El exceso de CO 2 la oferta inhibe el crecimiento de

mixotrficoprotothecoides Chlorella y Nannochloropsis

salina
Eleonora Sforza
una , ,
,
Renato Cipriani
una
,
Tomas Morosinotto
b
,
Alberto Bertucco
una
,
Giorgio M. Giacometti
b

Mostrar ms
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2011.10.025
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Abstracto
Mixotrofa puede ser explotado para apoyar el crecimiento de algas durante la
noche o en la oscuridad-zonas de un fotobiorreactor. Con el fin de lograr la
mxima productividad, sin embargo, es fundamental tambin para proporcionar
CO 2 en exceso para maximizar la actividad fotosinttica y la produccin de
biomasa fototrpica. El objetivo de este trabajo es verificar la posibilidad de
explotar mixotrofa en combinacin con el exceso de CO 2 . Se seleccionaron dos
especies con una alta productividad de biomasa, Nannochloropsis
salina y protothecoides Chlorella . Diferentes sustratos orgnicos disponibles a
escala industrial se ensayaron, y glicerol elegidos por su capacidad para apoyar el
crecimiento de ambas especies. En condiciones mixotrficos, el exceso de
CO 2 estimula la fotosntesis, pero bloque la metabolizacin del sustrato orgnico,
anulando de esta manera las ventajas de mixotrofa. Mediante el cultivo de
microalgas bajo ciclo da-noche, sustrato orgnico apoyado el crecimiento durante
la noche, pero slo si CO 2 no se proporcion alimentacin. Este representa por lo
tanto un posible mtodo para reconciliar CO 2 estimulacin de la fotosntesis con
mixotrofa.

Reflejos
Las microalgas pueden crecer mixotrficamente con sustratos ms baratos que
la glucosa. El glicerol es conveniente porque es un subproducto de la reaccin
de transesterificacin en la produccin de biodiesel. CO 2 en exceso aumenta el
crecimiento de microalgas auttrofos, pero inhibe el uso de sustratos orgnicos.
Durante el ciclo de luz de la noche-da, las microalgas exploit glicerol durante la
noche slo si CO 2 no es en exceso. Glicerol estimula una acumulacin de
lpidos superior.
Palabras clave
Mixotrofa ;
Glicerol ;
El dixido de carbono ;
Biodiesel ;
Microalgas

1. Introduccin
La produccin de petrleo a partir de microalgas es una alternativa prometedora
para complementar y sustituir los combustibles fsiles en los prximos
decenios. Las microalgas, de hecho, son organismos unicelulares fotosintticos
que pueden crecer a un ritmo mucho ms rpido que las plantas y alcanzar
productividades ms altas ( Chisti, 2008 ). El cultivo de microalgas tienen un
nmero de ventajas adicionales en comparacin con otras fuentes renovables de
base biolgica. En primer lugar, a diferencia de los biocombustibles de primera
generacin, extensos cultivos de microalgas no compiten con los cultivos
alimentarios por la tierra de cultivo, ya que pueden ser cultivadas en zonas
marginales o en los sistemas acuticos ( Chisti, 2008 ). Adems, las microalgas
pueden reducir las emisiones de dixido de carbono, mediante la adsorcin de
CO 2 de los gases de combustin. De hecho, el CO 2 concentracin es limitante
para el crecimiento de algas y de combustin de gas puede ser utilizado como una
fuente barata con el doble objetivo de apoyar el crecimiento de algas y reducir el
dixido de carbono liberado a la atmsfera, aunque SO2 y NO x podra causar la
inhibicin del crecimiento de microalgas ( Lee et al., 2002 ).
Cuando las algas se cultivan con el CO 2 como fuente de carbono nica, la luz
proporciona toda la energa necesaria para la produccin de biomasa. En
condiciones auttrofos, sin embargo, el crecimiento est limitado por la
disponibilidad de luz y, durante la noche, la productividad se reduce an ms
debido a las prdidas de respiracin. Sin embargo, algunas algas fottrofas
tambin puede utilizar fuentes de carbono orgnico para apoyar su crecimiento y
fotoheterotrofa, o mixotrofa, se define ampliamente como un rgimen de
crecimiento en la que el CO 2 y el carbono orgnico se asimilan de forma
simultnea, tanto con el metabolismo respiratorio y fotosinttica operar
simultneamente. Una fuente de carbono orgnico puede apoyar el crecimiento
principio activo dentro de un fotobiorreactor, durante la noche, o en las zonas
oscuras del proceso de aumento de la productividad global de la biomasa. Si los
compuestos orgnicos que soporten el crecimiento se derivan de desechos
industriales o agrcolas, tambin se consigue un aumento de la productividad a
bajo costo. Beneficios ambientales potenciales adicionales que considerar tambin
si las aguas residuales de actividades municipales, agrcolas o industriales son
explotados como fuente de molculas orgnicas ( Pittman et al., 2011 ).
