnea T Lnea C
Muestra/Analito
Tira Reactiva
Resultado Positivo
Resultado Negativo
Figura 1. Estructura de un ensayo rpido inmunocromatogrfico de flujo lateral. Figura 2. Ensayo Inmunocromatogrfico en formato directo.
Tabla 1. Puntos fuertes de los ensayos inmunocromatogrficos
Punto Fuerte Comentario
Procesamiento rpido
Baja infraestructura
Facilidad de uso
Estabilidad
Almacenamiento
Volumen y tipo de
muestra
Resultado
Multiplexing
Tecnologa consolidada
Resultados in situ en 5 a 30 minutos.
Los reactivos listos para usar. Sin equipamiento requerido.
Interpretacin de resultados muy simples. No requieren un operador alta-
mente calificado.
Vida til en estantera entre 18 y 24 meses.
Se conservan entre 2C y 30C. Simplifica la logstica.
Volmenes en el orden del L. Varios tipos de muestras como sangre entera,
suero, plasma, saliva, orina, materia fecal, etc.
Lectura visual. Tambin existen lectores que integran los resultados a Siste-
mas Informticos de Laboratorio y aplicaciones para telfonos inteligentes.
Pueden detectar varios analitos al mismo tiempo en un mismo casete.
Esto ha permitido desarrollar y manufacturar ensayos con alta sensibilidad,
especificidad y reproducibilidad.
NotiWiener N 161 - Septiembre 2013 - 3
Significacin clnica
La enfermedad de Chagas es una infec-
cin parasitaria producida por Trypano-
soma cruzi. A nivel mundial, se calcula
que unos 10 millones de personas estn
infectadas, principalmente en Amrica
Latina donde la enfermedad de Chagas
es endmica. Ms de 25 millones de per-
sonas estn en riesgo de adquirir la en-
fermedad. El diagnstico de laboratorio
depende del estadio en el cual se encuen-
tre la enfermedad. Durante la fase agu-
da, el diagnstico se efecta mediante la
comprobacin directa de los parsitos en
sangre o por mtodos inmunolgicos que
detecten anticuerpos tipo IgM. Durante la
fase crnica, es posible utilizar mtodos
inmunolgicos tales como hemaglutina-
cin, inmunofluorescencia, ensayo inmu-
noenzimtico o Western blot. Dado que
ninguno de estos ensayos rene, indivi-
dualmente, las condiciones ptimas de
sensibilidad y especificidad, se recomien-
da el uso en paralelo de al menos dos en-
sayos serolgicos distintos para confirmar
la infeccin por T. cruzi. Dada su simple-
za y rapidez, los ensayos inmunocroma-
togrficos constituyen una herramienta
complementaria de gran utilidad que fa-
cilita la deteccin precoz de la infeccin
tanto para ensayos epidemiolgicos de
campo como para el diagnstico clnico.
En este sentido, WL Check Chagas es un
ensayo rpido basado en una combina-
cin especial de antgenos recombinantes
capaces de detectar cualitativamente la
presencia de anticuerpos antiT. cruzi en
suero, plasma y sangre entera.
Fundamentos del mtodo
El ensayo consta de un casete plstico
que contiene, como primer elemento im-
portante, una membrana de nitrocelulosa
sensibilizada en la zona de prueba T
con antgenos recombinantes especfi-
cos de los estadios epimastigote y tripo-
mastigote de T. cruzi (Figura 1). Como
segundo elemento importante el casete
contiene un pad impregnado con antge-
nos recombinantes especficos de T. cruzi
conjugados a oro coloidal. La muestra y el
buffer se agregan en el pocillo de muestra
y esta mezcla solubiliza el conjugado de
antgenos recombinantes. Si la muestra
es reactiva, los anticuerpos antiT. cruzi
presentes formarn un complejo con los
antgenos conjugados a oro coloidal que
resultar inmovilizado en la zona de prue-
ba T de la membrana de nitrocelulosa
para dar lugar a una lnea de color rosa
rojo prpura.
