Universidad: Ciencia y Tecnologla Vol. 2. No. 3.

Diciembre de 1992
I
OPTIMIZACION DEL PROCESO DE FERMENTACION PARA PRODUCIR
Bacillus thuringiensis Var. Aisawai
Carolina Abarca Camacho'
Alfredo Martinez JirntnezZ
Mario A. Cam Bermiidez2
Rodolfo Quintero Ramfrez2
Un bioinsecticida es considerado como el product0 bacteriano o actividad bacteriana que da como resultado la
muerte de un insecto. Una de las formulaciones comerciales mds usadas actualmente esta basada en la bacteria B.
thuringiensis. Esta bacteria sintetiza durante su fase de esporulaci6n una proteina (delta-endotoxina), que muestra
una actividad insecticida unica. A1 ser ingerido la delta-endotoxina por larvas susceptibles, afecta el intestino de 10s
insectos causandoles la muerte. Existen endotoxinas especificas contra lepid6pteros7 dipteros, cole6pteros y
recientemente nuevas proteinas han sido aisladas contra nemdtodos y protozoarios.
En el presente trabajo se describe la optimizaci6n del medio de cultivo y las condiciones de fermentaci6n para
la producci6n de un bioinsecticida a partir de Bacillus thuringiensis var. aisawai .
3
Usando un diseiio experimental 2 ,-se encontr6 que las condiciones 6ptimas para producir delta-endotoxina de
B. thuringienesis Var. Aisawai en un fermentador de 14 L son 10s siguientes: 800 RPM, 1 wm, y control de pH igual
9
o mayor a 7.0. La concentraci6n final de esporas despuCs de 24 horas de fermentaci6n fu8 5. 5~10 esplml. * 10%
SUMMARY
A bioinsecticide is defined as the bacterial product or bacterial activity which causes the death of an insect.
I
One of the most common commercial products is obtained from the bacteria Bacillus thuringiensis. This bacteria
synthesizes during its sporulation stage a protein (delta-endotoxin), which once it has been ingested by susceptible
larvae it affects the midgut cells causing eventually death. There are specific endotoxins against lepidopters, dipters,
I
I
coleopters and recently new proteins have been isolated against nematodes and protozoa.
The main objetive ofthis work was the optimization of the growth medium and the fermentation conditions in
order to obtain a bioinsecticide based on Bacillus thuringiensis var. aisawai.
Using an experimentel design 2 ; it was found that the optimal conditions for the delta-endotoxin production
of BaciNus thuringiensis Var. Aisawai in a 14 L. fermentor were the following: 800 RPM, 1 WM, and pH control
9
at or higher of 7.0. The final concentration of spores after 24 hours was 5. 5~10 sporelml. h 10%
' Centro.de Investigaci6n en Biotecnologia.
Departamento de bioingenieria.
Abarca, C.C., Martlnez.1.A. Caro, Caro B.M.. Quintero. R.R Optlmizacihn del proceso de krrnentacihn para producir Bacillus t.
INTRODUCCION
por ende en una baja actividad insecticida. Por abajo de
10s 20" C se observa una clam disminuci6n en la veloci-
El control de las de insectos que afectan a
dad de crecimiento de la bacteria Sherer reporta un pH
10s cuitivos agrfcolas es uno de 10s problemas en 10s
6ptimo de 7.3 para B.t. El pH initial del media es
cuales se invierte mayor cantidad de recursos. Reciente-
generalmente de 6.8 a 7.2 (6).
mente se ha dado un gran impulso a1 uso de microorga-
nismos en el control de plagas, debido a que el uso
indiscriminado de 10s pesticidas quimicos, haconducido
a lacontaminaci6n de 10s productos agricolas y el campo.
El control biol6gico de las plagas puede definirse como
el uso de organismos naturales: virus, bacterias,hongos,
protozoanos y nemhtodos, para el exterminio de plagas.
Existen aproximadamente 1500 microorganismos o me-
tabolitos microbianos que poseen propiedades insectici-
das. El potencial del uso de estos organismos se debe a su
alta especificidad, es decir que afectan s610 a 10s insectos
y no causan daAo ecol6gico (1).