Adems de los beneficios en trminos de acumulacin de biomasa, tambin se
inform que la adicin de una fuente de carbono orgnico para estimular la
acumulacin de lpidos ( Heredia-Arroyo et al., 2010 ). Vale la pena mencionar, sin
embargo, que todos los estudios que analizan la biomasa mixotrfico y la
produccin de lpidos se realizaron en condiciones de laboratorio y de la
posibilidad de que el rendimiento de biomasa reportados se puede mantener
durante perodos largos de cultivo sigue siendo no demostrada ( Pittman et al.,
2011 ). Especialmente en la escala industrial, mixotrofa es probable que aumente
la contaminacin de bacterias y hongos, un problema que puede ser controlado
slo en sistemas cerrados y fuertemente controlados como fotobiorreactores ( Lee
y Zhang, 1999 ). El uso de cloracin, antibiticos y herbicidas podra
potencialmente reducir la contaminacin, pero en muchos casos tambin inhibir el
crecimiento de microalgas.
Culturas hetertrofos y mixotrficos de microalgas se han reportado el uso de
diferentes fuentes de carbono.La glucosa es ms comnmente utilizado para el
sostenimiento de las microalgas que crecen en la oscuridad ( Prez-Garca et al.,
2011 ) y fue empleado como fuente de carbono en cultivos hetertrofos o
mixotrfico de varias especies de microalgas ( Santos et al., 2011 ), llegando a la
alta produccin de ambos biomasa y lpidos ( Xiong et al., 2010 y Wan et al.,
2011 ). Desde un punto de vista industrial, sin embargo, la glucosa no es una
buena opcin debido a su alto costo y fuentes de carbono alternativas, derivada
como subproductos de otros procesos industriales, son preferibles: (este es el
caso para el acetato . Goksan et al, 2010 ), etanol ( Lee, 2004 ) y glicerol
( Heredia-Arroyo et al., 2010 ). Crecimiento hetertrofos y mixotrfico utilizando
glicerol se ha demostrado durante varias algas, aunque el conocimiento del
metabolismo del glicerol es an limitada, tal como fue revisado por Prez-Garca
et al. (2011) .
En este trabajo, la capacidad de protothecoides Chlorella y Nannochloropsis
salina de la utilizacin de sustratos orgnicos (glicerol, en particular) como fuente
de carbono se puso a prueba, midiendo y comparando los parmetros cinticos de
crecimiento, acumulacin de concentracin de biomasa y de los lpidos mxima
bajo auttrofa y condiciones mixotrficos. Particular atencin se dedica a los
efectos de suministrar CO 2 en exceso durante mixotrofa. De hecho, el dixido de
carbono es un factor limitante importante para el crecimiento de algas y su exceso
de potencia fuertemente la productividad fotosinttica (Sforza et al., 2010 ), y por
lo tanto, de CO 2 es necesaria de suministro para lograr la mejor productividad
global incluso en condiciones mixotrficos. Curiosamente, los resultados muestran
que con el exceso de CO 2 concentracin de microalgas no consumen el sustrato
orgnico. Por lo tanto, CO 2 y el suministro de compuestos orgnicos necesitan ser
optimizado finamente para lograr los mejores productividades en condiciones
mixotrofa.
2. Mtodos
2.1. Microalgas y medios composicin
C. protothecoides 33,80 y N. salina 40.85 cepas se obtuvieron de SAG-
Goettingen, Alemania. C.protothecoides , una especie de agua dulce, se cultiv en
medio BG11 ( Rippka et al., 1979 ), con la adicin de peptona 0,1% W / V,
siguientes indicaciones SAG. N. Salina , una especie marina, se cultiv en sales
esterilizados mar de solucin 22 g / L enriquecidos con F / 2 Guillard solucin
como se describe por Guillard y Ryther (1962) , modificados por la adicin de
fuente de nitrgeno en exceso (1,5 g / L de la nano 3 ) y tampn Tris HCl 40
mM. Para los experimentos con diferentes fuentes de carbono orgnicas, los
medios de comunicacin bsica se modific mediante la adicin de sustrato
orgnico (por C. protothecoides : etanol 0,4% W / V, glicerol 1% W / V, acetato de
sodio 0,8% W / V; para N. Salina : etanol 0,4% W / V, glicerol 1% W / V, acetato de
sodio 0,75% W / V). Las concentraciones de sustratos orgnicos se seleccionan
sobre la base de los datos reportados en la literatura para cada especie ( Liang et
al., 2009 , Xu et al., 2004 , Li et al., 2007 , Wood et al., 1999 , Prez-Garca et al.,
2011 , Heredia-Arroyo et al., 2010 y de Swaaf et al., 2003 ).