Procedimiento, interpretacin y valida-
cin de los resultados
El procedimiento para llevar adelante el
ensayo y obtener los resultados sigue un
esquema muy sencillo. Es posible agregar
tanto suero, plasma como sangre entera
(40 L) al pocillo de muestra de un case-
te debidamente rotulado. Seguidamente
se agrega el reactivo B (3 gotas/100 L)
en el mismo pocillo de muestra y se deja
reposar el casete por 25-35 minutos a 18-
30C. Luego de este periodo el resultado
puede ser interpretado visualmente. Para
el caso de un resultado positivo se ob-
servan dos lneas de color rosarojo pr-
pura, una en la zona de prueba T y otra
en la zona de control C. La intensidad
de color de la lnea T depender de la
muestra en estudio. Cualquier color rosa-
do visible, aunque sea muy tenue, debe
ser interpretado como positivo. El resulta-
do es positivo aunque las intensidades del
color de las lneas T y C sean dife-
rentes. Para el caso de un resultado ne-
gativo, se observa solamente una lnea
de color rojorosa prpura en la zona de
control C. En lo que refiere al criterio
de validacin del resultado, la ausen-
cia de la lnea de color rosarojo prpu-
ra en la zona de control C invalida el
resultado, aunque se encuentre o no pre-
sente la lnea de color rosarojo prpura
en la zona de prueba T. Esto puede de-
berse a un error en la realizacin del pro-
cedimiento o un problema con la muestra.
Con determinadas muestras pueden apa-
recer dificultades como migracin incom-
pleta, muestra muy viscosa o presencia de
fibrina. Cualquiera sea el caso, es necesa-
rio revisar el procedimiento, centrifugar
nuevamente la muestra y repetir el ensayo
utilizando un nuevo casete.
Datos de performance
Sensibilidad. La sensibilidad clnica fue
evaluada utilizando (i) paneles de per-
formance internacionales, (ii) controles
internacionales y (iii) una serie de paneles
de muestras clnicas reactivas de distin-
tos centros de salud (Tabla 1). En lo que
refiere a muestras clnicas, en un primer
estudio realizado sobre un panel de 326
muestras reactivas por ELISA y hemaglu-
tinacin indirecta (HAI), la sensibilidad
obtenida fue de 93,87%. Por otra parte,
en un segundo estudio realizado sobre 83
muestras reactivas de nios provenientes
de regin endmica para la infeccin por
T. cruzi, se detectaron 78 muestras reac-
tivas. Finalmente, en un estudio realizado
en un Centro de Referencia para el Diag-
nstico de Chagas se analiz un panel de
72 muestras reactivas obtenindose una
sensibilidad de 98,61%. En un estudio
separado, se evaluaron 106 muestras re-
activas de plasma y sangre entera obte-
nidas del mismo paciente en paralelo. En
el caso de los plasmas se detectaron 106
WL Check Chagas para la deteccin de anticuerpos contra
Trypanosoma cruzi en suero, plasma y sangre entera
Artculo de investigacin
Lic. Mariano Traina.
Centro de Investigacin y Biotecnologa Wiener Laboratorios SAIC, Rosario Argentina
Figura 1. Estructura del Ensayo WL Check Chagas.
Muestra
Pad de
Muestra
Pad de
Conjugado
Membrana
Nitrocelulosa
Lnea T Lnea C
Pad
Absorbente
Tira
Antgenos T. Cruzi -
Oro coloidal
Artculo on-line
Artculo de investigacin
WL Check Chagas para la deteccin de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en suero, plasma y sangre entera
4 - NotiWiener N 161 - Septiembre 2013
muestras como reactivas, mientras que
en el caso de la sangre entera resultaron
reactivas 97 muestras.
Especificidad. La especificidad de WL
Check Chagas fue determinada median-
te tres estudios diferentes (Tabla 2). Por
una parte, en un primer estudio realiza-
do sobre 1.419 muestras de suero, plas-
ma y sangre entera provenientes de tres
centros de salud diferentes, el ensayo
mostr una especificidad de 97,89%. En
un ensayo complementario se evalu la
performance en distintas matrices, para
200 muestras se emplearon en forma-
paralela suero y plasma del mismo pa-
ciente. Tambin se evalu sangre entera
obtenida por puncin capilar para 17 de
estas 200 muestras. Con todos los tipos
de muestras provenientes de este estu-
dio alternativo se tuvieron resultados
negativos. Por otra parte, en un segundo
estudio realizado sobre 313 muestras de
banco de sangre, la especificidad obteni-
da para WL Check Chagas fue de 98,08%.