Bacillus thuringiensis (B.t), habitante de la flora
normal del suelo, es un elemento importante en el control
biol6gico. Es una bacteria gram +, que se caracteriza por
la producci6n de varias proteinas con capacidad insecti-
cida a1 ser ingerido por larvas susceptibles especifica-
mente del orden lepid6ptera (2). Actualmente, existen
varios productos comerciales a base de B.t. cuyo ingre-
diente activo insecticida es una proteina llamada delta-
endotoxina contenida en una inclusi6n cristalina o cristal
protkico, liberado durante la esporulaci6n (3). Las delta-
endotoxinas actGan sobre las microvellosidades del epi-
telio intestinal de larvas susceptibles, causando lamuerte
del insect0 (4).
Dentro del control microbiano de insectos, el B.
thuringiensis se considera como una buena alternativa
debido a que ofiece las siguientes ventajas: (5)
1 .-Inocuidad a1 hombre, animales dom8sticos, flora
y fauna silvestre.
2.-Ataque especifico a1 estado larvario de lepid6pte-
ros, cole6pteros y algunos dipteros perjudiciales.
3.-Para incrementar su actividad bi6cida, puede mez-
clarse con productos quimicos: feromonas, adhe-
sivos, etc.
4.-Vida de anaquel y prolongada en forma de produc-
to seco y concentrado.
5.-Cada vez se abaten mhs 10s costos de producci6n
debido a 10s avances tecnol6gicos, microbiol6gi-
cos y genkticos, lo que lo hace competitivo frente
a 10s insecticidas quimicos.
La fennentaci6n de B. thuringiensis se lleva a cab0
normalmente a una temperatura entre 27C y 33"C,
siendo la temperatura 6ptima de 30C; a 45" C o mhs, se
produce una disminuci6n en la producci6n de cristales, y
Laproducci6n de bioinsecticida requiere el disefio
de un medio adecuado para el crecimiento, esporulaci6n
y formaci6n de la endotoxina. A este respecto es impor-
tante conocer 10s requerimientos nutricionales del mi-
croorganism~ a producir. La glucosa es la mejor fuente
de carbono, aunque otros compuestos pueden ser utiliza-
dos, tales como almid6n, sacarosa, glicerol y melazas
(7).
Ademhs es esencial una adecuada fuente de nitr6-
geno para el crecimiento. La literatura reporta que el
amonio es la fuente preferida de nitr6geno durante la fase
exponencial de crecimiento. Sin embargo, en la fase de
esporulaci6n el microorganismo muestraunapreferencia
por 10s aminohcjdos (8).
Ahora bien, el oxigeno es requerido para el creci-
miento. Algunos autores han mencionado que altas velo-
cidades de aireaci6n son esenciales para la formaci6n de
espora y toxina (9,lO. 11,12).
Para la producci6n del bioinsecticida a partir de B.
thuringiensis existen varios estudios (Razo, 1990). La
concentraci6n de esporas y 10s tiempos de fermentaci6n
9
a nivel de fermentador, varian de 1 . 0 8 ~ 10 a 1 . 2 ~ 10
1 d
esp./ml. y de 24 a 50 horas de fermentaci6n, respectiva-
mente. (5)
En nuestro grupo durante 10s tres afios pasados se
ha realizado investigaci6n bhsica de microbiologia y
genktica de una cepa de Bacillus thuringiensis producto-
ra de una toxina que actua contra las larvas del gusano
cogollero del maiz (Spodoptera frugiperda), el cual
ocasionacuantiosas pkrdidas econ6micas en la agricultu-
ra mexicana. El conocimiento generado hasta la fecha
pennite plantear el desarrollo de un proyecto de optimi-
zaci6n de condiciones de producci6n del bioinsecticidaa
nivel de plantapiloto, cuyo objetivo principal es estable-
cer las condiciones de cultivo, reglas de escalamiento,
desarrollo de las etapas primarias de purificaci6n y
dosificaci6n del bioinsecticida.
Optimizaci6n del medio de cultivo y determina-
ci6n de las condiciones 6ptimas de fermentaci6n.
Universidad: Ciencia y Tecnologia Vol. 2. No. 3, Diciembre de 1992
ORGANISM0 Y MEDIO DE CULTIVO: celu-
las de Bacillus thuringiensis var. Aisawai. Para lapreser-
vaci6n de la cepa, esta se siembra por estria aproximada-
mente cada 2 meses en medio LB, a 29 'C por 48 horas.
Se inocula con una asada, un matraz erlenmeyer de 500
ml con 100 ml de medio a29 "C y 200 rpm por 12 horas,
usandose el 10% de in6culo en 10s pasos siguientes.