2.2. Anlisis del crecimiento
Crecimiento experimentos se llevaron a cabo tanto en matraces Erlenmeyer
(sistema por lotes) y en botellas de vidrio de 0,25 L bajo una CO enriquecido
continua 2 flujo de alimentacin (sistema semicontinuo). En el sistema de lotes, no
se aadieron nutrientes despus de comenzar inculos. Por el contrario, en el
sistema semicontinuo, CO 2 se alimenta continuamente en el reactor. Cada lote de
cultivo autotrfico (250 ml) se llev a cabo por duplicado. El medio y los matraces
se esterilizaron en un autoclave durante 20 min a 121 C con el fin de prevenir
cualquier contaminacin. La temperatura de crecimiento fue de 24 1 C, con
una iluminacin artificial (tubos fluorescentes) con una densidad de flujo de
fotones continua de 100 10 E m
-2
s
-1
, medida por un photoradiometer (LI-
COR, modelo LI-189). Experimentos de duracin depende de la tasa de
crecimiento. Cintica de crecimiento de algas se midieron por los cambios diarios
en la densidad ptica (medidos a 750 nm, con un Perkin Elmer-Lambda Bio 40
espectrofotmetro) y nmero de clulas. En la fase de crecimiento logartmica en
el nmero de clulas fue correlacionada con la densidad ptica. Para el peso seco
(PS) Determinaciones clulas fueron cosechadas con un filtro de 0,22 micras. DW
se midi gravimtricamente al secar los filtros a 100 C durante 4 h en un horno
de laboratorio. La tasa de crecimiento especfico se calcula a partir de la pendiente
de la fase logartmica en trminos de nmero de clulas.
Con el fin de estudiar el efecto de CO 2 concentracin en el crecimiento, se
llevaron a cabo una serie de experimentos en el sistema semicontinuo, alimentado
por una corriente que contiene diferentes CO 2fracciones y distribuido a travs de
una frita de cermica. La fraccin de CO 2 en el aire de alimentacin (que es
CO 2 libre) se regula mediante un sistema de medicin de flujo y una vlvula de
control de encendido y apagado. El flujo total de gas fue de 1 L / h para cada
cultura. El efecto de CO 2 sobre el pH en los medios de comunicacin se limita
debido a la presencia de Tris HCl tampn en el medio de cultivo, que mantiene el
pH en el rango de la vitalidad de las especies.
2.3. Los mtodos de anlisis
El contenido de lpidos se determin mediante la tincin de la suspensin de
clulas de algas con Rojo Nilo (NR) de colorante a una concentracin final de 2,5
mg / ml, durante 10 min a 37 C ( Chen et al., 2009 ). La fluorescencia se midi
usando un espectrofluormetro (OLIS DM45), con longitud de onda de excitacin a
488 nm y longitud de onda de emisin en el intervalo de 500-700 nm. La
fluorescencia relativa de Rojo Nilo para los lpidos se obtuvo despus de la
sustraccin de la autofluorescencia de las clulas de algas y Rojo Nilo solo. Los
lpidos totales se extrajeron a partir de clulas secas uso de etanol-hexano (2,5:1
vol. / Vol.) Como disolvente ( Molina Grima et al., 1994 ) en un aparato Soxhlet
durante 10 h. La masa total de lpidos y pigmentos se midi gravimtricamente
despus de la eliminacin del disolvente mediante un evaporador rotatorio. La
intensidad de fluorescencia de las clulas teidas por NR se correlacion
linealmente con la cuantificacin gravimtrica de lpidos celulares.
El consumo de glicerol en el medio se determin como la concentracin residual
en medio filtrado mediante el uso de un kit de anlisis espectrofotomtrico
proporcionado por Steroglass Srl, Italia, basado en la fosforilacin de glicerol por la
glicerol quinasa y la oxidacin subsiguiente por la glicerol-3-fosfato oxidasa a
dihidroxiacetona fosfato y perxido de hidrgeno . La reaccin de perxido de
hidrgeno con 4-aminofenazone y TOOS, catalizada por la peroxidasa, genera un
color prpura ( Beutler, 1984 ).
