UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD TECNOLGICA
DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS
INGENIERA DE ALIMENTOS
LABORATORIO INGENIERA DE BIOPROCESOS










INFORME N 01
CRECIMIENTO CELULAR
Luis Corts A., Lisette Plaza P., Loreto Fabiani M.
Profesor: Sergio Aguilera Moya
Ayudante: Luis Lpez Matus


Pauta de evaluacin informes
ITEMS PTJE MAXIMO PTJE ASIGNADO
PORTADA 0,5
INTRODUCCION 1
OBJETIVOS 0,5
RESULTADOS 1
DISCUSIONES 2,5
CONCLUSIONES 1
REFERENCIA 0,5

23 de Diciembre 2011
INTRODUCCIN
En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las
estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Cuando se siembran
microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a
dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo
para "fabricar" nuevos microorganismos. (Pumarola, 1999)
Sin embargo el crecimiento est normalmente limitado por el agotamiento de
nutrientes o por la acumulacin de productos del mismo metabolismo microbiano,
que les son txicos a la poblacin. La consecuencia es que el crecimiento al cabo
de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse.
Por lo general se puede medir el crecimiento de las bacterias, calculando el
aumento numrico y teniendo en cuenta, por lo tanto, la magnitud de sus
poblaciones. Para ello existen distintos mtodos los cuales se pueden clasificar en
directos e indirectos. Los mtodos directos permiten una estimacin aproximada
del nmero de bacterias mientras que los indirectos son empleados para
determinaciones de masas celulares. (Pumarola, 1999)
El crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo lquido es claramente
exponencial, y la determinacin de este crecimiento cuantitativo se puede
representar mediante una curva en la que se distinguen distintas fases o perodos.
En este caso se utiliz La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo
ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la
industria panadera y vitivincola, as como por su capacidad de producir etanol.
Este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es
cultivado en medios lquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la
fase logartmica, el cambio diuxico, la fase postdiuxica y la fase estacionaria.
(Folch-Mallol y col, 2004).


OBJETIVOS

Objetivo general

Monitorear el crecimiento de un cultivo de levadura (Sccharomyces
cerevisiae) en un medio de laboratorio por medio del uso de mtodos
directos e indirectos.

Objetivos especficos

Construir y caracterizar la curva de crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae EC-1118, utilizando los datos obtenidos en el recuento celular.

Determinar la viabilidad (%) del cultivo durante su crecimiento, mediante el
recuento celular en cmara de Nuebahuer, determinado la cantidad de
clulas vivas y muertas con uso de azul de metileno (tincin).

Relacionar el consumo de sustrato y absorbancia v/s tiempo con la curva de
crecimiento del microorganismo obtenido del recuento celular en cmara de
Neubahuer.

Determinar el rendimiento de Glucosa en el medio de cultivo con
concentraciones iniciales y finales del microorganismo en la fase
exponencial de la curva de crecimiento.






RESULTADOS
Cmara de Neubahuer:
Concentracin celular, construccin y caracterizacin curva de crecimiento:
Tabla 1: Datos recuento celular cmara de Neubahuer y promedio clulas.
Muestra Tiempo
(h)
Factor de
Dilucin
(FD)
Clulas
azules
(muertas)
Clulas
blancas
(vivas)
Clulas
totales
Promedio
clulas

1 0 2 2 16 18 2
3 4 2 3 29 32 3,56
5 8 10 25 209 234 26
6 12 10 13 167 180 20
7 16 10 18 270 288 32
9 24 10 23 348 371 41,2
* Tener en consideracin que se contaron 9 cuadrculas de la cmara, por lo que el promedio ser:
x= [cel totales/9].
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Para clculo Concentracin celular (Clulas/mL), se utilizar la siguiente ecuacin,
con resultados en tabla 2, y con obtencin grfico 1:

Ecuacin 1
Donde:
C: Concentracin celular (clulas/mL).
(X): Promedio de clulas contadas en la cmara Neubahuer.
FD: Factor de dilucin utilizado.
Tabla 2: Resultados concentracin celular obtenida desde la cmara de
Neubahuer a diferentes tiempos.
Muestra Tiempo
(hr)
Promedio
clulas

Factor de Dilucin
(FD)
Concentracin celular
(cl/mL)
1 0 2 2 1,02E+06
3 4 3,56 2 1,81E+06
5 8 26 10 6,60E+07
6 12 20 10 5,08E+07
7 16 32 10 8,13E+07
9 24 41,2 10 1,05E+08

Grafico N1: Relacin Concentracin celular/tiempo para un cultivo de
Saccharomyces cerevisiae EC-1118
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Ahora para calcular u
mx
y t
d
debemos transformar los resultados de concentracin
celular a logaritmo natural (Ln), resultados tabulados en tabla 3, y obtencin
grfico 2 (Crecimiento celular), pero primeramente debemos conocer la ecuacin
para un cultivo por lote (Batch), usando el modelo biolgico.

Ecuacin 2

Tabla 3: Resultados Logaritmo natural concentracin celular [Cl./mL].
Muestra Tiempo
(hr)
Promedio
clulas

Factor de
Dilucin
(FD)
Concentracin
celular
(cl/mL)
Ln[Cl/mL]
1 0 2 2 1,02E+06 13,84
3 4 3,56 2 1,81E+06 14,41
5 8 26 10 6,60E+07 18,01
6 12 20 10 5,08E+07 17,74
7 16 32 10 8,13E+07 18,21
9 24 41,2 10 1,05E+08 18,47
Fuente: Elaboracin propia, 2011.

Grafico N2: Relacin Ln[Concentracin celular]/tiempo para un cultivo de
Saccharomyces cerevisiae EC-1118 (Crecimiento celular)
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Para obtener parmetros ms ajustables a la fase exponencial de la curva de
crecimiento se tomaran los tiempos desde 4 hasta las 16 horas, eliminndose
dentro del rango, el tiempo 8 [h]. Todo tabulado en tabla 4, y con ello, obtencin de
grfico 3:
Tabla 4: Resultados Logaritmo natural concentracin celular [Cl./mL] zona
exponencial
Muestra Tiempo
(hr)
Promedio
clulas

Factor de
Dilucin
(FD)
Concentracin
celular
(cl/mL)
Ln[Cl/mL]
3 4 3,56 2 1,81E+06 14,41
6 12 20 10 5,08E+07 17,74
7 16 32 10 8,13E+07 18,21
Fuente: Elaboracin propia, 2011.

Grafico N3: Relacin Ln[Concentracin celular]/tiempo para un cultivo de
Saccharomyces cerevisiae EC-1118
Al obtener la grfica 3, se puedo obtener una ecuacin lineal que representa a la
zona exponencial, correspondiente a la siguiente ecuacin, con un R
2
= 0,9525:

Ecuacin 3
Ahora usando ecuacin 2 y 3, obtenemos lo siguiente:


Donde:
Ln [Xf] = y Ln [Xo] = 13,257 t = X = 0,3309

Por lo tanto, nuestro correspondiente a nuestro organismo en este medio
especficamente Comportamiento (representando en la zona exponencial:
mx., para un cultivo Batch) es igual a 0,3309 [h
-1
].
Ahora, si bien conocemos la velocidad de crecimiento del microorganismo en este
medio de cultivo, podemos determinar el tiempo de duplicacin, debido a que
sabemos, que corresponde al tiempo en que el microorganismo se duplica, es
decir, si inicialmente se tena X, al tiempo de duplicacin obtendremos 2X, con
esto, obtenemos la ecuacin 4, con uso de ecuacin 2 (modelo biolgico):

Ecuacin 4
Con ecuacin 4, y resultado de obtencin de velocidad del microorganismo en el
medio, podemos finalmente calcular el tiempo de duplicacin:

Viabilidad Celular:
Tabla 5: Datos recuento celular cmara de Neubahuer.
Muestra Tiempo
(hr)
Clulas
azules
(muertas)
Clulas
blancas
(vivas)
Clulas
totales
1 0 2 16 18
3 4 3 29 32
5 8 25 209 234
6 12 13 167 180
7 16 18 270 288
9 24 23 348 371
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
El porcentaje de viabilidad de calcula con la siguiente ecuacin, cuyos resultados
se encuentran tabla 6:




Ecuacin 5


Taba 6: Porcentaje de viabilidad medio de cultivo a diferentes tiempos.
Muestra Tiempo
(hr)
% Viabilidad Celular
1 0 88,89
3 4 90,63
5 8 89,31
6 12 92,78
7 16 93,75
9 24 93,8
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Espectrofotometra:
Dados los valores de absorbancia obtenidos en la experiencia (turbidez: biomasa
formada), se establece una relacin con el tiempo de desarrollo del medio de
cultivo, descrito por tabla 7.
Tabla 7: Valores de Absorbencia obtenida en diferentes tiempos del cultivo a una
longitud de onda de 600 nm.
Muestra Tiempo
(hora)
Absorbancia

Factor de
Dilucin
Absorbancia
corregida
1 0 0,064 -- 0,064
2 2 0,047 -- 0,047
3 4 0,120 -- 0,120
4 6 0,301 -- 0,301
5 8 0,428 -- 0,428
6 12 0,289 2 0,578
7 16 0,320 2 0,640
8 20 1,020 3 3,060
9 24 1,000 3 3,000
10 28 0,919 3,676
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Con los datos obtenidos en tabla 7, podemos observar curva de crecimiento
absorbancia v/s tiempo, como se muestra en Grfico 4:

Grafico N4: Relacin absorbancia/tiempo para un cultivo de Saccharomyces
cerevisiae EC-1118
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Consumo de glucosa:
Para determinar la concentracin de glucosa consumida primero debemos obtener
la glucosa residual que se obtiene al transcurso del tiempo, tabulado en tabla 8:
Tabla 8: Datos Obtenidos Absorbancia a diferentes tiempos de Concentracin
Residual de Glucosa
Tiempo [h] Absorbancia [nm]
0 0,075
6 0,013
16 0,100
28 0,060
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Con los datos de la tabla 8 y la ecuacin 7, se obtiene la concentracin de glucosa
residual, tabulados en tabla 9 y grfico 5:

Ecuacin 7


Tabla 9: Datos de la concentracin de Glucosa residual a diferentes tiempos.
Tiempo [h] Concentracin
[mg/L]
Factor de
Dilucin
[FD]
Concentracin
[g/L]
0 0,017730 1000 17,730
6 0,003073 1000 3,073
16 0,02364 100 2,364
28 0,01418 100 1,418
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Con los datos de la tabla 9 se obtiene el Grfico N5:

Grfico 5: Curva consumo Glucosa Residual a diferentes tiempos.
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Finalmente para clculo, consumo de Glucosa, se utiliz datos de tabla 9, y
ecuacin 8, cuyos resultados estn tabulados en tabla 10 y grfico 6:

Ecuacin 8





Tabla 10: Datos de la concentracin de Glucosa consumida a diferentes tiempos.
Tiempo [h] Concentracin Glucosa
inicial y residual
[g/L]
Concentracin Glucosa
consumida
[g/L]
0 17,730 0
6 3,073 14,66
16 2,364 15,37
28 1,418 16,312
Fuente: Elaboracin propia, 2011.