Finalmente, tambin se estudi la posible
aparicin de reactividades cruzadas ensa-
yando muestras provenientes de 257 indi-
viduos con diferentes condiciones clnicas
que pueden ser causantes de reacciones
inespecficas para el ensayo WL Check
Chagas. Para esta poblacin la especifici-
dad fue de 98,44%. Cabe resaltar que en
este muestreo se incluyeron 12 plasmas
de pacientes con Leishmaniasis cutnea
y 12 con Leishmaniasis mucocutnea.
Es comn que las muestras de pacientes
con estas patologas tiendan a dar lugar
a reacciones cruzadas e inespecficas. WL
Check Chagas no present reacciones
cruzadas por Leishmaniasis en ninguna
de las muestras evaluadas.
Precisin. Se evalu la precisin de
WL Check Chagas siguiendo el protoco-
lo EP5A recomendado por el CLSI. Los
ensayos fueron llevados adelante con 4
muestras positivas con diferentes niveles
de reactividad y con 1 muestra negativa
(Tabla 3). Como parte del protocolo EP5
A se llevaron adelante 2 ensayos diarios
evaluando cada muestra por duplicado
por el transcurso de 20 das. Los resulta-
dos fueron ledos a los 25 minutos de ini-
ciada la reaccin en forma visual directa
por 3 operarios independientes y de for-
ma instrumental utilizando un lector de
ensayos inmunocromatogrficos. Tanto
las muestras positivas como las negativas
fueron identificadas correctamente en el
100% de los casos ensayados.
Tabla 1. Datos de performance referidos a la sensibilidad de WL Check Chagas
Paneles
PMT 202
PP 0407
PP 0508
PP 0409
VIROTROL Chagas
ACCURUN 190
Centro de Salud I
Nios provenientes de
regin endmica
Centro de Referencia para el
Diagnstico de Chagas
Muestras Reactivas Detectadas
13/14
16/16
16/16
16/16
1/1
1/1
306/326
78/83
71/72
Sensibilidad (%)
98,44
(IC
95%
= 91,6099,96)
93,87
(IC
95%
= 91,1196,62%)
93,98
(IC
95%
= 86,5098,01%)
98,61
(IC
95%
= 92,5199,96%)
Tabla 2. Datos de performance referidos a la especificidad de WL Check Chagas
Muestras
1.419 muestras de distintos Centros de Salud
313 muestras de banco de sangre
257 muestras con diferentes condiciones clnicas
Especificidad (%)
97,89
(IC
95%
= 97,1098,67%)
98,08
(IC
95%
= 96,4099,76%)
98,44
(IC
95%
= 96,73100,0%)
Tabla 3. Datos de performance referidos a la Precisin de WL Check Chagas
Lnea Muestra Media (DO) Intraensayo Total
S CV (%) S CV (%)
Lnea T Muestra (+) 1 0,590 0,068 11,61 0,067 11,38
Muestra (+) 2 0,437 0,047 10,86 0,050 11,36
Muestra (+) 3 0,401 0,056 13,87 0,054 13,57
Muestra (+) 4 0,145 0,020 13,74 0,021 14,45
Lnea C Muestra (+) 1 0,833 0,076 9,18 0,079 9,45
Muestra (+) 2 0,851 0,062 7,30 0,059 6,96
Muestra (+) 3 0,873 0,066 7,51 0,066 7,54
Muestra (+) 4 0,846 0,061 7,25 0,071 8,34
Muestra () 0,812 0,061 7,47 0,078 9,64
n=80, ():no reactivo por lectura visual, DO: Densidad ptica, S: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin
Conclusiones
Como conclusin se puede remarcar que
WL Check Chagas presenta una perfor-
mance adecuada para ser utilizado como
herramienta complementaria en el tami-
zado y diagnstico precoz de la infeccin
por T. cruzi. En suma a esto, dada las
caractersticas de estabilidad a tempera-
tura ambiente, la sencillez de la tcnica,
la posibilidad de utilizar distintos tipos de
muestras y de ser ensayados junto al pa-
ciente en el punto de atencin, WL Check
Chagas puede ser utilizado tanto en en-
tornos clnicos como no clnicos.