A) FERMENTACIONES A NIVEL MATRAZ
DE 500 mL. Se llevaron a cab0 fermentaciones bajo las
siguientes condiciones de cultivo: temperatura a 29 "C,
agitaci6n 200 RPM, y pH de 7.2-7.3 con un vol6men de
operaci6n de 100 mL. Se hicieron cineticas de crecimien-
to, tomando muestras a diferentes intervalos de tiempo y
se midieron 10s siguientes parhmetros: Densidad 6ptica
( 590 nm), pH, muestras a1 microsc6pio tefiidas con
cristal violeta para la observaci6n de cklulas vegetativas,
esporas y cristal.
B) FERMENTACIONES A NIVEL DE FER-
MENTADOR DE 2 L. Las fermentaciones se llevaron a
cab0 en un fermentador de 2 L, marca New Brunswick
Scientific (NBS) modelo Multigen. Las condiciones de
cultivo heron las siguientes: temperatura de 29 C, agita-
ci6n 800 RPM, con 2 impulsores Rushton, aireaci6n de
1 VVM, control de pH entre 7.0 y 7.5 durante todo el
crecimiento con KOH y H3PO4. Se hicieron cinCticas del
crecimiento, tomando muestras a diferentes tiempos y
midiendo 10s siguientes parhmetros: Densidad 6ptica
(590 nm), pH, Oxigeno disuelto, mL residuales de KOH
y H3P04 1 N, y observaci6n a1 microsc6pio de muestras
tefiidas con cristal violeta para ver la formaci6n del
cristal, conteo de esporas y cblulas vegetativas con la
camara de Neubauer.
C) FERMENTACIONES A NIVEL FERMEN-
TADOR DE 14 L. Para este nivel se desarrollaron 10s
experimentos en un fermentador marca NBS, modelo
MF14 con 3 impulsores de 6 paletas Tipo Rushton (Fig.
A). Las condiciones de cultivo heron las siguientes:
Temperatura 29 " C, agitaci6n 400 y 600 RPM, aireaci6n
0.8 y 1.2 VVM y pH controlado a 7.0 y sin control. Se
llevaron a cab0 cineticas de crecimiento tomando mues-
tras cada dos horas y se midieron 10s siguientes parhme-
tros: Densidad 6ptica, pH, Oxigeno disuelto y conteo de
cClulas vegetativas, esporas y bacilos con la chmara de
Neubauer.
- Para ambas fermentaciones se cuantifica el h-
car residual por el mCtodo del hcido 1,2,3 dinitrosalicili-
co (DNS), Summer et. a1 1935.
-Para realizar la optimizaci6n del medio de cultivo
y condiciones de operaci6n, se plante6 una serie de
3
experimentos por medio de un disefio experimental (2 )
por el metodo de B. Wilson (13), donde se variaron 3
componentes del mismo. Se tom6 como base el medio de
cultivo reportado en la tabla 1, el cual se obtuvo en base
a una revisi6n bibliogrhfica (6, 14, 15, 16) y a las
concentraciones de sales que se requieren para la propa-
gaci6n de la cepa a nivel laboratorio.
Como primer disefio experimental se decidi6 pro-
bar niveles bajos y altos de 10s siguientes nutrientes: *
PurC de tomate 10 y 20 g/L, glucosa 25 y 30 g/L y harina
de soya 10 y 20 g/L.
LaRespuesta (Velocidad de Crecimiento) se tom6
como D.O. a 590 nm considerando solamente la fase
exponencial(l2 horas).
3
Se hizo un segundo disefio experimental 2 en
donde se probaron 3 parhmetros: agitaci6n (400 y 600
RPM), aireaci6n (0.8 y 1.2 VVM) y pH (con control y sin
control).
MEDIO DE CULTIVO BASE.
Componente dl .
KH2P04 6.8
MgS04.7H2 0 0.12
ZnS04. 7H20 0.014
MnS04.H20 0.0016
FeS04.7H20 0.028
CaC12 .4H2 0 0.1 1
Bacto-triptona 7.0
Glucosa 3.0
Ajustar el pH, con KOH 3 N, a 7.2. Los medios se
esterilizan a 121C durante 15 minutos.
RESULTADOS Y DISCUSION.