Grfico 6: Curva consumo Glucosa consumida a diferentes tiempos.
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
Rendimiento Glucosa:
Podemos determinar el rendimiento de Glucosa en el medio, sabiendo que este
parmetro es calculado desde el tiempo 4 a las 16 horas (correspondiente a la
fase exponencial de la curva de crecimiento), correspondiente a la concentracin
inicial y final en el proceso (zona exponencial) de Glucosa, para ello usaremos
datos de tabla 12 y ecuacin 10 (Correspondiente al rendimiento). Pero como no
conocemos la concentracin de glucosa residual a las 4 horas, debemos obtenerlo
de datos de tabla 11 (datos tabla 9: 3 datos y linealizacin con logaritmo natural
para mejor correlacin), y con ello obtencin grfico 7:


Tabla 11: Datos de la concentracin de Glucosa residual necesarias para clculo
concentracin residual a las 4 horas.
Tiempo [h] Concentracin Glucosa
residual
[g/L]
Ln Concentracin
Glucosa consumida
[g/L]
0 17,730 2,88
16 2,364 0,86
28 1,418 0,35
Fuente: Elaboracin propia, 2011.

Grfico 7: Relacin concentracin Glucosa residual v/s tiempo
Fuente: Elaboracin propia.
De Grfico 7, obtenemos ecuacin necesaria (R
2
: 0,9394) para calcular
concentracin residual al tiempo 4 horas en la curva de crecimiento (inicio zona
exponencial)

Ecuacin 9

7
Donde y calculado corresponde a Ln (Concentracin Glucosa) a tiempo 4 horas,
para obtencin concentracin extraer logaritmo natural.

/*e
10,43 [g/L]
Finalmente, con el dato anterior obtenido, correspondiente a la glucosa residual en
proceso a las 4 (horas) zona exponencial determinamos rendimiento:
Tabla 12: Datos de glucosa y concentracin celular (inicial y final: fase
exponencial)
Tiempo [h] Concentracin
Glucosa [g/L]
Concentracin
celular [cel/mL]
Concentracin
celular [cel/L]
4 10,43 1,81x10
6
1810
16 2,364 8,13x10
7
81300
Fuente: Elaboracin propia, 2011.
0
S S
X X
Y
f
i f
s
x

Ecuacin 10
Donde
: Rendimiento
f
X : Clulas finales (clulas/L)
o
X : Clulas iniciales (clulas/L)
f
S : Sustrato final (mg/L)
0
S : Sustrato inicial (mg/L)

] / [ 43 , 10 / 364 , 2
1810 / 81300
L g L g
celL L cel
Y
s
x

a Glu de g Clulas Y
s
x
cos / 95 , 9854





DISCUSIONES
Comparacin grficos: concentracin celular vs tiempo , absorbancia vs tiempo y
Concentracin de glucosa v/s tiempo: En estos grficos (1 y 4) se puede observar
que las curvas presentan un comportamiento similar, sin embargo existe una
diferencia en cuanto al tiempo, ya que en el caso de la concentracin celular
comienza a aumentar desde las 4 horas y en el caso de la absorbancia, sta
comenz a aumentar a las 16 horas, esto pudo deberse a que ocurrieron una serie
de errores durante el procedimiento de medicin de absorbancia por la mala
introduccin de la cubeta en espectrofotmetro, mala manipulacin del blanco y
adems se debe considerar que son diferentes mtodos. Tambin, para el caso de
absorbancia v/s tiempo, como se trat de un mtodo basado en la turbidez del
medio pudo afectar errores en la absorbancia el medio (YPD), ya que pudo
presentar caractersticas de longitud de onda similares al del microorganismo
interfiriendo con los resultados y/o posible error en clculos en los factores de
dilucin (mayor dilucin real, que la registrada), provocando un clculo de turbidez
menor habiendo una mayor concentracin y con ello, una menor absorbancia. Y al
observar, grficos 1,4 y 5, se pudo notar un aumento en la concentracin celular y
Absorbancia, y una disminucin de sustrato. Esto, debido a que como el
microorganismo consumi Glucosa para aumentar de tamao y Nitrgeno para
su divisin, la concentracin inicial de glucosa disminuye. Adems, se observa,
una disminucin marcada en la concentracin de glucosa al inicio, puesto que el
organismo no se divide inicialmente, pero si aumenta de tamao, ocupando y
sintetizando la glucosa para la formacin de protenas, especficamente enzimas y
formacin de ARNm para su posterior divisin, y una vez comenzada la fase
exponencial, el microorganismo se divide, disminuyendo con eso, el consumo de
Glucosa, lo que se ve reflejado en el Grfico 6.