Muestra original
Realizar otra prueba
(ej.: ELISA) y confirmar
por Western Blot
POSITIVO NEGATIVO
Uno o ambos duplicados
Positivos por WL Check HIV 1+2
Ambos duplicados Negativos
por WL Check HIV 1+2
Resultado Positivo por
WL Check HIV 1+2
Repetir por duplicado
NEGATIVO
Resultado Negativo por
WL Check HIV 1+2
NotiWiener N 161 - Septiembre 2013 - 5
Artculo de investigacin
WL Check HIV 1+2 para la deteccin de anticuerpos antiHIV1,
antiHIV1 grupo O y antiHIV2 en suero, plasma y sangre entera
Bioq. Mara Victoria Felcaro (mariavictoria.felcaro@wiener-lab.com).
Centro de Investigacin y Biotecnologa Wiener Laboratorios SAIC, Rosario Argentina
Significacin clnica
No es necesario destacar la relevancia del
diagnstico del HIV en la medicina actual.
En lo que refiere al aspecto del laborato-
rio bioqumico, los Centros para el Con-
trol y la Prevencin de Enfermedades de
EE.UU. (CDC), en su iniciativa Advancing
HIV Prevention destacan la importancia
de la utilizacin de pruebas rpidas de de-
teccin del HIV. Esto facilita el acceso al
diagnstico precoz en zonas de alta pre-
valencia, en individuos de alto riesgo o en
zonas donde otros mtodos de diagnsti-
co como ELISA, Western Blot o amplifica-
cin de cidos nucleicos no se encuentren
disponibles. Tambin son de gran utilidad
en el momento del parto, especialmente
para el diagnstico de mujeres que no
hayan sido controladas durante el emba-
razo. Por otra parte, estas pruebas rpidas
constituyen una herramienta de tamizaje
que puede desempear un papel impor-
tante en campaas de prevencin y diag-
nstico en entornos clnicos y no clnicos,
facilitando de esta manera, la deteccin
precoz de la infeccin. En este sentido, WL
Check HIV 1+2 es una prueba rpida cua-
litativa de tamizaje que detecta conjunta-
mente la presencia de anticuerpos anti
HIV1, antiHIV1 grupo O y antiHIV2.
Fundamentos del mtodo
De manera similar al ensayo WL Check
Chagas mostrado en este mismo Notiwie-
ner, el ensayo consta de un casete plstico
que contiene a una membrana de nitroce-
lulosa sensibilizada con antgenos recom-
binantes para HIV1 y HIV2 en la zona
de prueba T y un pad impregnado con
antgenos recombinantes especficos para
HIV1 y HIV2 conjugados a oro coloidal.
Si la muestra es reactiva, los anticuerpos
antiHIV1 y/o HIV2 presentes formarn
un complejo con los antgenos conjuga-
dos a oro coloidal y los antgenos inmo-
vilizados en la zona de prueba T para
dar lugar a una lnea de color rosarojo
prpura.
Procedimiento, interpretacin y valida-
cin de los resultados
El procedimiento para llevar adelante el
ensayo y obtener los resultados sigue un
esquema muy sencillo. Es posible agre-
gar tanto suero o plasma (10 L) como
sangre entera (20 L) al pocillo de mues-
tra de un casete debidamente rotulado.