Para el medio de cultivo base reportado en mate-
riales y mCtodos, el tiempo de crecimiento y producci6n
del cristal era hasta de 56 horas y el rendimiento bajo
durante 1as 48 horas de crecimiento ( 5x10~ espJm1);
biomasa de 1.4 g/L.(peso seco). Ademh la glucosa no
se consume totalmente durante las 56 horas de creci-
miento, por lo que se piensa que hay una asincronia en el
proceso de esporulaci6n, alarghndose.
La optimizaci6n del medio de cultivo y condicio-
nes de operaci6n, se plante6 como se describe en la
secci6n de materiales y mCtodos.
Se probaron niveles altos y bajos de 10s siguientes
nutrientes: Pure de tomate, glucosa y harina de soya. Se
Abarca. C.C., Martinez. I.A. Caro. Caro B.M.. Quintero. R.R Optlmizacidn del proceso de fermentaci6n para producir Bacillus t.
decidi6 dtilizar el pur6 de tomate como sustituto del licor
de maiz, harina de pescado, o extract0 de levadura (son
10s que reporta labibliografiacomo fuente de nitr6geno),
debido a que estos ultimos son dificiles de conseguir yl
o costosos. El pur6 de tomate se consigue fbcil y es de
bajo costo. En cuanto a1 uso de la harina de soya, se
encontr6 en reportes de la Universidad de Nuevo Lebn,
que utilizando cepas similares, han encontrado produc-
ciones elevadas de bioinsecticidas.
El medio 6ptimo de producci6n para Bacillus
thuringiensis, f u C el siguiente:
MEDIO BE CULTNO OPTIMO
Componente gll.
Glucosa 5.0
Harina de soya 6.0
Pure de tomate 40
KH2P04 2.5
CaC03 1
MgS04-7H20 0.0001 1
MnS04-H20 0.04
FeS04-7H20 0.028
CaC12-4H20 0.030
Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0. Los medios
se esterilizan a 121C durante 15 minutos.
En la figura 1 se muestra el proceso general de la
producci6n de 1.a delta-endotoxina de Bacillus thurin-
giensis, seguido en esta investigaci6n.
Se obtuvieron 10s siguientes resultados, Tabla 1,
donde se vari6 la agitaci6n7 aireaci6n y el control del pH.
El analisis de 10s resultados nos permite llegar a las
siguientes conclusiones, Tabla 2.
a) Cuando se analizan 10s efectos promedio, se
observa que hay mas significancia sobre la agitaci611, lo
cual nos indica que hay que subir m b 10s RPM. Cuando
se analiza la aireacibn se ve que hay mas significancia
sobre este que en el pH que es el que menor significancia
tiene, segun el efecto promedio.
b) La interaccibn de 2 factores nos dice que hay
mayor significancia entre la agitaci6n y la aireaci6n. La
agitaci6n y el control de pH tienen poco efecto sobre el
estudio, asi mismo que la aereaci6n y el control de pH.
c) Finalmente; cuando se estudia la interacci6n de
3 factores , se alcanza a notar que la combinaci6n de 10s
3 padmetros no tienen muchasignificancia entre si sobre
el estudio realizado.
t D= 21.5
Acot., an cm
Caracteristicas geometricas del fermentador de 14 L
-
Proceso general de la Gendotoxina de Badus
thuringiensis.
Inocular con varias asadas proveniente de cultivo
en caja, un matraz fernbach con un litro de medio,
incubar a 29 "C y 200 rpm por 12 horas.
Analisis
CinCticas de crecimiento.
pH, Oxigeno disuelto, Oxigeno y
Bibxido de carbon0 gaseosos.
Densidad 6ptica a 590 nrn.
Cantidad de Azlicar.
Cantidad de esporas y cklulas vegetativas.
Titulo del cristal observando muestras a1 micros-
c6pio teiiidas con cristal violeta.
Transferir el in6culo a la jarra de 14 L. con 1 L. de
in6culo mas 9 L. de medio, a 29 C, 1 vvrn, 800 rpm y
controlando el pH arriba de 7.0 durante 24 horas.
Centrifugar el caldo fermentado en una centrifuga
de rotor s6lid0, utilizando un flujo de 36 Llh.
Secar la suspensi6n en un secador por aspersibn.
Universidad: Ciencia y Tecnologla Vol. 2. No. 3. Diciembre de 1992
Tabla 1 Tabla 3
- ~ ---- - - - ~
Exp. Agitaci6n
1 400
2 400
3 400
4 400
5 600
6 600
7 600
8 600
--
Aireac. pH CIS cont.