3. Resultados y discusin
3.1. Efecto de sustratos orgnicos sobre el crecimiento
Este estudio sobre mixotrofa microalgas se realiz en dos especies
diferentes: C. protothecoides y N.Salina. El primero ya se ha demostrado que
tienen una alta productividad de biomasa en automtico, hetero, y las condiciones
mixotrficos y la capacidad de acumulacin de altas cantidades de lpidos ( Santos
et al., 2011 ). N. salina , por el contrario, se sabe que tiene una buena biomasa y
la productividad de los lpidos en las condiciones de foto-auttrofos ( Rodolfi et al.,
2009 y Sforza et al., 2010 ), pero el crecimiento mixotrfico de N. Salina se
inform slo con glucosa ( Wood et al., 1999 y Das et al., 2011 ).
C. protothecoides se cultiv inicialmente en matraces Erlenmeyer bajo diferentes
condiciones mixotrficos utilizando etanol, acetato y glicerol como sustratos
orgnicos, para poner a prueba su capacidad de importar y asimilar estas
molculas. En la fig. 1 , las curvas de crecimiento con glicerol se reportan y se
compararon con una curva de control con ningn sustrato aadido. Es de destacar
que este control no puede ser considerada completamente autotrfico, desde
peptona estaba presente en el medio, como se recomienda por la coleccin de
cultivos (SAG-Goettingen, Alemania).

La figura. 1.
(A) Curvas de crecimiento de C. protothecoides en condiciones mixotrficos con
glicerol (1% W / V) como sustrato, bajo mixotrfico () y () condiciones heterotrficas,
en comparacin con el control (). En todas las condiciones de peptona (0,1% W / V)
se aadi al medio de cultivo. (B) Curvas de crecimiento de N. Salina en condiciones
mixotrficos con glicerol (1% W / V) como sustrato, bajo mixotrfico () y ()
condiciones heterotrficas, en comparacin con el control (). Todos los experimentos
se realizaron en matraces Erlenmeyer.
Opciones Figura
Independientemente de esto, la adicin de glicerol increment el crecimiento, que
en C. protothecoides fue de tres pliegues ms rpido que el control, como se
informa en la figura. 1 A y la Tabla 1 . El glicerol fue de hecho asimilada por el alga
segn lo demostrado por el hecho de que se haba consumido hasta el 60% de la
glicerol inicialmente presente en el medio ( Tabla 1 ).
Tabla 1.
Tasa de crecimiento especfica ( ) de C. protothecoides y N. salina en frascos
experimentos. El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de
biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de
crecimiento. Mixotrfico y experimentos hetertrofos se realizaron mediante la adicin
de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.
Las
condiciones de
crecimiento
C. protothecoides

N. salina

(
d -
1
)
Max. conc
biomasa. (G /
L)
El consumo
de Glicerol
(%)
(
d -
1
)
Max. conc
biomasa. (G /
L)
El consumo
de Glicerol
(%)
Mixotrofa
(glicerol al
1%)
0,91
0,1
2,67 0,3 67.1 0,36
0,2
0,43 0,2 85.3
Heterotrofa
(glicerol al
1%)
0,87

0,01
1,10 0,2 40.4 0.01 0.05 0
Opciones de la tabla
C. protothecoides tambin se cultivan en la oscuridad bajo condiciones totalmente
hetertrofos con glicerol como fuente de carbono ( . Figura 1 A y la Tabla 1 ). Los
resultados mostraron una tasa de crecimiento en la oscuridad similar al control de
auttrofos ( = 0,87 d
-1
), pero un rendimiento de biomasa inferior, con una
concentracin final de slo 1,1 g / L. Este hallazgo es consistente con un consumo
de sustrato ms pequeo (alrededor de 40%, como se informa en la Tabla 1 ) en
ausencia de luz, como se inform tambin para otras especies tales
como Chlorella vulgaris ( Martnez y Orus, 1991 ). Por lo tanto, el crecimiento
mixotrfico era ms fuerte que tanto auttrofos y hetertrofos.
El glicerol ( . Fig. 1 B) tambin fue eficaz en el apoyo a N. Salina crecimiento, que
mostr una tasa similar a la de control auttrofa pero con una concentracin final
ms alta ( Tabla 1 ). A diferencia de C.protothecoides , N. Salina se encontr
incapaz de crecer en la oscuridad, bajo condiciones totalmente heterotrficas, a
cada concentracin ensayada de la fuente de carbono. Adems, se verific que
una mayor concentracin de glicerol (2% W / V) indujo inhibicin del crecimiento
de N. salina .