Seguidamente, se agrega el reactivo B
(3 gotas/100 L) en el mismo pocillo de
muestra y se deja reposar el casete por
20-30 minutos a 18-30C. Luego de este
periodo el resultado puede ser interpreta-
do visualmente. Tal como el caso de WL
Check Chagas mostrado en este mismo
Notiwiener, para el caso de un resulta-
do positivo se observan dos lneas de
color rosarojo prpura sin importar que
tan intensas sean, ni la diferencia relati-
va de intensidades entre ellas. Segn el
algoritmo diagnstico, los resultados po-
sitivos deben ser confirmados mediante
la repeticin por duplicado (Figura 1). Por
otra parte, para el caso de un resultado
negativo se observar solamente una
lnea de color rojorosa prpura en la
zona de control C. Finalmente, como
criterio de validacin del resultado,
es necesario notar que la ausencia de la
lnea de color rosarojo prpura en la
Panel Muestras reactivas detectadas
Paneles de Performance Internacionales (BBI, QPanel)
PRB 108 13/14
PRB 204 23/23
PRZ 204 14/14
PRZ 205 14/14
PRZ 207 14/14
PRB 601 15/15
WWRB 303 13/14
WWRB 350 18/18
PP 0508 16/16
PP 0409 16/16
PA 0409 5/5
PA 0809 5/5
Paneles de muestras reactivas
Seroteca 45/45
Panel interferentes 19/19
HIV1 grupo O 4/4
Sueros/plasmas mismo paciente 15/15
Total 249/251
Sensibilidad= 99,20% (IC
95%
= 97,14%99,78%)
Figura 1. Algoritmo diagnstico para el uso de WL Check HIV
1+2. Es necesario tener en cuenta las normativas especficas de
cada pas para el diagnstico del HIV.
Tabla 1. Datos de performance de WL Check HIV 1+2 referidos a la Sensibilidad Clnica en
paneles de performance y de muestras reactivas.
Artculo on-line
6 - NotiWiener N 161 - Septiembre 2013
Muestras Especificidad (%)
1.122 muestras de distintos Centros de Salud 99,91% (IC
95%
=99,49%99,98%)
393 muestras de distintos Centros de Salud 99,24% (IC
95%
=97,78%99,74%)
417 muestras de donantes de sangre 99,76% (IC
95%
=98,65%99,96%)
440 muestras con diferentes condiciones clnicas 98,18% (IC9
95%
=96,45%99,08%)
Tabla 3. Datos de performance de WL Check HIV 1+2 referidos a especificidad
zona de control C invalida el resultado.
Es responsabilidad del usuario efectuar el
Control de Calidad del equipo de acuerdo
a las normas locales vigentes.
Datos de performance
Sensibilidad. Los estudios de performan-
ce referidos a sensibilidad clnica en pane-
les de muestras reactivas confirmadas fue-
ron llevados adelante mediante el ensayo
de distintos paneles comerciales de reco-
nocimiento internacional y serotecas no-
comerciales (Tabla 1). De este estudio se
obtuvo una sensibilidad total del 99,20%.
La sensibilidad clnica fue estudiada tam-
bin con paneles de seroconversin (Tabla
2). En este estudio realizado sobre dife-
rentes paneles comerciales internaciona-
les de seroconversin, se obtuvo un com-
portamiento similar a los ensayos ELISA
de 3
ra.
Generacin.
Especificidad. La especificidad del en-
sayo inmunocromatogrfico fue deter-
minada en cuatro estudios (Tabla 3). En
un primer estudio realizado sobre 1.122
muestras de suero, plasma y sangre ente-
ra provenientes de tres centros de salud
diferentes, se encontr una especificidad
de 99,91%. Por otra parte, en otro estudio
realizado sobre 417 muestras de banco de
sangre, la especificidad obtenida fue de
99,76%. Con el objeto de evaluar el efec-
to de distintas matrices sobre la perfor-
mance, para 100 de las 417 muestras, se
ensayaron en forma paralela tanto suero
como plasma del mismo paciente y para
40 de estas 100 muestras tambin se en-
say sangre entera obtenida por puncin
capilar. Con todos los tipos de muestras
se tuvieron resultados negativos. En un
tercer estudio de 393 muestras de sueros
y plasmas de tres centros de salud dife-
rentes, se encontr una especificidad de
99,24%. Finalmente, tambin se estudi
la posible aparicin de reactividades cru-
zadas ensayando muestras provenientes
de 440 individuos con diferentes condi-
ciones clnicas que pueden ser causantes
de reacciones inespecficas. Estas condi-
ciones incluyen mujeres embarazadas,
pacientes hemodializados, pacientes con
enfermedades autoinmunes o enferme-
dades infecciosas diferentes a HIV (Cha-
gas, HTLV, Hepatitis C, Hepatitis B, Sfilis
y otras). Para esta poblacin la especifici-
dad fue de 98,18%.