1.2 C/C
0.8 SIC
0.8 CIC
1.2 SIC
0.8 SIC
1.2 SIC
0.8 C/C
1.2 C/C
*Respuesta: esporaslrnl a las 24 hrs. de fermentaci6n.
En esta tabla sepuede ver que se tienen mejores resultados cuando
se trabaja a 600 rpm.
Tabla 2
ANALISIS DE RESULTADOS
Efectos Interacci6n de Interacci6n de
promedio 2 factores. 3 factores.
El = Velocidad de agitaci6n.
E;?= Velocidad de aireacidn.
E3 = pH contrl sin control.
Efectos promedio: Efecto que se tiene sobre la variable
de lo que se este midiendo.
Interacci6n de Es la combinacidn que existe
2 factores: entre dos variables.
Interacci6n de Es la combinacidn entre las
3 factores: variables.
Se llevaron a cab0 fermentaciones a 700 y 800
RPM seg6n 10s resultados del disefio experimental. Se
tom6 1 W M como punto intermedio entre 0.8 y 1.2
VVM. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Con base en estos resultados, se decidi6 ajustar las
condiciones de agitaci6n y de pH inicial, Tabla 3.
Exper. RPM pH Veloc. de Crec. Esporas (Esp.11~1)
P (h-l).
a las 24 Hr. de
fermentaci6n.
1 700 7 0.17 4.6x109
Se observa que cuando se trabaja a pH 7 se obtie-
nen velocidades de crecimiento mayores que a pH 8.
Tambien se nota que a 800 RPM, 1 VVM y pH 7, se
tienen concentraciones mayores de esporas alas 24 horas
de fermentaci6n (6x10') respecto a la agitaci6n de 700
RPM (Figura 2).
Figura. 2. Crecimiento de Bacillus thuringiensis en
fermentador de 1 4 L. a 800 RPM, 1 VVM y pH
9
7.0., con una concentraci6n de 6 x 10 ESPImL.
En la figura 2 se puede ver el comportamiento de
10s diversos padmetros cinkticos para la producci6n de
Bacillus thuringiensis. En la cual se ve que la Densidad
6ptica tiene una fase exponencial de aproximadamente 8
horas, la glucosa se consume en 10 horas, el comporta-
miento del pH se mantiene en 7 durante 5 horas aproxi-
madamente y posteriormente tiende a subir, con respecto
a1 Oxigeno disuelto, se observa que la saturaci6n no llega
a ser menor del70%. En cuanto a 10s bacilos y esporas,
se ve que el comportamiento en el primer0 es aumentar
y posteriormente disminuir su concentraci611, y en las
esporas suben gradualmente. Este comportamiento es
similar para las fermentaciones que se llevaron a cab0 en
este trabajo.
Abarca, C.C., Martinez. ].A. Caro, Caro B.M.. Quintero, R.R Optimizaci6n del proceso de fermentaci6n para producir Bacillus t.
El analisis de resultados de estos experimentos
indica lo siguiente (tabla 4):
a) Seg6n el efecto promedio; se observa que es
importante usar una agitaci6n alta para la producci6n de
B. thuringiensis. Tambibn se nota que el control de pH a
7 favorece la producci6n de espora.
b) Cuando se analiza la interacci6n de 2 factores;
se ve que la interacci6n entre el pH yla velocidad de
agitaci6n no es significativa.
De acuerdo con lo que el diseiio experimental nos
muestra como condiciones bptimas, se repitieron 10
fennentaciones las cuales nos dan una producci6n de
9
esporas 5.5 x 10 esplml. *lo% y una biomasa de 24 g/
L (peso seco).
Estos resultados se resumen en la tabla 4.
Tabla 4
Efectos Promedio Interacci6n de 2 factores
El = 0. 75~10
9
Los resultados del aniilisis del diseiio experimen-
tal, demostraron que las condiciones 6ptimas para la
producci6n de B. thuringiensis a nivel fermentador de 14
L son: 800 rpm de velocidad de agitacidn, 1 VVM de
aireaci6n y control de pH igual o mayor a 7, con un
5
aumento en la producci6n de espodml de 5x10 a
5 . 5 ~ 1 0 ~ * lo%, biomasa de 1.4 a 24 g/L (peso seco), en
tiempos de fermentaci6n de 48 y 24 horas de ferrnenta-
ci6n respectivamente. Lo cual en algunos casos rebasa a
lo reportado en la literatura y en menor tiempo de
fermentaci6n.
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