Crecimiento mixotrfico con otros sustratos, etanol y acetato de sodio, tambin se
ensay. Como se inform en el material
complementario , C. protothecoides culturas en la presencia de etanol y acetato de
sodio mostraron un crecimiento mejorado. En particular, las tasas de crecimiento
especficas fueron 0,93 d
-1
con etanol y 1,45 d
-1
con acetato en comparacin con
0,30 d
-1
para el control. Tambin la concentracin de biomasa final fue mayor,
especialmente en el caso de etilo (3,29 g / L vs 0,52 g / l de control). Por el
contrario, en el caso de N. Salina , culturas suministrados etanol mostr un
pequeo aumento en la tasa de crecimiento especfico con respecto al control
autotrfico, pero con la concentracin celular final inferior. En lugar de
ello, N. Salina crecimiento fue fuertemente inhibida por el acetato, que era txico
para las clulas a la concentracin ensayada. Estos sustratos, por lo menos a la
concentracin ensayada, no parece adecuado para apoyar el crecimiento
mixotrfico de N. salina y por esta razn todos los siguientes anlisis se centrar
en glicerol. Una razn adicional es que desde una perspectiva de glicerol industrial
es una fuente de carbono altamente adecuado, ya que es un subproducto de la
reaccin de transesterificacin en el proceso de produccin de biodiesel. Por lo
tanto, un reciclo externo de glicerol podra contribuir a la viabilidad econmica de
la produccin de biomasa de algas y sera evitar la devaluacin en el mercado de
este compuesto orgnico.
3.2. Mixotrficos crecimiento en la presencia de un exceso de CO 2
Los resultados presentados ms arriba mostraron que ambas especies
investigadas son capaces de crecer mixotrficamente con glicerol. En
experimentos anteriores, CO 2 estaba presente en la concentracin atmosfrica,
mientras que es bien sabido que el dixido de carbono en exceso mejora
notablemente la productividad de la biomasa de algas en fotobiorreactores
auttrofos. La mejora de la eficiencia fotosinttica debe conducir a una mejora
adicional de la tasa de crecimiento y la productividad y, por esta razn, las dos
especies de algas fueron cultivadas con aire enriquecido con el exceso de
CO 2 (5% v / v), segn las pruebas realizadas previamente por Sforza et
al. (2010) . Como era de esperar para ambas especies, el exceso de CO 2 estimula
el crecimiento auttrofos, con tasas especficas de crecimiento (superior . Fig.
2 ,Tabla 2 ).

La figura. 2.
Efecto de CO 2 (5% v / v en burbujas de aire) en las curvas de crecimiento
de C. protothecoide s (A) y N. salina (B) bajo diferentes condiciones de cultivo:
auttrofa () y glicerol al 1% W / V (). Para C. protothecoides curvas de crecimiento
con peptona 0,1% W / V (), tambin se reportan peptona 0,1% W / V-glicerol 1% W /
V (). Todos los experimentos descritos se realizaron en el sistema de burbujeo.
Opciones Figura
Tabla 2.
Tasa de crecimiento especfica ( ) de C. protothecoides y N. salina cultivada en
sistema de burbujeo. El consumo de glicerol y los datos mximos de concentracin de
biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final de la fase estacionaria de
crecimiento. Mixotrfico y experimentos hetertrofos se realizaron mediante la adicin
de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.
Condiciones de
cultivo
(
d -1
) El consumo de Glicerol
(%)
Max. conc biomasa. (G /
L)
C. protothecoides
Autotrophic 1,26
0,10
- 3,60 0,10
Peptona 1,67
0,08
- 2,78 0,10
Glicerol 0,92
0,09
17.6 2,08 0,03
Glicerol + Peptona 1,72
0,20
4.2 3,22 0,20
N. salina
Autotrophic 0,55
0,05
- 2,53 0,01
Mixotrfico 0,36 0,1 3.2 2,10 0,2
Opciones de la tabla
C. protothecoides en CO 2 experimentos enriquecidos, sin embargo, mostraron
tasas de crecimiento muy similares tanto en presencia (mixotrfico) y en ausencia
(auttrofos) de glicerol (1,72 d
-1
y 1,67 d
-1
, respectivamente). La presencia de
sustrato orgnico y la adicin de glicerol tambin caus una pequea reduccin en
la concentracin de biomasa final. Consistentemente con el pequeo efecto en la
tasa de crecimiento, slo una fraccin muy pequea del glicerol presente en el
medio (4%) fue consumido, como se informa en la Tabla 2 . Estos resultados
pueden explicarse por la presencia de peptona en el medio que puede ser
metabolizado preferentemente ms de glicerol. Para verificar este
punto C. protothecoides se cultivan sin peptona; con un exceso de CO 2 se
observ un crecimiento significativo ( . Fig. 2 A), aunque las tasas fueron
significativamente ms pequeos que los de la peptona (0,92 d aadido medio
-1
y
1,26 d
-1
, respectivamente), probablemente porque peptona es tambin una fuente
de nitrgeno, otro nutriente clave para el crecimiento de
algas. Independientemente de esto, sin embargo, tambin en ausencia de
peptona, la adicin de glicerol no aument la tasa de crecimiento ni la
concentracin de biomasa final.