Precisin. Se evalu la precisin del en-
sayo siguiendo el protocolo EP5A reco-
mendado por el CLSI. Los ensayos fueron
Tabla 2. Datos de performance de WL Check HIV 1+2 referidos a la Sensibilidad Clnica en
Paneles de Seroconversin
Nombre del Panel Tiempo (das) en que la muestra da reactiva
WL Check HIV 1+2 Western Blot

PRB 904-D 0, 21, 49, 92, 99 92 92
PRB 912-L 0, 9, 14, 16, 28, 30 0 9
PRB 916-P 0, 4, 9, 15, 30, 35 30 30
PRB 919-S 0, 9, 11 9 9
PRB 924-X 0, 2, 8, 10, 26, 33, 35, 40 33 35 (Indeterminado)
PRB 925-Y 0, 10, 18, 22, 44, 49 44 44 (Indeterminado)
PRB 929-AD 0, 4, 14, 18, 21, 25, 28 25 25 (Indeterminado)
PRB 930-AE 0, 3, 7, 10 7 10 (Indeterminado)
PRB 944-AT 0, 2, 7, 9, 14, 16 14 14 (Indeterminado)
PRB 947-AW 0, 9, 11, 20 9 9 (Indeterminado)
PRB 949-AY 0, 6, 9, 18, 20 20 20 (Indeterminado)
PRB 951-BA 0, 2, 8, 11, 15, 19 19 Negativo hasta 19 das
PRB 952-BB 0, 7, 10, 14, 17, 21 17 14 (Indeterminado)
PRB 953-BC 0, 3, 7, 10 10 Negativo hasta 10 das
PRB 966 0, 2, 20, 22, 30, 35, 37, 44, 48, 51 48 Negativo hasta 51 das

Das desde el
primer sangrado
Tabla 4. Datos de performance referidos a la precisin de WL Check HIV 1+2
Lnea Muestra Media (DO) Intraensayo Total
S CV (%) S CV (%)
Lnea T Muestra (+) 1 0,221 0,03 12,36 0,03 14,36
Muestra (+) 2 0,085 0,02 20,88 0,02 24,23
Muestra (+) 3 0,271 0,04 16,40 0,05 18,02
Muestra (+) 4 0,049 0,017 35,79 0,017 35,36
Lnea C Muestra (+) 1 0,676 0,07 9,69 0,08 11,61
Muestra (+) 2 0,686 0,08 11,22 0,09 12,61
Muestra (+) 3 0,702 0,07 9,94 0,08 10,80
Muestra (+) 4 0,679 0,08 11,11 0,09 12,59
Muestra () 0,591 0,07 12,34 0,10 17,61
n=80, ():no reactivo por lectura visual, DO: Densidad ptica, S: Desviacin estndar, CV: Coeficiente de variacin
Conclusiones
WL Check HIV 1+2 presenta caractersti-
cas de sensibilidad, especificidad y pre-
cisin adecuadas para ser utilizado en el
tamizado y diagnstico precoz de la infec-
cin por HIV. En suma a esto, la sencillez
de su tcnica y la rpida obtencin de re-
sultados lo convierten en un test que pue-
de ser utilizado tanto en entornos clnicos
como no clnicos.
realizados con 4 muestras positivas con
diferentes niveles de reactividad y con 1
muestra negativa (Tabla 4). Se realizaron
2 ensayos diarios evaluando cada mues-
tra por duplicado por el transcurso de 20
das. Los resultados fueron ledos a los 20
minutos en un lector inmunocromatogr-
fico y en forma visual. Las muestras posi-
tivas siempre dieron un resultado reactivo
y la muestra negativa siempre dio un re-
sultado no reactivo.