Caracterizacin curva de crecimiento celular: Al realizar una comparacin con un
estudio realizado con cultivos en medios diferentes pero con esta misma levadura
se pudo observar que el rango de velocidad de crecimiento va desde
aproximadamente 0,3 0,6 [h-1] (Rubio y col, 2010) y el valor obtenido
experimentalmente fue de 0,3309 [h-1] el cual se encuentra dentro del rango, sin
embargo, se debe tener en cuenta que esta velocidad depende de una serie de
factores tales como: medio de cultivo, tipo de sustrato y del microorganismo, entre
otros. Otro estudio similar se realiz con cultivos en medio YPD de dos cepas
diferentes de esta misma levadura obtenindose a tiempo de incubacin de 10
horas un = 0,3 [h-1] (Valdivieso, 2006). Adems, se obtuvo el tiempo de
duplicacin (2,09 [h]) del microorganismos en este medio de cultivo, el cual nos
proporciona informacin relevante y vital al momento de uso industrial, ya que
gracias a ello, se puede determinar el tiempo necesario para producir una cantidad
especfica de biomasa, y que es caracterstico de cada microorganismo y estar
en funcin de las propiedades iniciales de inoculo (adaptacin, edad, entre otros) y
las cualidades del medio (sustrato, contaminacin, agitacin, aeracin, entre
otros).
Viabilidad: Se puede observar que la viabilidad para cada una de las muestras fue
aumentando, siendo sta bastante alta, debido posiblemente a que el cultivo de
levaduras utilizadas era fresco, adems se le proporcion un medio rico (YPD), lo
que permiti que dichas levaduras pudieran desarrollarse de manera eficiente.

Rendimiento: El rendimiento obtenido fue de 9854,95 [cel/mg glucosa]. De
acuerdo al grfico 5, se observa que el consumo de glucosa fue rpido en primera
instancia y luego se mantuvo constante, esto debido a que el microorganismo se
encontraba adaptado al medio lo que explica que fuese tan rpido, haciendo notar
que el cultivo de levaduras era fresco y viable. En estas condiciones el
microorganismo requiere de nutrientes para su desarrollo, tales como carbono
utilizado por el microorganismo para crecer y nitrgeno utilizado para la divisin
celular. Por lo tanto se produce la sntesis de ARNm y la consecuente generacin
de biomasa.



CONCLUSIONES

Se confeccion curva de crecimiento celular para Saccharomyces
cerevisiae EC-1118 con datos de cmara de Neubahuer.

Se determin fase exponencial de la curva de crecimiento y con ello, la
velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicacin.

Se clculo la viabilidad de los microorganismo en forma porcentual con uso
de cmara de Nuebahuer y azul de metileno.

Se determin el comportamiento del consumo de sustrato (Glucosa)
durante el tiempo de desarrollo del medio de cultivo. Adems, de
proporcionar informacin del rendimiento de Glucosa en el cultivo.

Se confeccion curva Absorbancia v/s tiempo y su comparacin, tanto con
la curva de crecimiento celular como el consumo de sustrato en el tiempo.











BIBLIOGRAFIA
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F., Tnez I., Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin
colorimtrica de biomolculas, Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular, Facultad de Medicina, Campus Universitario de Rabanales,
Crdoba.

Ana Rubio, Mara Hernndez. Identificacin preliminar in vitro de
propiedades probiticas en cepas de S. cerevisiae. Pontificia Universidad
Javeriana. Facultad de Ciencias. Lab. de Biotecnologa Aplicada. Bogot,
Colombia. Aceptado: Enero 10 de 2008

Agustin Pumarola., Microbiologa y parasitologa mdica (1999). Masson
S.A. pg. 62-63.