As pues, estos datos muestran que el CO 2 en exceso estimula el crecimiento de
microalgas photoautotrophic, maximizando reacciones fotosintticas, sino que
tambin reduce la eficiencia de la captacin de sustrato orgnico, que permanece
en el medio de cultivo. Se obtuvieron resultados similares con N. salina para que
el CO 2 en exceso de la mejora del crecimiento autotrfico pero el glicerol presente
en el medio no se asimil y hasta una concentracin final de biomasa ligeramente
ms baja se observ ( . Fig. 2B, cuadro 2 ).
3.3. Explotacin de mixotrofa para apoyar el crecimiento con un ciclo de luz
de la noche / da
Los resultados presentados ms arriba mostraron
que N. salina y C. protothecoides son capaces de metabolizar el glicerol, pero esta
capacidad se inhibe por un fuerte CO 2 superiores. Estos experimentos se
realizaron bajo luz continua si bien debe tenerse en cuenta que en
fotobiorreactores de microalgas al aire libre fijar CO 2 slo durante el da. Incluso si
no asimilada durante el da, proporcionando una fuente de carbono orgnico, sin
embargo, podran maximizar la productividad de biomasa de algas por sostener el
crecimiento durante la noche. Para verificar esta posibilidad, las algas se cultivan
bajo ciclo noche-da de 12:12 h, tanto en condiciones de auttrofos y mixotrficos,
con CO 2 en exceso ( . Fig. 3 ). Como era de esperar, las tasas de crecimiento
especficas auttrofos eran ms lentos para ambas especies con respecto a
aquellos con luz continua (0,68 d
-1
para C. protothecoides y 0.367 d
-1
para N.
Salina , en comparacin con 1,26 d
-1
y 0,55 d
-1
, respectivamente, Tabla
3 y Tabla 4 ). Sin embargo, la presencia de glicerol en el medio no aument
cualquiera de estos valores, y el crecimiento fue ms bien inhibida por su
presencia. De hecho, tanto C. protothecoides ( . Fig. 3 A) y N. Salina ( . Fig. 3 B),
alcanz una concentracin final inferior de la biomasa en presencia de glicerol con
respecto a la cultura auttrofa en un ciclo de da-noche 12:12 h.Consistentemente,
el sustrato orgnico no se consuma, de manera similar a lo que se observ
previamente con iluminacin continua.

La figura. 3.
Curvas de crecimiento de C. protothecoide s (A) y N. salina (B) en el marco del ciclo
noche-da (12-12 h) en el sistema de burbujeo con agregado CO 2 (5% v / v) en el aire
en auttrofos () y () Condiciones mixotrficos. En auttrofos () y curvas mixotrfico
(), CO 2 (5% v / v) se suministra slo durante el perodo de luz. Durante la noche, los
cultivos se burbujea con CO 2 del aire privados. Todos los experimentos descritos se
realizaron en el sistema de burbujeo y experimentos mixotrficos se realizaron
mediante la adicin de glicerol 1% W / V para el medio de cultivo. Por N. salinatambin
se reportan experimentos en autotrofia () y mixotrofa () en condiciones
atmosfricas.
Opciones Figura
Tabla 3.
Tasa de crecimiento especfica ( ) de C. protothecoides cultivados en sistema de
burbujeo bajo ciclo noche-da y diferente ciclo de CO 2 el suministro. El consumo de
glicerol y los datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad
obtenida al final de la fase estacionaria de crecimiento. Experimentos mixotrficos se
realizaron mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.
CO 2 las condiciones de
flujo (% v / v en el aire)
Condiciones de
cultivo
(
d -1
) El consumo de
Glicerol (%)
Max. conc
biomasa.(G / L)
CO 2 5% 24 h Autotrophic 0,680
0,04
- 3,12 0,05
Mixotrfico 0,640
0,05
0 2,01 0. 1
CO 2 al 5% en la luz-el
0,03% en la oscuridad
Autotrophic 0,664
0,06
- 2,99 0,01
Mixotrfico 0,627
0,08
2 2,13 0. 1
CO 2 al 5% en la luz 0%
en la oscuridad
Autotrophic 0,868
0,09
- 2,78 0,1
Mixotrfico 0.867
0,1
8 2,67 0,2
Opciones de la tabla
Tabla 4.
