Determinacin Cualitativa de Clorofila a y b por Cromatografa en Capa Fina

Resumen
La cromatografa en capa fina es una tcnica analtica para la separacin de sustancias en
este caso compuestos coloridos como la clorofila a y b, este tipo de cromatografa ofrece
una gran cantidad de ventajas, entre las cuales estn, una afinada resolucin, gran
sensibilidad, simplicidad y rapidez. Esta cromatografa se compone de una fase mvil y una
fase estacionaria colocada en un soporte usualmente de vidrio o aluminio (Adams R.,
Burdon., Et al, 1980). En esta prctica se realiz la cromatografa para separar los dos tipos
de clorofila a y b a partir de los extractos de Spinacia oleracea y commelina erecta, en la
cromatografa se pretende separar ambas en base a sus propiedades diferentes de polaridad
y solubilidad, y determinar su factor de retencin para poder observar la resolucin de la
tcnica y la diferencia entre ambas clorofilas.

Metodologa
En la prctica de laboratorio se realiza
cromatografa en capa fina, este se realiza
mediante una fase estacionaria colocada en un
soporte en este caso silica gel el cual es un
adsorbente polar capaz de retener las sustancias
mediante interacciones como puentes de
hidrogeno he interacciones de van de Waals este
posee un soporte de aluminio y una fase mvil,
en este caso una fase mvil con componentes de
distinta polaridad todos miscibles entre ellos
para crear una fase homognea la fase es de gran
polaridad general debido a sus componentes,
con esta fase se satura una cmara donde se
lleva a cabo la cromatografa, en la fase
estacionaria previamente a introducir esta se
siembran las muestras en este caso macerado de
Spinacia oleracea y commelina erecta en la
cromatoplaca, Esto se realiza para la separacin
de los principales grupos de pigmentos vegetales
las clorofila a y b las cuales son muy similares
estructuralmente el grupo metilo de la clorofila a
hace posible su separacin mediante tcnicas
basadas en los principios de la particin, la
diferencia entre ambas es bsicamente la
presencia de un grupo metilo en la a y de un
grupo formilo en la b lo que les confiere
propiedades para formar o no puentes de
hidrogeno principalmente con la fase
estacionaria lo que hace posible la
diferenciacin mediante cromatografa en capa
fina y mediante su factor de retencin se
determina la pureza del extracto de clorofila

Comparndola con estndar se puede observar si
en realidad se trata del compuesto que se busca
o es se trata de otro compuesto y en base a su
factor de retencin relativo se determina la
diferencia que posee el compuesto que se
analiza con el estndar o que tan contaminado se
encuentra el compuesto que se est analizando.

Resultados
Tabla No. 1. Rf Experimentales
Sustancia Distancia
recorida
por la mx
Distancia
recorrida
Porel
disolvente
Rf
Espinaca 8cm 8cm 1
Hierva de
pollo
8cm 8cm 1

Tabla No. 2. Valores de Rf Tericos

Pigmentos Rf tericos
Clorofila a 0.68
Clorofila b 0.54

Discusin de resultados
La cromatografa en capa fina (CCF) es una
forma de cromatografa de adsorcin slido-
lquido que constituye una tcnica
importante para el anlisis rpido de
muestras. (Skoog, Et al. 2008) Los
pigmentos vegetales pueden ser separados
utilizando la tcnica de cromatografa en
capa fina.
Se utiliz espinaca y hierba de pollo como
muestras para separar sus pigmentos
(clorofila a y b). Se prepararon las muestras
utilizando sulfato de magnesio, el cual actu
como agente desecante, y arena, la cual
sirvi para macerar la muestra. La fase
mvil estaba formada por ter de petrleo,
ciclohexanol, acetato de etilo, acetona y
etanol, al ser el ter de petrleo el
compuesto en mayor proporcin le confiri
a la fase un carcter muy apolar.
Como se puede observar en la tabla No.1,
ambas muestras obtuvieron un Rf de 1, es
decir, que la distancia recorrida por la
muestra fue la misma que la recorrida por el
frente del solvente, esto nos indica que las
muestras eran muy afines a la fase mvil,
por lo tanto estaban formadas por pigmentos
con una polaridad muy similar a la de la fase
mvil y al mismo tiempo muy diferente a la
de la fase estacionaria, por lo que no
ocurrieron interacciones entre estos y no
hubo retencin alguna.
La clorofila a tiene un grupo CH3 en el
anillo II, hacindola menos polar que la
clorofila b, la cual posee un grupo CHO en
la misma posicin (Santamarina y Garca,
2004), por lo que podemos inferir que el
pigmento ms presente en estas muestras
fue la clorofila a, ya que al tener una
polaridad muy parecida a la de la fase mvil
se pudo disolver mejor en esta y recorrer la
misma distancia.
Sin embargo, datos tericos, muestran que
tanto la espinaca, como la hierba de pollo
contienen clorofila b, al igual que muestran
valores de Rf de clorofila a y b muy
diferentes a los obtenidos en la prctica (Ver
Tabla No. 2), este error pudo haberse
producido debido a que en la fase mvil se
utiliz ciclohexanol en lugar de
ciclohexano, el cual por la presencia de
grupos OH pudo formar ms puentes de
hidrgeno con la fase mvil y as disolverse
con ms facilidad y recorrer una distancia
ms larga que la indicada en los datos
tericos.
Conclusiones

La muestra tiene una mayor cantidad
de clorofila A que B
La clorofila A es ms apolar y ms
afn al solvente por el grupo CH
3
que
tiene en el anillo 2 de su estructura.
La clorofila B es ms polar que la A
debido a que posee un grupo
aldehdo en sustitucin del grupo
CH
3
del anillo.
el utilizar ciclohaxanol en vez de
ciclohexano en la fase mvil, afecto
el desplazamiento de la muestra a lo
largo de la placa.


Referencias Bibliogrficas

1. Adams R., Burdon R., Campbell A. y
Smellie R. (1980) Bioqumica de los
cidos nucleicos de Davidson, (1ra
edicin), Editorial Reverte, Espaa,
Barcelona, Pag. 71

2. Redes, R. (2006). Manual de prcticas
de Fotosntesis. Mxico: UNAM. Pp 32.

3. Santamarina, p. y Garca, F. (2004).
Prcticas de biologa y botnica.
Espaa: Editorial Universidad
Politcnica de Valencia. Pp 235.

4. Skoog, D. Et al. (2008) Principios de
anlisis instrumental. 6. Edicin.
Editorial Cenage Learning.


Anexos

Rf=



Espinaca
Rf=

= 1
Hierva de pollo
Rf=

= 1

Imagen No.1

Fuente: Datos experimentales,
Obtenidos en el Laboratorio de
Anlisis Instrumental, Edificio
T-12, USAC.


Imagen No. 2 cromatografa de capa fina de
pigmentos en hojas.