Fernndez E., Galvn A., Tne I., Determinaciones colorimtricas
especficas de compuestos: determinacin de glucosa (mtodo glucosa-
oxidas). Determinacin de nitrito (mtodo de la sulfanilamida: N-NEDA).

Giraldo G., Loango N., Mejia C., (2010): Laboratorio de bioqumica: una
visin prctica, Facultad de Ciencias Bsicas y Tecnologas, Facultad de
Ciencias Agroindustriales, Universidad de Quindio.
Jorge Luis Folch-Mallol, Adriana Garay-Arroyo, Fernando Lledas, Alejandra
A. Covarrubias Robles. Respuesta a estrs en la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Revista Latinoamericana de Microbiologa, Vol. 46, No. 1-2.
Enero - Marzo (2004)

Magdalena Valdivieso Ugarte. Obtencin y caracterizacin de cepas S.
cerevisiae superproductoras de glutatin (2006). Dpto de biologa,
Universidad de Granada. Pag 123.

Pierce Genetica: Un Enfoque Conceptual (2010). Editorial Mdica
Panamericana. Pg. 201-202.

Quesada Mora S., (2007). Manual de experimentos de laboratorio para
Bioqumica, Universidad Estatal a Distancia, San Jos, Costa Rica.

ANEXO
Definir medio rico, medio mnimo, medio complejo
Un medio rico es aquel medio con todos los tipos de requerimientos nutritivos
(fuente de carbono, nitrgeno, fsforo, azufre, sales minerales y factores de
crecimiento) que permiten el crecimiento de la mayora de microorganismos
hetertrofos.
Los medios mnimos son medios definidos que nicamente le proporcionan al
microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse
ptimamente. Se trata de un medio que slo contiene compuestos inorgnicos
con la adicin de una fuente de carbono orgnica.
Un medio complejo es aqul del cual no se conoce su composicin exacta. A
menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras,
extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se
desconoce la composicin qumica exacta. Estos medios son muy utilizados para
cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy
complejos (Pierce, 2010).

Coeficiente extincin Glucosa
El coeficiente de extincin molar, es una constante para cada sustancia (Quesada
Mora S., 2010). Considerando el coeficiente de extincin se puede realizar la
determinacin de la glucosa (inicial y final) usando la ley de Lambert y Beer. Sus
unidades estn determinadas por las unidades de concentracin con que se
trabaje y las unidades de espesor de la disolucin en la cubeta o celda. Se
expresa en cm (Giraldo G., Loango N., Mejia C., 2010). La ley de Lambert y Beer,
expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda
fija) y concentracin de un cromforo en solucin. Adems, de que el coeficiente
de extincin es una constante y que es especfica de cada cromforo. La
representacin de Lambert-Beer, A = cl, nos permitir calcular el valor del
coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta
(Concentracin molar cromforo v/s Absorbancia) (Abril N., Brcena J., Fernndez
E., Galvn A., Jorrn J., Peinado J., Toribio F., Tnez I.). La determinacin de
glucosa (mtodo glucosa - oxidasa) est basado en: La glucosa oxidasa oxida a la
glucosa originando cido glucnico y H
2
O
2
. El perxido de hidrgeno liberado
reacciona con un cromgeno (fenol/4-aminoantipirina) por la reaccin de Trinder,
para dar una quinona que absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color
producida es directamente proporcional a la concentracin de glucosa (Fernndez
E., Galvn A., Tne I.). Por lo que podemos inferir, que segn revisin
bibliogrfica, el coeficiente de extincin depende de la longitud de onda del equipo,
de la cubeta (espesor: recorrido) y de la concentracin del cromforo, que en este
caso es una quinona, y que es especifico para esta sustancia en esta
condiciones. Adems de ser proporcional a la glucosa, y poder ser obtenida de la
grfica Concentracin cromforo v/s absorbancia. Por lo que es nico,
dependiendo de mtodo, las sustancias a utilizar y las condiciones de trabajo.