Tasa de crecimiento especfica ( ) de N. salina cultivada en sistema de burbujeo bajo
ciclo noche-da y diferente ciclo de CO 2 suministradora. El consumo de glicerol y los
datos mximos de concentracin de biomasa se refieren a la cantidad obtenida al final
de la fase estacionaria de crecimiento. Experimentos mixotrficos se realizaron
mediante la adicin de glicerol al 1% W / V como sustrato orgnico.
CO 2 las condiciones de
flujo (% v / v en el aire)
Condiciones de
cultivo
(
d -1
) El consumo de
Glicerol (%)
Max. conc
biomasa.(G / L)
CO 2 5% 24 h Autotrophic 0,367
0,01
- 1,40 0,1
Mixotrfico 0,354
0,01
0 1,01 0,14
CO 2 al 5% en el perodo de
luz-un 0,03% en la
oscuridad
Autotrophic 0,399
0,01
- 0,99 0,01
Mixotrfico 0,335
0,01
2 0,7 0,12
CO 2 al 5% en la luz 0% v /
v en la oscuridad
Autotrophic 0,53
0,01
- 1,30 0,2
Mixotrfico 0,613
0,01
19.8 2,05 0,2
Opciones de la tabla
Estas observaciones sugieren la presencia de un co 2 efecto inhibidor sobre la
capacidad de importacin y algas metabolizan glicerol. Esto es cierto para ambas
especies consideradas y, ya que no son evolutivamente relacionados, esto podra
ser una propiedad generalizada de algas.
Para investigar ms este punto, el CO 2 concentracin en burbujear aire durante la
noche se redujo a la concentracin atmosfrica de 0,03%, para verificar si la
capacidad de metabolizar el glicerol podra ser restaurado. Para ambas especies,
incluso con bajas emisiones de CO 2 concentracin no hubo absorcin sustancial
de glicerol ( Tabla 3 y Tabla 4 ). Este resultado est en aparente contraste con lo
que se informa en la figura. 1 , pero esto puede ser explicado por teniendo en
cuenta que mientras el primero experimentos se llevaron a cabo en matraces, en
el aire este ltimo caso, se burbuje a travs de la cultura. Por lo tanto, aunque
CO 2 concentracin es la misma, su transferencia de masa en el medio es mucho
mayor en este ltimo caso. Para verificar esta hiptesis experimentos se repitieron
utilizando CO 2 del aire libre durante la noche y en este caso, ambas especies
fueron capaces de cambiar su metabolismo para heterotrofa durante la noche y
asimilar activamente glicerol. En este caso, C protothecoides y N. salina aument
su ritmo de crecimiento hasta 0.867 d
-1
y 0,61 d
-1
, respectivamente, y un
consumo significativo de glicerol se observ (alrededor del 8% un 20%,
respectivamente, Tabla 3 y Tabla 4 ). Estos resultados muestran que en
presencia de un ciclo de da / noche, la adicin de glicerol estimula el crecimiento
durante las fases oscuras pero slo si CO 2 no est presente.
La presencia de CO 2 durante el perodo oscuro parece influir en la tasa de
crecimiento tambin en plena autotrofia. De hecho, en virtud 12:12 culturas ciclo
noche-da h burbujear con CO 2 del aire libre durante la noche ( . Fig. 3 ) mostraron
mejores tasas de crecimiento que las previstas continuamente con 5% de
CO 2 .Estos resultados sugieren que el CO 2 efecto inhibidor no se limita al glicerol
sino ms bien un efecto inhibitorio ms general sobre la respiracin. La inhibicin
de la respiracin por el exceso de CO 2 es conocido por las plantas ( Amthor et al.,
1992 ), pero nunca se ha informado de las microalgas. La observacin de que la
inhibicin de la respiracin puede reducir la acumulacin de biomasa podra
parecer contrario a la intuicin ya la respiracin debe consumir molculas
orgnicas de carbono fijos durante el da. Sin embargo, se debe considerar que el
metabolismo respiratorio y fotosinttica estn fuertemente conectados y se ha
demostrado que la inhibicin de la respiracin tambin reduce la eficiencia
fotosinttica, especialmente en la transicin de la oscuridad a la iluminacin
( Noctor et al., 2004 ). Es evidente que este punto necesita ms investigaciones
para conducir conclusiones ms firmes ya que las explicaciones alternativas
tambin pueden ser vlidas. Por ejemplo, aunque en condiciones auttrofos se
comprob el pH a ser estabilizado por el amortiguador contra la acidificacin
debido a un exceso de CO 2 ( Sforza et al., 2010 ), sin embargo, ya que durante la
noche CO 2 no es consumido pero aument, un fuerte acidificacin del medio es
posible con sus efectos adversos sobre el crecimiento.