Artculo de investigacin
WL Check HIV 1+2 para la deteccin de anticuerpos antiHIV1, antiHIV1 grupo O y antiHIV2 en suero, plasma y sangre entera
munes y otros) que pueden interferir
con los ensayos inmunolgicos. El laboratorio
en principio no puede controlar esta clase de interferencias,
pero debe estar precavido acerca de ellos y considerarlos cuan-
do el resultado no parece el apropiado. Un amplio rango de ana-
litos medidos por inmunoensayos pueden verse afectados, in-
cluyendo hormonas, marcadores tumorales, drogas y serologa.
Anticuerpos heterfilos. Consisten en anticuerpos naturales y
autoanticuerpos que son polireactivos y de baja afinidad con-
tra antgenos heterogneos. Afectan a la unin del anticuerpo
especfico y pueden brindar resultados falsos positivos. Se deno-
minan heterfilos cuando no tienen un antgeno definido. Estos
anticuerpos tambin pueden reaccionar con inmunoglobulinas
de dos o ms especies. El Factor Reumatoide pertenece a esta
categora ya que posee la capacidad de unirse a la fraccin FC
de los complejos AgAc desencadenado resultados falsos posi-
tivos.
Anticuerpos humanos antianimal. Estos anticuerpos po-
seen alta afinidad, son policlonales especficos producidos con-
tra un inmungeno animal especfico y son de clase IgG o IgM.
Muestran una fuerte capacidad de unin y son producidos en un
ttulo alto, compitiendo con el antgeno de la prueba teniendo
reacciones cruzadas con los anticuerpos del reactivo empleado,
causando una falsa seal. La interferencia por anticuerpos hu-
manos antiinmunoglobulina de ratn ha sido informada para
varios analitos incluyendo marcadores cardacos, pruebas fun-
cionales de tiroides y marcadores tumorales. Para eliminar esta
interferencia por una parte se pueden tratar las muestras con
bloqueadores tales como IgG de ratn polimerizada o anticuer-
pos monoclonales de ratn noespecficos o por otra parte se
puede redisear el ensayo mediante el agregado de los mismos
a los reactivos. Tambin pueden emplearse mtodos cromato-
grficos, de precipitacin con PEG 600 o de inmunoextraccin
con columnas de afinidad de suero animal que eliminan al anti-
cuerpo interferente.
INTERFERENTES ENDGENOS
Hemlisis. La interferencia por hemlisis es dependiente del
mtodo utilizado por lo tanto es posible encontrar discrepancia
en la literatura acerca de su efecto sobre la determinacin de
diferentes analitos. En general, las hemlisis ligeras tienen muy
poco efecto sobre la mayor parte de las determinaciones de ruti-
na. Sin embargo, la hemlisis severa puede llevar a un aumento
en el plasma de analitos que se encuentran en altas concentra-
ciones dentro de los eritrocitos as como tambin puede inducir
una dilucin ligera sobre los analitos que se encuentren presen-
tes en la fraccin plasmtica. Algunos ejemplos de analitos que
se encuentran varias veces ms concentrados en los eritrocitos
que en el plasma son lactato deshidrogenasa (160X), fosfatasa
cida (60X), potasio (27X) y glutamatooxalacetato transami-
nasa (7X). Estos ensayos son invalidados ante la presencia de
hemlisis moderada o intensa. Se dice que una hemlisis es in-
tensa cuando el 1% de los eritrocitos est lisado.
Hiperlipidemia/Turbiedad. Es un factor que introduce tur-
biedad por lo cual, dependiendo del mtodo y equipo utiliza-
do, puede ser una causa de interferencia. Interfiere en mtodos
turbidimtricos o nefelomtricos inmunolgicos, por influencia
directa sobre la lectura. Por otra parte, los lpidos tambin des-
plazan el agua y absorben compuestos lipoflicos. En hematolo-
ga, una muestra de ms de 1.000 mg/dL de triglicridos puede
brindar un valor elevado de hemoglobina.
Bilirrubina. Puede causar interferencia ptica directa debido a
su color as como tambin puede mostrar efectos indirectos. La
bilirrubina es un factor interferente negativo en varias reaccio-
nes enzimticas debido a su potencial de reduccin. En la de-
terminacin de creatinina puede causar resultados aumentados.