3.4. Efecto de mixotrofa en la acumulacin de lpidos
En la perspectiva de desarrollar una produccin de biodiesel a gran escala a partir
de microalgas, el efecto de mixotrofa se investig no slo en la productividad de la
biomasa, sino tambin sobre la acumulacin de lpidos. Ya se ha demostrado que
heterotrofa o mixotrofa podra aumentar significativamente la cantidad de lpidos
en las clulas de C. protothecoides cuando se utiliza la glucosa como sustrato
( Xiong et al., 2010 ).Nuestros experimentos confirman
que C. protothecoides acumula ms lpidos en condiciones mixotrficos (21% bajo
mixotrofa en lugar de 12% en autotrofia, como se informa en la Tabla 5 ), aunque
el contenido de lpidos se mantuvo mucho menor que la obtenida anteriormente
(alrededor de 55%, segn lo informado porXu et al., 2006 ), donde la
concentracin sin embargo masiva de glucosa se utiliza como sustrato. Tambin,
mixotrofa fue menos eficaz que la limitacin de nitrgeno para inducir la
acumulacin de lpidos que, en este ltimo, caso lleg a 35% DW ( Tabla 5 ).
Tabla 5.
El contenido de lpidos de C. protothecoides bajo diferentes condiciones de
crecimiento. La concentracin mxima de lpidos se refiere a los resultados obtenidos
al final de la fase estacionaria.
Max. conc lpidos. (% DW)
Mixotrfico (glicerol al 1%) 21.3 2.5
Autotrophic 11.5 3.1
Autotrophic N privados- 35.8 1.5
Opciones de la tabla
La acumulacin de lpidos tambin es bien sabido que es inducida por la limitacin
de nitrgeno tambin porN. salina ( Rodolfi et al., 2009 y Sforza et al.,
2010 ). Nuestros resultados mostraron que mixotrofa podra inducir la
acumulacin de lpidos en N. Salina incluso cuando el nitrgeno es en exceso (1,5
g / L de la nano 3): cerca de 15 das despus de la inoculacin , el contenido de
lpidos aument hasta aproximadamente 50% de DW, como se informa en la
figura. 4 . Desde el punto de vista industrial, esto podra simplificar el proceso de la
produccin de petrleo a partir de microalgas, porque se necesitara slo un paso
para producir simultneamente la biomasa y de los lpidos, en lugar de un proceso
de dos etapas propuesto en el caso de los sistemas auttrofos ( Rodolfi et al.,
2009 y Sforza et al., 2010 ). En consecuencia, aunque el contenido de lpidos
ms altos se han obtenido con la privacin de nitrgeno, la adicin de un sustrato
orgnico es preferible para el diseo de un proceso industrial. Cabe sealar, sin
embargo, que el glicerol es capaz de afectar a la acumulacin de lpidos slo
cuando se consume activamente, es decir, slo cuando el CO 2 est ausente o a
muy baja concentracin. Por lo tanto, el compromiso ideal para un fotobiorreactor
al aire libre, el trabajo con un ciclo noche-da, para llegar a la biomasa y de los
lpidos mxima productividad sera la de crecimiento autotrfico con el exceso de
CO 2 durante el da y el crecimiento hetertrofos en glicerol sin adicin de
CO 2 durante la noche . Este es probablemente el mejor compromiso entre el
crecimiento rpido y alto contenido de lpidos en N. salina y C. protothecoides .

La figura. 4.
Valores de intensidad de fluorescencia de las clulas del Nilo-Red manchadas
de N. Salina durante las curvas de crecimiento bajo autotrfico () y las condiciones de
mixotrficos () (glicerol 1% W / V). Los datos se refieren a las curvas de crecimiento
bajo atmsfera de CO 2 concentracin.
Opciones Figura
4. Conclusiones
C. protothecoides y N. Salina son capaces de crecer en cultivos de mixotrficos la
explotacin de diferentes sustratos orgnicos alternativa a la glucosa. Entre ellos,
el glicerol es particularmente interesante, ya que es un subproducto de la
produccin de biodiesel. Los datos presentados demostraron que la adicin de
glicerol estimula el crecimiento y la acumulacin de lpidos en ambas
especies. CO 2 en exceso, que estimula fuertemente la productividad fotosinttica
de algas, tambin deteriora ventajas obtenidas a partir de mixotrofa,
probablemente debido a la inhibicin de la respiracin. Adems de glicerol, sin
embargo, podra ser explotado en la presencia de un ciclo de da / noche para
sostener el crecimiento en la oscuridad, a condicin de que el CO 2 se mantiene
baja durante esta fase.