Anticuerpos endgenos circulantes. Pueden afectar resulta-
dos de ensayos de coagulacin, hematolgicos e inmunolgicos.
La protrombina es el antgeno para la mayora de los anticuer-
pos anticoagulantes lpicos. Por lo tanto, estos anticuerpos in-
hiben los ensayos de coagulacin globales. De forma similar, los
anticuerpos anticardiolipina tambin inhiben los ensayos de
coagulacin globales. Todos estos anticuerpos pueden tambin
interferir con las pruebas inmunolgicas como el VDRL y el RPR
para sfilis. Tambin es posible observar aglutinacin de plaque-
tas en la sangre recolectada con EDTA cuando hay presencia de
anticuerpos contra plaquetas. Estos anticuerpos estn dirigidos
hacia antgenos tales como la glicoprotena IIb/IIIa. El EDTA, al
complejar el Calcio, expone dichos antgenos. Cuando la sangre
se conserva a temperatura ambiente, se produce una aglutina-
cin de las plaquetas que resulta en una pseudotrombocitope-
nia. Este fenmeno no se observa si la sangre se lleva a 37C,
dado que el complejo IIb/IIIa se disocia a esta temperatura. Por
otra parte, tambin se ha descrito la presencia de un anticuer-
po tipo IgM que aglutina los glbulos blancos y que produce
recuentos disminuidos. Esto es dependiente de la presencia de
EDTA y no ocurre cuando la sangre se extrae con heparina o ci-
trato en estos pacientes. Finalmente, el paciente tambin puede
poseer anticuerpos circulantes (anticuerpos heterfilos, autoin-
El laboratorio prctico
V
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3
Variables preanalticas
Un factor a tener en cuenta en el laboratorio de anlisis. Parte 3
Bioq. Hernn Giordano
Qumica Clnica - Product Team
NotiWiener N 161 - Septiembre 2013 - 7
Artculo on-line
Variables Preanalticas
POR QU SON IMPORTANTES?
Teniendo en cuenta estos factores y siguiendo procedimien-
tos adecuados es posible minimizar sus efectos, permitiendo
resultados ms reproducibles, exactos e interpretables.
8 - NotiWiener N 161 - Septiembre 2013
Boletn del Servicio Bibliogrfico de Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Nmero 161 - Ao XLVII - Septiembre de 2013
Director: Andrs A. Poeylaut-Palena (andres.poeylaut@wiener-lab.com)
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Novedades y Agenda
Agenda
Del 9 al 14 de Septiembre de 2013
Mxico
XXXVII Congreso Nacional de Qu-
micos Clnicos y Expoquim 2013
Sede: Casino de la Feria - Aguas Calientes.
Organiza: CONAQUIC, Colegio de Qu-
micos Clnicos de Aguas Calientes
Del 9 al 11 de Octubre de 2013
Argentina
Congreso Nacional Bioqumico
CUBRA XII - 70 Congreso Argentino
de Bioqumica
Sede: Palais Rouge - Buenos Aires.
Organiza: ABA y COFyBCF
Del 24 al 26 de Octubre de 2013
Argentina
2 Congreso Bioqumico Crdoba
2013
Sede: Sheraton Crdoba Hotel - Crdoba.
Convoca: Colegio de Bioqumicos de la
Provincia de Crdoba
Ms informacin: www.cobico.com.ar

Del 29 al 31 de Octubre de 2013
Per
XXI Congreso Latinoamericano de
Bioqumica Clnica y Medicina de
Laboratorio
Sede: Hotel Westin Libertador - Lima.
Ms informacin:
www.colabiocli-lima2013.org
Premio Wiener lab. al mejor trabajo
de investigacin en bioqumica clnica
Del 30 de Octubre al 2 de Noviembre
de 2013
Mxico
XLIII Congreso Mexicano de Patolo-
ga Clnica
Sede: Centro de Convenciones Siglo XXI
- Mrida.
Ms informacin:
www.cicmundiales.com.mx
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